鵝膏毒肽檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

劉潤(rùn)卿,孫潔芳，牛宇敏，單文寵,3，邵 兵*

(1.首都醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100069；2.北京市疾病預(yù)防控制中心 食物中毒診斷溯源技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100013；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類(lèi)健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100193)

毒蘑菇中毒是最常見(jiàn)的食物中毒之一，也是食物中毒致死的最主要原因[1]。一直以來(lái)，全球范圍內(nèi)毒蘑菇中毒事件頻發(fā)。1999年～2016年發(fā)生在美國(guó)的蘑菇接觸病例共有133 700例[2]。意大利[3]、瑞士[4]、愛(ài)爾蘭[5]等世界各國(guó)也時(shí)有發(fā)生毒蘑菇中毒事件。我國(guó)的云南、廣西、四川地區(qū)毒蘑菇中毒發(fā)生率也較高，且多發(fā)于夏秋季。2010年～2018年云南省毒蘑菇中毒人數(shù)占同期全部食源性疾病爆發(fā)事件發(fā)病總?cè)藬?shù)30.37%(9 686/31 892)，占總死亡人數(shù)50.00%(225/450)[6]。2012年～2017年江西省毒蘑菇中毒人數(shù)占同期食源性疾病爆發(fā)事件發(fā)病總?cè)藬?shù)13.0%(463/3 565)，占總死亡人數(shù)82.6%(19/23)[7]。毒蘑菇中毒發(fā)生率和病死率高，亞洲中毒患者治療后病死率仍可達(dá)28.4%[8]；發(fā)病快，臨床表現(xiàn)多樣，一些毒蘑菇中毒起病急、進(jìn)展快、預(yù)后較差，因此患者中毒后及時(shí)進(jìn)行毒蘑菇毒素的檢測(cè)，對(duì)患者的治療和預(yù)后至關(guān)重要。隨著科技的發(fā)展，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法不斷推陳出新，新興的檢測(cè)技術(shù)也在蓬勃發(fā)展，為靈敏、精確、高效的毒蘑菇毒素檢測(cè)提供了有力的技術(shù)支持。

1 蘑菇毒素的分類(lèi)及中毒機(jī)理

毒蘑菇種類(lèi)眾多，且與可食用蘑菇不易區(qū)別，多因誤食而中毒。其中，大部分致死性毒蘑菇毒素為鵝膏肽類(lèi)毒素。根據(jù)其氨基酸的組成和結(jié)構(gòu)又分為9種鵝膏毒肽(AMA)、7種鬼筆毒肽和6種毒傘素。鵝膏毒肽是一種雙環(huán)八肽，通過(guò)與啟動(dòng)環(huán)上的組氨酸殘基His1085結(jié)合[9- 10]，專(zhuān)一性抑制真核生物DNA聚合酶Ⅱ活性，導(dǎo)致其無(wú)法進(jìn)行正常轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成，從而誘發(fā)細(xì)胞死亡和肝功能衰竭[11]。鬼筆毒肽是雙環(huán)七肽，毒傘素為單環(huán)七肽，兩者專(zhuān)一性的與細(xì)胞中肌絲蛋白結(jié)合，破壞肌球蛋白與肌絲蛋白正常的聚合-解裂過(guò)程[12]，從而削弱細(xì)胞膜的功能，導(dǎo)致機(jī)體中毒。在致死性鵝膏肽類(lèi)毒素中，致死性最強(qiáng)、含量最高的為α- 和β-鵝膏毒肽，因此對(duì)于毒蘑菇毒素的檢測(cè)主要為針對(duì)鵝膏毒肽的檢測(cè)。

圖1 鵝膏毒肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)(A)及不同種類(lèi)鵝膏毒肽的取代基與半數(shù)致死量(B)Fig.1 Chemical structures of the amatoxin variants(A),and R-group designations for each variant and its median lethal dose(B)

2 檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展

2.1 鵝膏毒肽的色譜及其聯(lián)用技術(shù)進(jìn)展

基于大型儀器的色譜及其聯(lián)用技術(shù)因具有進(jìn)樣量少、靈敏度高、準(zhǔn)確可靠的優(yōu)點(diǎn)而在鵝膏毒肽的檢測(cè)中發(fā)揮了重要作用。但該類(lèi)方法由于樣品前處理復(fù)雜、儀器操作技術(shù)要求高，不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速篩查。

2.1.1 毛細(xì)管電泳檢測(cè)毛細(xì)管電泳(Capillary electrophoresis,CE)檢測(cè)是一類(lèi)以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的液相分離、分析技術(shù)。Brüggemann等[13]首次嘗試用毛細(xì)管區(qū)帶電泳定量患者尿液和毒蘑菇提取物中的α- 和β-鵝膏毒肽。該方法分析需20 min，檢出限為1 μg/mL。Rittgen等[14]建立了一種分離鬼筆環(huán)肽、α-、β- 和γ-鵝膏毒肽的CE方法，優(yōu)化后方法檢出限為13～79 ng/mL。Robinson-Fuentes等[15]建立的CE方法，能夠在7 min內(nèi)測(cè)定尿液中的α- 和β-鵝膏毒肽。分離條件為毛細(xì)管間距75 μm，有效長(zhǎng)度41 cm，總長(zhǎng)度48 cm，25 ℃，20 kV，PDA檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm。該方法的檢出限為1.5 ng/mL，定量下限為5 ng/mL，在5～100 ng/mL范圍內(nèi)具有良好線(xiàn)性和選擇性。

2.1.2 氣相色譜檢測(cè)氣相色譜(Gas chromatography,GC)檢測(cè)是一種分離、分析技術(shù)。通過(guò)用惰性氣體作為流動(dòng)相，使樣品組分在流動(dòng)相和固定相之間瞬間達(dá)到平衡，是一種分析速度快、分離效率高的分離分析方法。Schwarzinger[16]采用熱裂解-氣相色譜/質(zhì)譜對(duì)毒蘑菇毒素進(jìn)行鑒定和分類(lèi)，通過(guò)分析熱解、熱輔助水解和甲基化，建立毒蘑菇的色譜庫(kù)，對(duì)鵝膏毒素的檢出限可達(dá)3.5 ng。

2.1.3 高效液相色譜檢測(cè)高效液相色譜(High performance liquid chromatography,HPLC)檢測(cè)技術(shù)以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，各成分在柱內(nèi)被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。Jehl等[17]研究了一種HPLC測(cè)定人血清、 尿液和胃液中α- 和β-鵝膏毒肽含量的方法。該方法在反相分析柱上進(jìn)行分離，在280 nm紫外檢測(cè)條件下定量檢測(cè)，α- 和β-鵝膏毒肽的檢出限均為10 ng/mL。Abbott等[18]開(kāi)發(fā)出一種HPLC方法檢測(cè)尿液中鵝膏毒肽的含量，為了更精確的定量，通過(guò)同位素內(nèi)標(biāo)法定量α-鵝膏毒肽，其內(nèi)標(biāo)為15N10-α-鵝膏毒肽，而β- 和γ-鵝膏毒肽不使用內(nèi)標(biāo)具有更一致的定量，檢測(cè)樣本的α-、β-、γ-鵝膏毒肽的檢出限分別為0.458、0.930、0.169 ng/mL。Garcia等[19]開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證了一種HPLC紫外二極管陣列(Diode array detector,DAD)和電化學(xué)檢測(cè)的方法，用于定量大鼠肝臟和腎臟中的α-鵝膏毒肽，檢測(cè)步驟簡(jiǎn)單、快速，適用于研究α-鵝膏毒肽的藥代動(dòng)力學(xué)和組織分布。Morel等[20]采用HPLC在294 nm對(duì)蘑菇中的α- 和β-鵝膏毒肽進(jìn)行分析，檢出限分別為20.5、29.1 ng/mL，回收率為83.0%～124.8%。

Li等[21]設(shè)計(jì)了一種分子印跡聚合物(Molecular imprinting polymers,MIPs)作為HPLC固定相，具有識(shí)別和富集α-鵝膏毒肽的作用，通過(guò)HPLC分析檢測(cè)血清中α-鵝膏毒肽的含量，檢出限為3.0 ng/mL，線(xiàn)性范圍為10～500 ng/mL，回收率為88.5%～95.9%。因?yàn)镸IP特異性識(shí)別界面的存在，即使在復(fù)雜的樣品基質(zhì)中也表現(xiàn)出對(duì)目標(biāo)物良好的選擇性。

2.1.4 液相色譜聯(lián)用質(zhì)譜檢測(cè)液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)利用液相色譜作為質(zhì)譜的進(jìn)樣系統(tǒng)，使復(fù)雜的化學(xué)組分得到分離，利用質(zhì)譜作為檢測(cè)器進(jìn)行定量和定性分析，可提高檢測(cè)方法的靈敏度。

Li等[22]開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證了一種靈敏、經(jīng)濟(jì)的LC-MS/MS法檢測(cè)血清中的α-鵝膏毒肽，檢出限為3.0 ng/mL。Li等[23]使用液相色譜-光電二極管陣列檢測(cè)-離子阱和飛行時(shí)間質(zhì)譜(Liquid chromatography-photodiode array detection-ion trap and time-of-flight mass spectrometry,LC-PDA-IT-TOF-MS)可實(shí)現(xiàn)同一樣品中多種鵝膏毒肽的準(zhǔn)確識(shí)別檢測(cè)，該研究對(duì)毒素的裂解途徑和特征片段離子進(jìn)行深入研究，獲得了更好的檢測(cè)效果。

Wang等[24]建立了一種應(yīng)用固相萃取柱處理樣品，測(cè)定蘑菇樣品中蘑菇毒素(包括α-、β-、γ-鵝膏毒肽等)的LC-MS方法，檢出限可達(dá)0.07 mg/kg。Xu等[25]應(yīng)用在線(xiàn)固相萃取/高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(Solid phase extraction/high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry,SPE/LC-MS/MS)建立了超痕量α- 和β-鵝膏毒肽的分析方法，檢出限均為0.02 ng/mL，線(xiàn)性范圍為0.05～20 ng/mL。Zhang等[26]利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)聯(lián)合固相萃取柱PRiME HLB洗脫平臺(tái)，簡(jiǎn)單、高通量地分析血漿、血清和尿液中3種鵝膏毒肽(α-、β-、γ-鵝膏毒肽)含量，實(shí)現(xiàn)了血漿中3種鵝膏毒肽低至0.5 ng/g的檢測(cè)。

Tan等[27]設(shè)計(jì)了一種基于β-環(huán)糊精協(xié)同MIP識(shí)別的固定相，應(yīng)用UPLC-MS/MS方法實(shí)現(xiàn)血清、尿液以及肝臟中α-、β- 和γ-鵝膏毒肽的同時(shí)檢測(cè)，在尿液、血清、肝臟中的檢出限分別為0.16～0.33 ng/mL，0.34～0.42 ng/mL和0.035～0.056 ng/kg，分析速度縮短至8 min。

Xu等[28]制備了一種新的反相/苯基硼酸型混合模式磁固相萃取(Magnetic solid-phase extraction,MSPE)吸附劑用于UPLC-MS/MS法檢測(cè)鵝膏毒肽(見(jiàn)圖2)。該方法的基質(zhì)效應(yīng)較低，靈敏度高，檢出限低(0.3 μg/kg)，從稱(chēng)重、富集、純化到檢測(cè)，在20 min內(nèi)即可完成一次樣品的檢測(cè)。該研究研制出一種吸附蘑菇等樣品中鵝膏毒素的MSPE材料，用硅烷化的POSS對(duì)氯甲基化微球(Fe3O4@SiO2)和磁性微球進(jìn)行改性，將3-苯氧基苯甲醛和4-甲?；郊姿崤悸?lián)，制備了RP/PBA復(fù)合型磁性微球(Fe3O4@SiO2@POSS@POB@PBA)，使設(shè)計(jì)的吸附劑表面與目標(biāo)物的結(jié)構(gòu)相匹配。該吸附劑具有較大的吸附容量和良好的目標(biāo)選擇性，在使用過(guò)程及使用后很容易通過(guò)磁分離，樣品前處理過(guò)程簡(jiǎn)單、快速、高效，并有效地降低了LC-MS/MS測(cè)定中的基質(zhì)影響。

圖2 特異性識(shí)別捕獲鵝膏毒肽的分子印跡材料構(gòu)建(A);磁性Fe3O4@SiO2@POSS@POB@PBA微球吸附劑特異性回收基質(zhì)中鵝膏肽毒素及其后續(xù)與UPLC-MS/MS的聯(lián)用檢測(cè)示意圖(B)[28]Fig.2 Construction of molecularly imprinted materials that specifically identify amatoxin(A);schematic diagram of magnetic Fe3O4@SiO2@POSS@POB@PBA microsphere adsorbent specific recovery for amatoxin in matrix and its subsequent detection combined with UPLC-MS/MS(B)[28]

2.2 鵝膏毒肽的快速檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展

2.2.1 基于鵝膏毒肽理化性質(zhì)的快速檢測(cè)鵝膏毒肽基于理化性質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)主要有顯色反應(yīng)、吸收光譜檢測(cè)和熒光檢測(cè)。這些方法通過(guò)一定的化學(xué)衍生手段實(shí)現(xiàn)鵝膏毒肽光譜性質(zhì)的變化，具有簡(jiǎn)單、快捷的優(yōu)勢(shì)，但靈敏度低、特異性差，通常需與其他技術(shù)聯(lián)用。Wieland等[29]發(fā)展了一種簡(jiǎn)單顯色檢測(cè)方法，將鮮蘑菇汁液印跡在紙上，干透后滴加濃鹽酸，如含有鵝膏毒肽毒素則10 min內(nèi)顯藍(lán)色。雖然操作簡(jiǎn)單，但靈敏度低，定量困難，僅可能適用于野外采集蘑菇的初步鑒定。 Vlaskin等[30]研究了一種基于熒光光譜快速檢測(cè)鵝膏毒肽的方法，通過(guò)將鵝膏毒肽加入溴化乙啶后會(huì)產(chǎn)生新的熒光波段,從而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。

紙層析和薄層層析(Thin layer chromatography,TLC)技術(shù)通過(guò)不同溶質(zhì)與固定相和流動(dòng)相之間作用力的差別，實(shí)現(xiàn)了不同物質(zhì)在固定相上的分離。Wieland等[31]首次利用紙層析技術(shù)分離檢測(cè)毒素，層析結(jié)果采用1%的肉桂醛在濃鹽酸氣體中變色的顯色反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。Sullivan等[32]最先采用薄層層析法分離檢測(cè)α-、β- 和γ-鵝膏毒肽。Stijve等[33]建立了一種快速、靈敏、高效的薄層色譜法測(cè)定鵝膏粗提取物中α-、β- 和γ-鵝膏毒肽含量，每種鵝膏毒肽的檢出限為50 ng。

2.2.2 基于免疫識(shí)別的快速檢測(cè)免疫識(shí)別檢測(cè)利用抗原抗體特異性識(shí)別對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行檢測(cè)，具有特異性好、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，但易有交叉反應(yīng)存在，也需考慮假陽(yáng)性情況。放射免疫檢測(cè)法(Radioimmunoassay,RIA)是利用放射性核素的測(cè)量方法與免疫反應(yīng)的基本原理相結(jié)合的一種放射性核素體外檢測(cè)法。Faulstich等[34]將鵝膏毒肽的衍生物與胎球蛋白結(jié)合作為兔抗原，具有較低的毒性和較高的免疫原性，所獲得的抗體與其他鵝膏毒肽不產(chǎn)生交叉反應(yīng)。RIA提取純化的IgG結(jié)合在活化的尼龍表面，同時(shí)共價(jià)偶聯(lián)氚化的鵝膏毒肽免疫球蛋白進(jìn)行免疫檢測(cè)，以用于生物基質(zhì)中目標(biāo)物的檢測(cè)，檢出限為3 ng/mL。RIA具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、精確度佳等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也具有價(jià)格昂貴、放射性核素對(duì)人體存在潛在危害性等缺點(diǎn)。

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)技術(shù)具有靈敏度高、特異性好、簡(jiǎn)單快捷等優(yōu)點(diǎn)。Abuknesha等[35]在綿羊體內(nèi)制備β-鵝膏毒肽多克隆抗血清，構(gòu)建了間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay,ic-ELISA)測(cè)定人血清和尿液中的毒素，檢出限為80 pg/mL，與α-鵝膏毒肽的交叉反應(yīng)性為22%。He等[36]研究了一種針對(duì)鵝膏毒肽的廣譜特異性單克隆抗體，鵝膏毒肽蛋白與包衣抗原競(jìng)爭(zhēng)性地與單克隆抗體結(jié)合，該方法對(duì)α-、β- 和γ-鵝膏毒肽的檢出限分別為4.55、4.90、4.45 ng/mL。

Bever等[37]應(yīng)用側(cè)向流動(dòng)免疫分析(Lateral flow immunoassay,LFIA)技術(shù)快速檢測(cè)尿液中的鵝膏毒肽，在10 min內(nèi)即可完成檢測(cè)，且無(wú)需對(duì)尿液進(jìn)行任何預(yù)處理，對(duì)α- 和γ-鵝膏毒肽的檢出限為0.3 ng/mL，β-鵝膏毒肽的檢出限為1 ng/mL。

Zhang等[38]開(kāi)發(fā)了一種快速、簡(jiǎn)單的新型表面等離子體共振(Surface plasmon resonance,SPR)免疫檢測(cè)鵝膏毒肽的方法，構(gòu)建單鏈可變區(qū)(Single-chain variable fragment,scFv)噬菌體抗體庫(kù)，篩選并分離了對(duì)鵝膏毒肽具有高特異性的重組抗體scFv-A4，以該抗體為基礎(chǔ)，所開(kāi)發(fā)的SPR傳感器免疫檢測(cè)的靈敏度為ic-ELISA法的10倍左右，檢出限為0.17 ng/mL。該方法抗體制備簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，可快速提純，提升了免疫分析的靈敏度。

He等[39]同樣基于重組單鏈可變片段抗體scFv-A4，開(kāi)發(fā)了以膠體金作為紅色標(biāo)記的快速免疫層析法(Colloidal gold immunochromatography assay,CG-ICA)，可在10 min內(nèi)完成檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了現(xiàn)場(chǎng)快速半定量測(cè)定蘑菇樣品中的鵝膏毒素。CG-ICA是一種基于競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)原理的快速半定量檢測(cè)方法。樣品中的鵝膏毒素與測(cè)試線(xiàn)上固定的α-鵝膏毒肽-OVA結(jié)合物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合膠體金標(biāo)記的抗體。與傳統(tǒng)的多抗或單抗CG-ICA相比，該方法制備的試紙價(jià)格低廉，重復(fù)性好。

2.2.3 基于特異性基因片段的檢測(cè)技術(shù)Wooszyn等[40]研究了一種基于基因編碼鑒定毒蘑菇中鵝膏毒肽的通用方法提取毒蘑菇中的DNA，再進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增，用于檢測(cè)鵝膏菌屬。He等[41]建立了基于鎖式探針(Padlock probe,PLP)的超支化滾動(dòng)環(huán)擴(kuò)增(Hyperbranched rolling circle amplification,HRCA)技術(shù)，用HRCA等溫法鑒定蘑菇混合物中的致命鵝膏毒肽，靈敏度比傳統(tǒng)PCR法高100倍。HRCA是一種等溫的指數(shù)擴(kuò)增技術(shù)，通過(guò)逐個(gè)引物延伸和鏈置換的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，快速測(cè)定特定的核酸序列。掛鎖探針為大約100個(gè)堿基的單鏈線(xiàn)性寡核苷酸，由兩個(gè)序列組成，與目標(biāo)序列的5'和3'端互補(bǔ)，并由遺傳連接區(qū)連接。當(dāng)與目標(biāo)雜交時(shí)，探針的5'和3'末端并列，并連接形成一個(gè)閉合的環(huán)狀分子。環(huán)狀探針可以在等溫條件下用DNA聚合酶進(jìn)行HRCA指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。所設(shè)計(jì)的聚合酶鏈反應(yīng)能夠識(shí)別所有的α-鵝膏毒肽基因序列，并能產(chǎn)生陽(yáng)性HRCA反應(yīng)，最終加入SYBR Green I誘導(dǎo)熒光產(chǎn)生，令HRCA結(jié)果無(wú)需瓊脂糖凝膠電泳即可直觀(guān)讀出，大大降低了氣溶膠污染的可能性。該方法無(wú)需昂貴的設(shè)備，可直接讀取信號(hào)，從而為條件較差的實(shí)驗(yàn)室和偏遠(yuǎn)地區(qū)的快速篩查提供了一種快速、特異、靈敏且經(jīng)濟(jì)有效的工具。

2.2.4 基于分子印跡傳感器的快速檢測(cè)基于分子印跡傳感器的快速檢測(cè)以MIP實(shí)現(xiàn)的特異性分子間作用力或立體結(jié)構(gòu)作為識(shí)別基礎(chǔ)，搭建各種傳感界面，應(yīng)用不同信號(hào)傳導(dǎo)方式，實(shí)現(xiàn)基質(zhì)中痕量鵝膏毒肽的識(shí)別、富集和檢測(cè)，具有快捷、可視化、高特異性和高靈敏度等特點(diǎn)，以滿(mǎn)足不同情況下的檢測(cè)需求。

Feng等[42]將碳量子點(diǎn)(Carbon quantum dots,CDs)嵌入印跡聚合物制備了特異性識(shí)別的熒光傳感器，用于直接檢測(cè)血清中的α-鵝膏毒肽，方法檢出限低至15 ng/mL。MIP中羧基和吡啶官能團(tuán)可通過(guò)協(xié)同識(shí)別作用提高M(jìn)IP對(duì)α-鵝膏毒肽的識(shí)別、捕獲能力，所制備的熒光傳感器無(wú)需任何預(yù)處理即可選擇性、靈敏地檢測(cè)血清中的目標(biāo)物。

Qiu等[43]建立了一種基于石英晶體微天平分子印跡(QCM-MIP)傳感器用于檢測(cè)生物樣品中的鵝膏毒肽。首次利用烯丙基硫醇在QCM金電極表面附著可聚合的雙鍵，以合成的α-鵝膏毒肽為模板，4-乙烯基吡啶和A-甲基丙烯酸為雙功能單體，在金電極表面沉積MIP涂層。所構(gòu)建的QCM-MIP對(duì)α-鵝膏毒肽具有良好的吸附性能，且重復(fù)性和穩(wěn)定性好，在1.0～50.0 ng/L范圍內(nèi)具有良好的線(xiàn)性響應(yīng)，檢出限可達(dá)0.052 pg/L。

Qiu等[44]將MIP捕獲界面與光子晶體模板相結(jié)合，制備了MIP光子晶體傳感器(MIPC)，可實(shí)現(xiàn)2 min內(nèi)對(duì)食品基質(zhì)和生物基質(zhì)中α-鵝膏毒肽的檢測(cè)，方法具有可視化、重復(fù)性好、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)(圖3)。該工藝以合成的部分α-鵝膏毒肽為模板，二氧化硅膠體光子晶體為載體，甲基丙烯酸(MMA)為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸(EDMAA)為交聯(lián)劑，所合成的MIPC在乙醇溶液中與α-鵝膏毒肽吸附結(jié)合后能夠引發(fā)衍射峰發(fā)生位移，實(shí)現(xiàn)光學(xué)檢測(cè)。所制備的MIPC傳感器線(xiàn)性范圍寬(10-9～10-3mg/L)、檢出限低(5.0×10-10mg/L)、響應(yīng)時(shí)間短(2 min)，在識(shí)別過(guò)程中伴隨著MIPC膜的顏色變化，從而實(shí)現(xiàn)了蘑菇、血清、尿液中靈敏的可視化檢測(cè)。

圖3 特異性識(shí)別捕獲鵝膏毒肽的分子印跡前處理材料的構(gòu)建[21](A);MIP光子晶體傳感器對(duì)食品和生物基質(zhì)中α-鵝膏毒素的可視化檢測(cè)[44]Fig.3 Construction of molecularly imprinted pretreatment materials for specific identification of α-amatoxin(A);visual detection of α-amatoxin in food and biological matries by MIP photonic crystal sensor(B)[44]

表1列出了近年來(lái)對(duì)鵝膏毒肽進(jìn)行檢測(cè)的方法對(duì)比。

表1 近幾年鵝膏毒肽的檢測(cè)方法對(duì)比Table 1 Comparison of detection methods for amatoxin in recent years

3 總結(jié)與展望

鵝膏毒肽作為含量最高、致死性最強(qiáng)的毒蘑菇毒素，其檢測(cè)需求逐漸日?；?、基層化。在實(shí)際臨床應(yīng)用中，受限于實(shí)驗(yàn)室條件、儀器設(shè)備及操作人員的專(zhuān)業(yè)技術(shù)水平，目前已有的檢測(cè)技術(shù)，特別是LC-MS/MS等技術(shù)，無(wú)法很好地滿(mǎn)足基層篩查需求。隨著科技進(jìn)步，檢測(cè)技術(shù)不斷革新，從單一技術(shù)檢測(cè)單一毒素，逐漸發(fā)展為多技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)混合毒素。這過(guò)程中，不斷簡(jiǎn)化前處理方法，提高靈敏度和穩(wěn)定性，縮短檢測(cè)時(shí)間，滿(mǎn)足不同基質(zhì)的檢測(cè)要求，是新興檢測(cè)技術(shù)發(fā)展與創(chuàng)新的動(dòng)力和追求。此外，操作盡量方便簡(jiǎn)捷，也可為基層檢測(cè)的實(shí)用性、準(zhǔn)確性提供保障。因此，在提高儀器檢測(cè)方法靈敏度的同時(shí)，更要關(guān)注快速檢測(cè)方法的創(chuàng)新，開(kāi)發(fā)出更方便、更快捷、更準(zhǔn)確的鵝膏毒肽檢測(cè)方法。