HLA-DRB1等位基因和抗HLA-DRB1抗體在尿毒癥患者中的分布特征

郭旭麗，朱 權(quán)，王慧鵬，謝 敏，羅奇志*

（1. 河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，邯鄲 056038；2. 中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，長沙 410008）

人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）分為HLA-I、HLA-II、HLA-III 三個(gè)區(qū)域，與免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，其中HLA-II 區(qū)域編碼的HLA-DR抗原是與移植排斥有關(guān)的最重要的抗原［1-3］，是導(dǎo)致移植后發(fā)生排斥反應(yīng)的最主要因素，也是引發(fā)同種異基因排斥反應(yīng)的主要抗原［4］。尿毒癥是終末期腎病的表現(xiàn)形式，腎移植是目前唯一根治尿毒癥的手段［5］。晚期尿毒癥患者進(jìn)行腎移植前需檢測供受者HLA 的基因型別，通過選擇更多的HLA等位基因匹配的供者來盡可能地降低排斥反應(yīng)。有些患者由于接觸過同種HLA 抗原（輸血、妊娠、再移植等），體內(nèi)預(yù)先產(chǎn)生了相應(yīng)的抗HLA 抗體［6］，即群體反應(yīng)性抗體（population reactive antibody，PRA），一旦接觸到相應(yīng)抗原就會(huì)損傷供者的組織器官，因此必須在術(shù)前加以檢測，從而避免可能發(fā)生的移植排斥反應(yīng)。

根據(jù)移植體液免疫理論，造成器官移植受者對(duì)移植物排斥的原因是機(jī)體對(duì)HLA 抗原存在致敏效應(yīng)［7］。該效應(yīng)在移植受者中普遍存在，尤其是在再移植受者中更為多見。研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的等待腎臟再移植的受者體內(nèi)都存在抗HLA 抗體［8］，該類抗體與相應(yīng)抗原的反應(yīng)性以及交叉反應(yīng)現(xiàn)象是幾十年來研究的焦點(diǎn)。HLA 分子上的氨基酸序列在很大程度上有助于了解抗原抗體反應(yīng)的本質(zhì)，然而解析抗體與HLA 抗原上的特異表位之間的反應(yīng)則能夠更準(zhǔn)確地描述抗原抗體反應(yīng)的本質(zhì)。有些表位是獨(dú)有的，僅在一種抗原上出現(xiàn)；有些表位則能出現(xiàn)在多個(gè)抗原中［9］。例如：HLA-DQ 分子β 鏈上第56 位氨基酸為亮氨酸（L）時(shí)，就可確定為HLADQB1 分子，表明該表位為獨(dú)特表位，而表位82LR（第82位與第83位氨基酸分別為亮氨酸與精氨酸）在HLA-A2、B57、B58 等HLA 分子中都有出現(xiàn)，甚至有些表位能同時(shí)出現(xiàn)在HLA-A、B、C 分子中。近些年，基于重組HLA 單抗原包被的懸液芯片技術(shù)在確定抗HLA 抗體的特異性方面有著很大的作用［10］，通過該項(xiàng)技術(shù)還能確定表位的分布特征。

供受者間的HLA 絕大部分表位匹配時(shí)，即使基因型不匹配，也不會(huì)引發(fā)過強(qiáng)的排斥反應(yīng)。但是傳統(tǒng)的HLA 配型未能充分考慮表位匹配的問題，而表位的重要性遠(yuǎn)高于當(dāng)前針對(duì)移植受者體內(nèi)抗體特異性的研究。國際上已有大量有關(guān)移植受者表位匹配的報(bào)道，如Duquesnoy［11］報(bào)道了一項(xiàng)基于HLA表位匹配的器官移植案例；Wiebe 等［12］提出，表位匹配能最大化地降低供者特異性抗體的產(chǎn)生，并提高移植治療的效果；Walton 等［13］研究表明，表位匹配程度與慢性移植肺功能紊亂程度呈負(fù)相關(guān)。

HLA-DR基因是引發(fā)移植排斥反應(yīng)最重要的位點(diǎn)，同時(shí)在對(duì)腎移植受者進(jìn)行HLA 配型時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)HLA-DRB1基因座位與尿毒癥發(fā)病及腎移植排斥有一定的關(guān)聯(lián)。目前學(xué)術(shù)界對(duì)HLA-DRB1基因與尿毒癥及腎移植之間的關(guān)系尚未闡明，其影響移植腎存活的機(jī)制還未明確。為了在移植前更好地對(duì)尿毒癥患者進(jìn)行HLA 表型檢測，利于其配型，我們對(duì)尿毒癥患者的HLA-DRB1基因進(jìn)行檢測，對(duì)因尿毒癥而進(jìn)行了腎移植的患者進(jìn)行抗HLA-DRB1抗體的篩查，以期了解HLA-DRB1等位基因的分布特征和腎移植后HLA-DRB1 抗體的分布特征，探索基于表位的新型配型理論。本研究將為深入了解HLA-DRB1基因與尿毒癥的關(guān)系奠定基礎(chǔ)，對(duì)闡明HLA-DRB1基因在尿毒癥及腎移植中的作用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

連續(xù)收集2014 年至2019 年就診于湘雅醫(yī)院、湘雅二醫(yī)院與湘雅三醫(yī)院的358 例因尿毒癥進(jìn)行腎移植的患者（所有研究對(duì)象無其他重大疾病，相互之間無親緣關(guān)系）的血樣本，同時(shí)收集3 664 例健康志愿者的血標(biāo)本。所有研究對(duì)象均采集3 mL 靜脈血，分離出血清，并從外周血樣本中提取DNA。所有研究對(duì)象或家屬均簽署知情同意書。

1.2 HLA-DRB1 的基因分型

用HLA-II 類分型試劑盒（Immucor，Peachtree Corners，GA，美國）對(duì)所有患者的HLA-DRB1進(jìn)行基因分型。從樣品中提取DNA，最終質(zhì)量濃度為15～20 ng/μL。將2.0 μL DNA 與0.2 μL Taq 酶、11.8 μL ddH2O 和6.0 μL 探針混合物混合至總體積為20 μL。接著，啟動(dòng)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增系統(tǒng)：95℃ 5 min，1 個(gè)循環(huán)；95℃ 30 s，60℃ 45 s，72℃ 45 s，8 個(gè)循環(huán)；95℃ 30 s，63℃ 45 s，72℃ 45 s，32 個(gè)循環(huán)；72℃15 min，1 個(gè)循環(huán)。使用2.5 μL PCR 產(chǎn)物和7.5 μL探針混合物混合，97℃反應(yīng)5 min，接著47℃反應(yīng)30 min，最后56℃反應(yīng)30 min 進(jìn)行DNA 雜交。56℃反應(yīng)5 min 后加入稀釋液和藻紅蛋白-鏈霉親和素混合物（體積比為200∶1），置于Lumiex 儀器中進(jìn)行檢測。

1.3 抗HLA-DRB1 抗體的檢測

按說明書要求，用單抗原流式細(xì)胞術(shù)對(duì)抗HLADRB1的免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗體進(jìn)行檢測。將15 μL 患者血液標(biāo)本與45 μL 含10%綿羊血清的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）混合，然后添加Luminex檢測磁珠（Lambda，Themo，CA，USA）。陽性對(duì)照組為正常血清和磁珠（含10%綿羊血清），陰性對(duì)照組為質(zhì)控血清和磁珠（含10%綿羊血清）。加入磁珠后，充分搖勻混合物，室溫靜置30 min，然后用PBST（含0.05%吐溫20的PBS）洗滌4次，每次均以900g離心2 min，棄去上清液后加入60 μL 藻紅蛋白標(biāo)記的綿羊抗人IgG 并混合，置于Luminex儀器中讀出平均熒光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity，MFI）值。

1.4 穩(wěn)定表達(dá)HLA-DRB1*01/*13/*14細(xì)胞株的構(gòu)建

將人HLA-DRB1*01/*13/*14基因序列全長經(jīng)過PCR 擴(kuò)增后分別克隆到pEGFP-N1 載體中，分別獲得載有HLA-DRB1*01/*13/*14基因全長序列的重組質(zhì)粒。測序驗(yàn)證后分別轉(zhuǎn)染至HMy2.C1R細(xì)胞中［不表達(dá)HLA-A、B，僅表達(dá)少量的HLACw4（ATCC，Rockville MD，USA）］，在含500 μg/mL G418 的RPMI-1640 完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞呈綠色熒光。再經(jīng)細(xì)胞流式分選培養(yǎng)獲得穩(wěn)定表達(dá)HLA-DRB1*01/*13/*14的細(xì)胞株。

1.5 抗體吸附試驗(yàn)

分別收集穩(wěn)定表達(dá)HLA-DRB1*01/*13/*14 的細(xì)胞1.0×107個(gè)，并用pH 7.4 的PBS 洗滌3 次。將50 μL 含有與細(xì)胞表面HLA-DRB1 抗原對(duì)應(yīng)抗體的血清（MFI ＞5 000）分別與穩(wěn)定表達(dá)HLA-DRB1 抗原的細(xì)胞混合，37℃反應(yīng)1 h，然后離心收集血清。用Luminex 懸液分析系統(tǒng)對(duì)吸收后的血清進(jìn)行MFI值檢測，并與吸收前進(jìn)行比較。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

計(jì)算出研究對(duì)象的HLA-DRB1等位基因頻率，并與健康志愿者比較；計(jì)算出抗HLA-DRB1 抗體的分布頻率特征，以百分率表示；將各個(gè)抗體的MFI值取平均數(shù)并進(jìn)行平均MFI 值的比較。用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示，基因頻率的比較采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05 為有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗HLA-DRB1 抗體頻率在性別之間的比較

在358 名尿毒癥患者中，有35 名患者（10 名男性和25 名女性）具有抗HLA-DRB1 抗體，其余患者（173 例男性和150 例女性）沒有抗HLA-DRB1 抗體。其中女性患者中抗HLA-DRB1抗體的頻率高于男性，Student’st檢驗(yàn)結(jié)果表明差異顯著（P＜0.05）。

2.2 尿毒癥患者和健康對(duì)照組之間HLA-DRB1等位基因頻率的比較

為了確定HLA-DRB1是否與尿毒癥相關(guān)，本研究通過聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性寡核苷酸（polymerase chain reaction-sequence specific oligonucleotide，PCR-SSO）方法對(duì)358 名尿毒癥患者和3 664 名健康對(duì)照者的HLA-DRB1基因進(jìn)行分型，并對(duì)基因頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，尿毒癥患者組HLA-DRB1*13等位基因的頻率顯著低于健康對(duì)照組（4.33% vs. 13.37%，P＜0.001），相比之下，尿毒癥患者組HLA-DRB1*14等位基因的頻率顯著高于健康對(duì)照組（12.01% vs. 4.12%，P＜0.001）。即尿毒癥患者的HLA-DRB1*13等位基因頻率較低，而HLA-DRB1*14等位基因頻率較高；在健康對(duì)照者中，HLA-DRB1*13等位基因的頻率高，而HLA-DRB1*14等位基因的頻率低（表1）。這些結(jié)果表明：在基因頻率上，HLA-DRB1*13與尿毒癥患病率呈負(fù)相關(guān)，可能對(duì)個(gè)體具有保護(hù)作用；HLADRB1*14與尿毒癥患病率呈正相關(guān)，可能是尿毒癥的易感因素。

表1 358例尿毒癥和3 664健康對(duì)照者HLA-DRB1等位基因的頻率分布Tab. 1 Frequency distribution of HLA-DRB1 alleles in 358 patients with uremia and 3 664 health controls

2.3 HLA-DRB1*13/*14 基因型尿毒癥患者放療后腎臟移植的存活率

為了分析HLA-DRB1*13/*14等位基因?qū)δ蚨景Y患者生存的影響，我們對(duì)攜帶這兩種HLA-DRB1基因的尿毒癥患者進(jìn)行了生存分析。 由圖1 可知，HLA-DRB1*13基因型患者的生存率顯著高于HLA-DRB1*14基因型患者的生存率，而沒有HLADRB1*13/*14基因型的尿毒癥患者在腎移植后的移植腎的存活率介于HLA-DRB1*13和HLA-DRB1*14基因型的尿毒癥患者的存活率之間。

2.4 腎移植后尿毒癥患者體內(nèi)抗HLA-DRB1抗體的產(chǎn)生情況

圖1 尿毒癥患者移植后的腎臟的存活率Fig. 1 Survival rate of transplanted kidneys after kidney transplant in uremia patients

本研究對(duì)358 位因尿毒癥進(jìn)行腎移植的患者進(jìn)行抗HLA-DRB1 類抗體的檢測，其中120 例為抗HLA-DRB1 類抗體陽性。結(jié)果統(tǒng)計(jì)如表2 所示，抗HLA-DRB1*01/*13/*14 抗體的頻率顯著低于其他一些HLA-DRB1 類抗體（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 腎移植后尿毒癥患者體內(nèi)抗HLA-DRB1抗體產(chǎn)生情況Tab. 2 Anti-HLA-DRB1 antibody producing situation in uremic patient after renal transplantation

2.5 HLA-DRB1 抗原的表型分析

為了探究腎移植后尿毒癥患者體內(nèi)抗HLADRB1*01/*13/*14 抗體的頻率顯著低于其他抗HLA-DRB1 抗體的原因，我們用HLA Matchmaker（www.epitopes.net/）對(duì)HLA-DRB1基因序列進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，HLA-DRB1*01/*13/*14等位基因的編碼產(chǎn)物具有共同的表位77T（圖2），而其他HLA-DRB1 抗原沒有，故尿毒癥患者中抗HLA-DRB1*01/*13/*14 抗體的水平顯著低于其他抗HLA-DRB1 抗體可能是由存在的共同表位77T所致。

2.6 驗(yàn)證HLA-DRB1*01/*13/*14具有共同表位

為了明確HLA-DRB1*01/*13/*14 蛋白具有共同表位，我們利用吸附試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用表達(dá)HLA-DRB1*01 的細(xì)胞與含有抗HLADRB1*01/*13/*14 抗體的血清共同孵育后，再次對(duì)抗HLA-DRB1 抗體進(jìn)行檢測時(shí)，三種抗體的MFI 值顯著降低（P＜0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用表達(dá)HLA-DRB1*13/*14 的細(xì)胞與含有這三種抗HLADRB1 類抗體的血清孵育后也得到與上述HLADRB1*01 抗原試驗(yàn)相似的結(jié)果（圖3），說明HLADRB1*01/*13/*14具有共同表位。

為了進(jìn)一步了解表位的特征，我們通過免疫多態(tài)性數(shù)據(jù)庫-國際免疫遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫（www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/align.html）找到了相應(yīng)的氨基酸序列（僅100 個(gè)氨基酸）。表3 為相應(yīng)的氨基酸信息。三種HLA-DRB1 抗原的第77 位為蘇氨酸（T），這與HLAMatchmaker的分析結(jié)果一致。

表3 HLA-DRB1*01:01、HLA-DRB1*13:01和HLA-DRB1*14:01分子的氨基酸信息Tab. 3 Information of the amino acids of HLA-DRB1*01:01,HLA-DRB1*13:01 and HLA-DRB1*14:01 molecules

圖2 HLA-DRB1*01/*13/*14分子共同表位77T的結(jié)構(gòu)圖Fig. 2 The structure of common epitope 77T in HLA-DRB1*01/*13/*14 molecules

3 討論

腎移植是治療終末期腎病的最有效方法，通過替換失去功能的腎能達(dá)到根治效果。然而移植排斥反應(yīng)的存在限制了治療的效果。HLA 不匹配是造成移植排斥的主要因素，而表位不匹配則是HLA不匹配的主要原因。我們發(fā)現(xiàn)，HLA-DRB1*14與尿毒癥患病率呈正相關(guān)，并且它可能是尿毒癥的易感因素。尿毒癥患者中抗HLA-DRB1*13/ *14 抗體的頻率顯著低于其他抗HLA-DRB1 抗體，推測其根本原因是：1）HLA-DRB1*13是保護(hù)性基因，即使錯(cuò)配也難以誘導(dǎo)抗體；2）HLA-DRB1*14在健康人群中的頻率較低，在尿毒癥患者中的頻率較高，因而不能輕易產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。

為了進(jìn)一步研究HLA-DRB1*13/ *14 的特征，我們用HLA Matchmaker 數(shù)據(jù)庫搜索每個(gè)等位基因攜帶的表位，在比較后篩選出通用表位77T。有研究顯示，HLA-DRB1*01/*13/*14 蛋白存在第77 位的蘇氨酸（T）的表位，這與我們的試驗(yàn)結(jié)果相符合［14］。

圖3 穩(wěn)定表達(dá)HLA-DRB1的細(xì)胞對(duì)抗體的吸附Fig. 3 Adsorption of antibodies by cells stably expressing HLA-DRB1

長期的臨床研究表明，HLA 的匹配程度與腎移植的效果密切相關(guān)［15-17］。從理論上講，完全匹配可以確保幾乎沒有移植排斥的風(fēng)險(xiǎn)。Terasaki 等［18］發(fā)現(xiàn)，與HLA-A、B 和DR 這6 個(gè)等位基因都錯(cuò)配的腎移植受者的10 年生存率比這6 個(gè)位點(diǎn)完全匹配的受者降低了30%，半衰期縮短了大約12 年。但也有與之相反的結(jié)果，如HLA-DR17 位點(diǎn)為純合子時(shí)更能誘發(fā)移植排斥反應(yīng)，而錯(cuò)配或雜合子卻不容易引起移植排斥反應(yīng)［19］。因此當(dāng)腎移植受者帶有HLADR17等位基因時(shí)，應(yīng)選擇不含該位點(diǎn)的供者，從而降低排斥反應(yīng)發(fā)生的可能性。這與我們發(fā)現(xiàn)的HLA-DRB1*13有類似之處，即尿毒癥患者進(jìn)行腎移植時(shí)，雖然HLA-DRB1*13的錯(cuò)配可能性大，但卻不易產(chǎn)生抗HLA-DRB1*13 的抗體。同時(shí)回顧性研究中發(fā)現(xiàn)，某些存在多個(gè)HLA 抗原錯(cuò)配的移植亦能取得較好的效果［20-21］。這些現(xiàn)象提示我們，傳統(tǒng)的基于HLA等位基因分型的方法在預(yù)測移植排斥中的能力明顯低于基于表位的分型方法，表位匹配比傳統(tǒng)的等位基因匹配更能預(yù)防排斥反應(yīng)的發(fā)生。

供受者之間HLA 匹配程度是腎移植后影響移植物存活的重要因素，隨著HLA-I/II 類抗原錯(cuò)配程度的增高，發(fā)生急性排斥反應(yīng)以及移植物失功的風(fēng)險(xiǎn)也在上升。即使在廣泛使用免疫抑制劑的時(shí)代，HLA 匹配仍然是全世界范圍內(nèi)選擇供腎的主要標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)HLA-A、B、DR 位點(diǎn)的血清學(xué)分型是常用的判斷移植抗原錯(cuò)配的方法，同時(shí)也是評(píng)估預(yù)測潛在的具有免疫兼容性的供受者的標(biāo)準(zhǔn)。我們用HLA Matchmaker 軟件篩選了可能的表位，并通過數(shù)據(jù)庫查詢了其氨基酸序列，證實(shí)了HLADRB1*01/*13/*14這幾種抗原中含有同一種表位。

腎移植是挽救終末期腎臟病患者的最佳手段。有效控制移植排斥反應(yīng)，延長移植腎存活時(shí)間是腎移植中亟待解決的問題。本研究提供的數(shù)據(jù)可能支持進(jìn)一步研究和開發(fā)有關(guān)移植腎排斥反應(yīng)的新理論，也為以后闡明HLA-DRB1*13/*14 如何對(duì)個(gè)體具有保護(hù)或易感效應(yīng)及其機(jī)制提供了參考。