NF-κB1 基因啟動(dòng)子-94del/ins ATTG 基因多態(tài)性與特發(fā)性血小板減少性紫癜的關(guān)系

楊占甲，李麗娟

（1 鄭州人民醫(yī)院輸血科，河南450000；2 鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科）

特發(fā)性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura，ITP)是由于機(jī)體產(chǎn)生抗自身血小板抗體而引起血小板減少的自身免疫性疾病[1]，主要以血小板減少、骨髓巨噬細(xì)胞增加為特征[2]。目前臨床治療ITP 的藥物主要是糖皮質(zhì)激素，可緩解臨床癥狀，但部分患者對(duì)藥物不敏感或出現(xiàn)病情復(fù)發(fā)[3]。因此，對(duì)ITP 病因進(jìn)行深入研究，尋找合適的治療方法極為重要。NF-κB1 基因位于人類第4 號(hào)染色體(4q24)，其基因多態(tài)性與多種疾病的易感性相關(guān)[4]。LEWANDER 等[5]研究發(fā)現(xiàn)NF-κB1-94del/ins ATTG多態(tài)性與腸癌易感性相關(guān)，韋曉梨等[6]報(bào)告NF-κB1-94del/ins ATTG 多態(tài)性與抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(antineutrophil cytoplasmic antibody，ANCA)相關(guān)性小血管炎(ANCA-Associated vasculitis，AAV)發(fā)病相關(guān)。本研究選擇2015年3月—2018年3月在本院診療的127 例ITP 患者，檢測(cè)NF-κB1-94del/ins ATTG 基因型和等位基因頻率，分析NF-κB1-94del/ins ATTG 基因多態(tài)性與ITP 的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 ITP 患者127 例，符合《血液病診斷與療效標(biāo)準(zhǔn)》第3 版[7]關(guān)于ITP 的診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中急性ITP 66 例，慢性ITP 61 例。急性ITP 組中男性20例，女性46 例，年齡24～59 歲，平均35.29±9.25 歲；慢性ITP 組中男性18 例，女性43 例，年齡24～59歲，平均35.61±9.37 歲。以同期本院體檢健康者130例為正常對(duì)照組，其中男性53 例，女性77 例，年齡22～60 歲，平均37.56±9.44 歲。各組研究對(duì)象性別、年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均知情同意。收集患者入院時(shí)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白(Hb)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、血清C 反應(yīng)蛋白(CRP)、類風(fēng)濕因子(RF)水平等資料。

1.2 NF-κB1-94del/ins ATTG 基因檢測(cè)方法

1.2.1 試劑與儀器:基因組DNA 提取試劑盒(TIANGEN BIOTECH 公司)，Tap DNA 聚合酶、dNTP(美國(guó)Promega 公司)，9700型PCR 儀(美國(guó)ABI 公司)。

1.2.2 DNA 提取:采集研究對(duì)象肘靜脈血3 mL 置于EDTA 抗凝管，常規(guī)蛋白酶K 消化，苯酚/氯仿提取DNA 溶解于TE 中，取DNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以檢測(cè)DNA 提取情況，其余DNA 于-20 ℃保存。

1.2.3 基因組DNA 擴(kuò)增:取樣本DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物序列根據(jù)GenBank 中NF-κB1 核苷酸序列設(shè)計(jì)，上游:5’-TTTAATCTGTGAAGAGATGTGAAT-3’，下游:5’-CTAGCAGGGCGCTCCCGAAT-3’。PCR擴(kuò)增體系:DNA 模板2 μL，上下游引物各1 μL，2×Tap PCR Master Mix 25 μL，雙蒸水補(bǔ)足50 μL。PCR 反應(yīng)條件:94 ℃30 s，65 ℃45 s、72 ℃45 s，循環(huán)30 次后，72 ℃下延伸7 min。PCR 擴(kuò)增片段為279 bp，用2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外分析儀觀察DNA 擴(kuò)增情況。

1.2.4 限制性內(nèi)切酶酶切PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物:取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，采用限制性內(nèi)切酶Van911(PflMI)進(jìn)行酶切反應(yīng)，該位點(diǎn)有野生純合子WW(ins/ins)、雜合子WD(ins/del)和變異純合子DD(del/del)。采用2%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，紫外分析儀觀察酶切情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用F 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，按Hardy-Weinberg 平衡定律檢驗(yàn)分析樣本的群體代表性和組間差異。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg 平衡定律檢驗(yàn) 正常對(duì)照組、急性ITP 組、慢性ITP 組NF-κB1-94del/ins ATTG等位基因頻率期望值與觀察值比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。符合Hardy-Weinberg 平衡定律，說(shuō)明群體達(dá)到遺傳平衡，提示所選樣本適合群體遺傳學(xué)研究。見表1。

表1 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果 例

2.2 基因組DNA 提取及NF-κB1-94del/ins ATTG基因型PCR 擴(kuò)增 NF-κB1-94del/ins ATTG 基因型分為缺失型純合子(DD型)、插入型純合子(WW型)和插入型雜合子(WD型)。瓊脂糖凝膠電泳顯示各基因型條帶見圖1，其中DD 基因型酶切后得到2個(gè)片段:254 bp、35 bp；WW 基因型酶切后得到3個(gè)片段:206 bp、48 bp、35 bp；WD 基因型酶切后得到4個(gè)片段:254 bp、206 bp、48 bp、35 bp。電泳過(guò)程中因?yàn)?8 bp、35 bp 片段太小，跑出凝膠之外，以致未能觀察到相應(yīng)條帶。

圖1 NF-κB1-94del/ins ATTG 基因多態(tài)性酶切電泳圖

2.3 各組NF-κB1-94del/ins ATTG 基因型及等位基因頻率比較 正常對(duì)照組與ITP 組NF-κB1-94del/ins ATTG 基因型及等位基因分布符合Hardy-Weinberg 平衡定律。與正常對(duì)照組比較，急性、慢性ITP組DD 基因型分布顯著升高，WW 基因型顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，WD 基因型的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；急性ITP 組與慢性ITP 組基因型比較，各基因型的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。等位基因比較顯示，急性ITP 組D 等位基因頻率顯著高于慢性ITP 組和對(duì)照組，W 等位基因頻率顯著低于慢性ITP 組和對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；慢性ITP 組D 等位基因頻率顯著高于對(duì)照組，W 等位基因頻率也顯著降低(P＜0.05)。見表2。

表2 各組NF-κB1-94del/ins ATTG 基因型及等位基因頻率比較 n（%）

2.4 各基因型ITP 患者臨床資料比較 NF-κB1-94del/ins ATTG 不同基因型ITP 患者年齡、性別、Hb、RBC 水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。各基因型患者PLT、CRP、RF 水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。WW 基因型患者PLT 高于DD型和WD型，CRP、RF 水平低于DD型和WD型，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；DD型與WD型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

表3 各基因型患者臨床資料比較 例（%）

2.5 影響ITP 多因素Logistic 回歸分析 以是否發(fā)生ITP 為因變量，以CRP、RF、NF-κB1-94del/ins ATTG 為自變量進(jìn)行Logistic 回歸分析，結(jié)果顯示NF-κB1-94del/ins ATTG 基因多態(tài)性是影響ITP 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表4。

表4 影響ITP 的多因素Logistic 回歸分析

3 討論

ITP 是常見的獲得性出血性疾病，其發(fā)病與免疫功能異常相關(guān)，因血小板免疫性破壞引起外周血中血小板減少，臨床上主要表現(xiàn)為皮膚、黏膜或內(nèi)臟出血。目前關(guān)于ITP 的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，與其他免疫性疾病相同，具有一定的遺傳性。

有研究報(bào)道，NF-κB1-94del/ins ATTG 基因多態(tài)性調(diào)控多種凋亡和炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，炎癥細(xì)胞因子又進(jìn)一步激活上游NF-κB1 基因過(guò)度轉(zhuǎn)錄、翻譯NF-κB1 蛋白，形成級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)[8]。目前關(guān)于NF-κB1-94del/ins ATTG 基因多態(tài)性與ITP 相關(guān)性研究鮮有報(bào)道。NF-κB 是P65 和P50 的異源二聚體，編碼P50 的NF-κB1 基因定位于4 號(hào)染色體(4q24)，可誘導(dǎo)下游100 多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄[9]。研究發(fā)現(xiàn)，ITP患者中NF-κB 活化比顯著升高，NF-κB 轉(zhuǎn)移至核內(nèi)結(jié)合特定基因啟動(dòng)子或增強(qiáng)子而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[10]。多項(xiàng)研究表明，NF-κB1-94del/ins ATTG 基因多態(tài)性與免疫炎癥性疾病密切相關(guān)，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[11]、潰瘍性結(jié)腸炎[12]、冠心病[13]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[14]等。KARBAN 等[12]報(bào)道，炎癥性腸病患者中NFκB1-94del/ins ATTG 的DD 基因型顯著高于對(duì)照組。LóPEZ-MEJíAS 等[11]研究類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎NFκB1-94del/ins ATTG 多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)DD 基因型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于WW 基因型。系統(tǒng)性紅斑狼瘡研究顯示，WD 基因型的患病風(fēng)險(xiǎn)較低[14]。本研究結(jié)果顯示，急、慢性ITP 患者與正常對(duì)照組均存在NF-κB1-94del/ins ATTG 基因多態(tài)性，與正常對(duì)照組比較，急性、慢性ITP 組DD 基因型分布顯著升高，急性ITP 組D 等位基因頻率高于慢性ITP 組和對(duì)照組，W 等位基因頻率顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示DD 基因型分布過(guò)高可能增加ITP患病的風(fēng)險(xiǎn)，這與在其他自身免疫性疾病中檢測(cè)結(jié)果一致。

NF-κB 是調(diào)控自身免疫性疾病發(fā)生發(fā)展的重要基因，參與體內(nèi)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[15]。作為體內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，NF-κB 調(diào)控白介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等的表達(dá)[16]。CRP 是非特異性炎癥反應(yīng)標(biāo)志物，主要由IL-6 調(diào)控，部分受IL-1β、TNF-α 的調(diào)控[17]。CRP 是重要炎癥信號(hào)通路因子，可促進(jìn)炎癥介質(zhì)的釋放[18]。RF 是以變性IgG 為抗原的自身抗體，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的血清或者滑膜液中可檢測(cè)到，只要存在變性IgG，并產(chǎn)生抗變性IgG 自身抗體，則于血清或病變中可以檢測(cè)出RF[19]。CRP 和RF 在自身免疫性炎癥疾病中具有重要作用[20]。

本研究結(jié)果顯示，NF-κB1-94del/ins ATTG 不同基因型ITP 患者血清CRP、RF 水平的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，與DD、WD 基因型比較，WW 基因型血清CRP、RF 水平均顯著下降，提示W(wǎng)W 基因型可能影響NF-κB1 下游基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯，抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。Logistic 回歸分析顯示，NFκB1-94del/ins ATTG 基因多態(tài)性是影響ITP 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示機(jī)體NF-κB1-94del/ins ATTG 基因型分布異?？赡茉黾覫TP 患病的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，ITP 的發(fā)生發(fā)展與NF-κB1-94del/ins ATTG 基因多態(tài)性具有一定相關(guān)性，有望為ITP 的基因治療提供參考。