OX40 對(duì)2 型糖尿病患者外周血黏膜相關(guān)恒定T 細(xì)胞的調(diào)亡作用及意義

張梅，陸文敏，鐘國(guó)權(quán)，徐令清，吳永堅(jiān)

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院，廣東 清遠(yuǎn) 511518；2.廣州醫(yī)科大學(xué)廣州婦幼醫(yī)療中心，廣東 廣州 510120）

0 引言

糖尿病患者持續(xù)性的高血糖會(huì)導(dǎo)致自身免疫細(xì)胞含量的改變甚至變異，以往實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，由多種免疫和炎癥性疾病導(dǎo)致免疫穩(wěn)態(tài)失衡的重要因素是T 細(xì)胞功能失常[1,2]，其可能是T 細(xì)胞過度活化釋放了大量炎性細(xì)胞因子并誘導(dǎo)炎性反應(yīng)以及引起自身免疫應(yīng)答，同時(shí)還釋放相應(yīng)的細(xì)胞因子并參與糖尿病進(jìn)展[3-4]。然而，黏膜相關(guān)恒定T 細(xì)胞（mucosal associated invariant T cells，MAIT 細(xì)胞）的作用和機(jī)制依然不清楚。本研究擬探討2 型糖尿病病人（T2DM）MAIT 細(xì)胞上OX40 的表達(dá)水平及OX40 促進(jìn)活化誘導(dǎo)T2DM 中MAIT 細(xì)胞凋亡作用[5,6]，進(jìn)一步討論OX40 對(duì)MAIT 細(xì)胞的免疫調(diào)控在2 型糖尿病發(fā)病中的作用，為靶向OX40+MAIT 細(xì)胞可能是治療T2D的一種有前途的方法提供新的數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2019 年8 月于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院治療的51 例2 型糖尿病患者作為2型糖尿病組（T2DM），其中男27 例，女24 例，年齡22～82 歲，年齡（55.6±9.2）歲；所有T2D 患者臨床表現(xiàn)為高血糖，診斷及分型依據(jù)按照2010年WHO 標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。另取性別和年齡相匹配的標(biāo)準(zhǔn)化OGTT 試驗(yàn)結(jié)果無異常的健康成年志愿者44 名為健康對(duì)照（HC）組，其中男19 例，女25 例，年齡24～76 歲，年齡（54.2±10.3）歲。

1.2 試劑與儀器

細(xì)胞固定液、滲透緩沖液和破膜劑均購自美國(guó)eBioscience 公司，單克隆抗體購自美國(guó)BD 生物科學(xué)、Biolegend 公司。流式細(xì)胞分析采用美國(guó)BD 公司LSRFortessa 型流式細(xì)胞儀。

1.3 檢測(cè)方法

流 式 細(xì) 胞 術(shù) 檢 測(cè)OX40、CD3、TCRVa7.2+、CD45RO、CD8、CD69 和Fas 指標(biāo)的表達(dá)。采用BD 磁珠分離系統(tǒng)分離出TCRVa7.2+細(xì)胞亞群（MAIT 細(xì)胞）；檢測(cè)外周血分離的MAIT 細(xì)胞中caspase-3 的表達(dá)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 24.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料數(shù)據(jù)用（）表示，組間率的比較采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 T2D 病人外周血MAIT 細(xì)胞數(shù)量減少

流式檢測(cè)外周MAIT 細(xì)胞的比例，結(jié)果見表1,T2D組的MAIT 細(xì)胞比例明顯低于HC 組。進(jìn)一步采用流式分析OX40 在MAIT 細(xì)胞的比例，結(jié)果為T2D 組的MAIT 表面OX40 比例明顯高于HC 組，表達(dá)增加，結(jié)果見表1。

表1 OX40 及MAIT 細(xì)胞的比例

2.2 CD45RO、CD69 和Fas 在OX40+組中增加

進(jìn)一步分析OX40 陰性和陽性兩個(gè)亞群在MAIT細(xì)胞中以下指標(biāo)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)OX40-的MAIT 細(xì)胞表面效應(yīng)分子CD45RO 的比例顯著低于OX40+組；在OX40-細(xì)胞中的活化分子CD69 和死亡受體Fas 的平均熒光強(qiáng)度顯著低于OX40+組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見表2。

表2 OX40 在MAIT 細(xì)胞上表達(dá)與活化

2.3 HC 組OX40 和MAIT 細(xì)胞數(shù)量有顯著相關(guān)性

采用SPSS 24.0 軟件分析OX40 表達(dá)與MAIT 細(xì)胞數(shù)量的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，HC 組OX40 和MAIT 細(xì)胞數(shù)量有顯著相關(guān)性(r=-0.53),T2D 患者的呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)（r=-0.61）,差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見圖1。

圖1 OX40 表達(dá)與MAIT 細(xì)胞頻率相關(guān)性分析

2.4 MAIT 細(xì)胞在T2D 疾病中凋亡比例增高

T2D 患者的MAIT 細(xì)胞分裂的caspase-3+比例明顯高于正常對(duì)照組(n=20；與健康對(duì)照組(n=20；6.82±0.606%；P<0.001；圖2A)，提示MAIT 細(xì)胞在T2D 疾病中凋亡比例較高。與OX40-(13.6±0.771)相比，OX40+MAIT 細(xì)胞分裂caspase-3+(22.8±1.41%)明顯增加；P<0.001；圖2B)，說明OX40 參與了T2D 患者M(jìn)AIT 細(xì)胞的凋亡，與其MAIT 細(xì)胞循環(huán)頻率降低密切相關(guān)。

圖2 MAIT 細(xì)胞中裂解 caspase-3 的表達(dá)圖

3 討論

MAIT 細(xì)胞產(chǎn)生于胸腺，是一類進(jìn)化保守的固有樣T 淋巴細(xì)胞,并在胸腺重排其相對(duì)固定的鏈序列，其表型7.2+CDl61+，CD161 表達(dá)有利于MAIT 細(xì)胞趨向外周黏膜組織[7]。T2D 患者外周血中存在著多種不同于健康人群的淋巴細(xì)胞亞群，而其不同的亞群含量變化可以反映患者相應(yīng)的免疫功能狀態(tài)變化，通過分析其含量可以在一定程度上了解患者的免疫狀況[8]。在本研究中，T2D 組的MAIT 細(xì)胞比例低于HC組，MAIT 細(xì)胞可能對(duì)T2D 有保護(hù)作用。OX40 在T 細(xì)胞上具有廣泛的表達(dá)以及調(diào)控功能，是TNFR 超家族成員之一，其共刺激信號(hào)作用巨大，是T 細(xì)胞活化和增殖所不可缺的第二信號(hào)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，在T2D患者的MAIT 細(xì)胞上OX40 的表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組，血糖升高后可能通過促進(jìn)機(jī)體的正性共刺激分子從而影響T 細(xì)胞的免疫應(yīng)答[10]。本研究首次證實(shí)在MAIT 細(xì)胞上表達(dá)，參與T2D 的免疫調(diào)控作用,OX40在人MAIT 細(xì)胞中廣泛表達(dá)，尤其在T2D 患者中顯著。有趣的是，OX40 的表達(dá)與MAIT 細(xì)胞的產(chǎn)生成反比。我們推測(cè)OX40 可能在T2D 患者M(jìn)AIT 細(xì)胞含量的改變中發(fā)揮著重要作用。在T2D 患者中觀察到MAIT 細(xì)胞頻率下降，OX40+細(xì)胞數(shù)量的增加可能與2 型糖尿病的慢性炎癥程度有關(guān)[11]。

研究發(fā)現(xiàn)，在T2D 患者M(jìn)AIT 細(xì)胞上CD45RO OX40+記憶表型含量明顯高于CD45RO OX40-；表面分子CD69 OX40+表型含量明顯高于CD69OX40-、FasOX40+表型明顯含量高于FasOX40-，在兩組人群中的差異明顯[12]。CD45RO+T 細(xì)胞是具有自我更新能力的記憶T 細(xì)胞，可以維持機(jī)體免疫記憶功能以及參與再次免疫應(yīng)答，不但是多能細(xì)胞，而且是T細(xì)胞的重要亞型，在許多疾病(包括糖尿病)的發(fā)生發(fā)展過程中可能起著重要的作用?，F(xiàn)有的研究認(rèn)為，CD45RO+T 細(xì)胞當(dāng)其再次接觸相同的抗原后會(huì)快速活化以及增殖，并釋放Thl 類如IL.2、IL.4 等細(xì)胞因子，加助B 淋巴細(xì)胞合成和分泌IgG 抗體來增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能[13-14]。實(shí)驗(yàn)中T2D 患者的CD45RO OX40+T 細(xì)胞比例明顯增高，提示其在糖尿病的免疫中起著重要作用，其細(xì)胞比例高低與糖尿病病情進(jìn)展有著較密切的關(guān)系。此外，與OX40-MAIT 細(xì)胞相比OX40+MAIT 細(xì)胞群體中存在高度顯著的死亡受體Fas。CD69 和Fas 在OX40+MAIT 細(xì)胞中的平均熒光強(qiáng)度(MFI)明顯高于OX40-MAIT 細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)表明OX40+MAIT 細(xì)胞可能是T2D 患者激活T 細(xì)胞的一個(gè)子集，當(dāng)其被激活可以表達(dá)大量的死亡受體Fas。我們發(fā)現(xiàn)，在T2D 組OX40+MAIT 細(xì)胞表達(dá)的表面Fas 受體和細(xì)胞內(nèi)裂解的caspase-3 水平高于OX40-亞群[15-16]。OX40 與OX40L 重組蛋白激活可誘導(dǎo)MAIT 細(xì)胞凋亡，提示OX40 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡可降低T2D 患者外周血中MAIT 細(xì)胞的頻率。我們發(fā)現(xiàn)OX40 在T2D 患者的MAIT 細(xì)胞中上調(diào)，并通過caspase-3 促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)MAIT 細(xì)胞的比例與其上OX40 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，因此推測(cè)OX40 能通過調(diào)控MAIT 細(xì)胞在抗糖尿病中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)T2D 患者中MAIT 細(xì)胞比例下降，其表面的OX40 分子表達(dá)明顯上調(diào)，其比例與OX40 的表達(dá)呈反比，OX40 通過caspase-3 促進(jìn)MAIT 細(xì)胞凋亡，這些發(fā)現(xiàn)拓寬了我們對(duì)OX40 的認(rèn)識(shí)，我們的研究結(jié)果為T2D 期MAIT 細(xì)胞的活化和調(diào)控提供了新的思路，為靶向OX40+MAIT 細(xì)胞可能是治療T2D 的一種有前途的免疫方法提供了新的數(shù)據(jù)。