復(fù)方中草藥對羅氏沼蝦堿性磷酸酶（AKP）和血清蛋白的影響

洪迪珊，王余德

（湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，省部共建淡水魚類發(fā)育生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410081）

羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）屬節(jié)肢動(dòng)物門（Arthropod）、甲殼綱（Crustacea）、十足目（Decapoda）、長臂蝦科（Palaemonidae）、沼蝦屬（Macrobrachium），是一類大型淡水經(jīng)濟(jì)蝦，原產(chǎn)于東南亞（主要是馬來西亞），素有淡水蝦王之稱，被引進(jìn)到世界各地，成為世界養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大蝦種之一［1］。羅氏沼蝦具有生長快、個(gè)體大、食性廣、生長周期短、易飼養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，是一種理想的養(yǎng)殖品種，且營養(yǎng)豐富（可食部分蛋白質(zhì)含量為20.5%）、味道鮮美，是廣受國際水產(chǎn)品市場和世界蝦類養(yǎng)殖業(yè)者喜愛的養(yǎng)殖水產(chǎn)品。但是，隨著羅氏沼蝦的推廣逐步走向集約化養(yǎng)殖，人們在追求產(chǎn)量的同時(shí)卻降低了對其種質(zhì)的要求。這一現(xiàn)象主要體現(xiàn)為育苗親本的選育不嚴(yán)格、蝦苗營養(yǎng)供給不足等。除此以外，在養(yǎng)殖過程中大量使用抗生素及化學(xué)藥物的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，致使某些病原微生物的耐藥性增強(qiáng)，其抗病力強(qiáng)的特點(diǎn)已經(jīng)不復(fù)存在。白濁?。╳hitish muscle disease）、桃拉病毒（Taura syndrome virus）和傳染性及皮下造血組織壞死病毒（infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus）對羅氏沼蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重影響。加上環(huán)境污染等原因，使得水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失巨大［2］。隨著人們生活水平的提高，國內(nèi)外對水產(chǎn)品質(zhì)量的要求逐年提高，抗生素及化學(xué)藥物將受到嚴(yán)格限制，因此，提高機(jī)體自身的免疫力是解決病害問題的關(guān)鍵，加緊關(guān)于復(fù)方中草藥對提高羅氏沼蝦免疫力的研究是有必要的。

中草藥源于天然并保持了它們的自然結(jié)構(gòu)和生物活性，是動(dòng)物體最易接納的純天然物質(zhì)。其主要活性物質(zhì)如多糖、甙類、生物堿、黃酮類等通過對動(dòng)物機(jī)體免疫系統(tǒng)的刺激而呈現(xiàn)較為典型的非特異性免疫和特異性免疫作用［3］。除了含有免疫物質(zhì)外，中草藥還含有一些未知的促進(jìn)生長活性的因子及一定量的蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類、礦物質(zhì)、維生素、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)，這些成分可以增強(qiáng)食欲、促進(jìn)機(jī)體代謝和消化酶的分泌，有利于提高營養(yǎng)物質(zhì)的利用率，從而加速水產(chǎn)動(dòng)物的生長發(fā)育，降低飼料系數(shù)，增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物體質(zhì)，進(jìn)而提高機(jī)體的免疫力和抗應(yīng)激能力［4］。研究表明，中草藥制劑在防病、抗病和抑菌方面有著獨(dú)特的功效［5-8］，而選擇多種具有不同藥理作用的中草藥組成復(fù)方中草藥制劑可以得到藥效互補(bǔ)、療效增強(qiáng)的效果。作為一種飼料添加劑，中草藥制劑具有增強(qiáng)家禽免疫力、提高家禽生產(chǎn)性能、防病治病等功能。其與傳統(tǒng)抗生素添加劑相比，有著來源廣泛、生產(chǎn)成本低、不易產(chǎn)生耐藥性和不易殘留的優(yōu)勢［9］。本試驗(yàn)探討了飼料中按質(zhì)量比1∶1∶1∶1添加黃芪（Astragalus mongholicus）、板藍(lán)根（Isatidis radix）、杜仲（Eucommia ulmoides）、魚腥草（Cordate houttuynia）制成的復(fù)方中草藥制劑對羅氏沼蝦的生長性能和免疫活性產(chǎn)生的影響，為羅氏沼蝦的生態(tài)健康養(yǎng)殖提供保障。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的羅氏沼蝦于2018 年7 月取自長沙市大成橋鎮(zhèn)鵲山村羅氏沼蝦養(yǎng)殖場 （勝蝦場）。蝦苗個(gè)體大小均勻，活力強(qiáng)，腸胃飽滿。在靜止?fàn)顟B(tài)下，大部分蝦苗呈伏底狀態(tài)，受到水流刺激后有頂水現(xiàn)象。取回后飼養(yǎng)于湖南生物研究所露天平臺(tái)上，試驗(yàn)用水箱規(guī)格為內(nèi)徑80 cm、高100 cm 的圓形黑色水箱。于每個(gè)水箱取5尾蝦稱重、測體長，求其平均值并記錄數(shù)據(jù)。養(yǎng)蝦用水需要事先將自來水存于干凈水箱中曝氣1～2 d，并調(diào)節(jié)自來水的軟硬度（于每桶水中加入0.4 g Na2S2O3、2.0 g葡萄糖、3.0 g NaOH），注意調(diào)節(jié)水的pH在7～8，水溫控制在20～30℃（若水溫低于16℃，羅氏沼蝦易大量死亡）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置對照組C K（0%）及A（1.0%）、B（1.5%）、C（2.0%）、D（2.5%）、E（3.0%） 5個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度，每個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度分組中各有25 只羅氏沼蝦，分別飼喂于6 個(gè)水箱中（表1）。在基礎(chǔ)飼料中分別添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的復(fù)方中草藥制劑，采用連續(xù)投喂的方法飼喂羅氏沼蝦25 d，提取羅氏沼蝦心臟血清檢測堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、溶菌酶及蛋白含量，與對照組作對比，并得出最佳中草藥的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3 復(fù)方中草藥制劑

本試驗(yàn)選取黃芪、板藍(lán)根、杜仲、魚腥草4 味中草藥按質(zhì)量比為1:1:1:1 配成復(fù)方中草藥制劑。將中草藥制劑粉碎后進(jìn)行浸泡處理，以方便復(fù)方中草藥制劑與飼料較為準(zhǔn)確地按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度混合。試驗(yàn)梯度：試驗(yàn)飼料中分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的復(fù)方中草藥制劑，對照組飼料中不添加。

每個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度分組的蝦每天需喂養(yǎng)10 g試驗(yàn)飼料（日投喂量為體重的4%～10%）。將復(fù)方中草藥制劑與飼料混勻后投喂給羅氏沼蝦，配方如表1。

表1 添加復(fù)方中草藥制劑配方表Tab. 1 Formula for compound Chinese herbal medicine unit: g

1.4 飼養(yǎng)管理

采用定時(shí)定量投喂的方式，并根據(jù)攝食和生長情況作相應(yīng)的調(diào)整，每天在08:00、12:00、17:00、21:00 時(shí)投喂，早晚2 次的投喂量為總投喂量的60%～70%。每天早晚用溫度計(jì)測量水溫，確保在20℃以上（20～30℃），并且測量水環(huán)境的pH 值，使之維持在7～8。每天換1次水（調(diào)節(jié)過pH、軟硬度、滲透壓、曝氣2 d 的貯備水），且換水時(shí)只可放出1/3的水，否則水環(huán)境會(huì)改變（以微微發(fā)綠，有藻類及浮游生物的水質(zhì)為佳）。空壓泵不間斷充氣和增氧，室外自然光照。每天進(jìn)行排污，發(fā)現(xiàn)死蝦及時(shí)撈起，稱重并做記錄。每天觀察羅氏沼蝦攝食（羅氏沼蝦腹部腸道呈黑色，飽滿）、蛻殼及生長情況。健康的羅氏沼蝦體色透明，有活力，遇水流刺激會(huì)彈開。

1.5 采樣及生長性能指標(biāo)的測定

1.5.1 體長及體重

試驗(yàn)結(jié)束后，于每個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度桶中取5 尾蝦，分別用電子天平稱其體重，用游標(biāo)卡尺測體長，求其平均值、體長增長率和相對增重率，并記錄下數(shù)據(jù)。其體長增長率、相對增重率、特定生長率和餌料系數(shù)的計(jì)算公式如下：

體長增長率（%）=（試驗(yàn)?zāi)w長－試驗(yàn)初體長）/試驗(yàn)初體長×100%；

相對增重率（%）= （試驗(yàn)?zāi)w重－試驗(yàn)初體重）/試驗(yàn)初體重×100%；

特定生長率（%/d）=（lnWt－lnWo）/t×100%；飼料系數(shù)=攝食量/（Wt－Wo）。

Wt為試驗(yàn)?zāi)┪r體均重（g）；Wo為試驗(yàn)初蝦體均重（g）；t為試驗(yàn)時(shí)間（d）。

1.5.2 羅氏沼蝦心臟血清的提取

每個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度桶重復(fù)取10 尾蝦，逐尾用5 mL 注射器自羅氏沼蝦頭胸甲后插入心臟取血，合并置于Eppendor 管，于冰箱4℃中保存。以5 000 r/min 離心10 min，收集血清，-70℃下保存待測。

1.6 羅氏沼蝦血清免疫指標(biāo)的測定方法

1.6.1 AKP 的活力測定

參照宋善俊等［10］的方法，使用磷酸苯二鈉比色法測定血清堿性磷酸酶，見表2。

表2 AKP活力測定操作表Tab. 2 Operating table for determination of AKP activity unit: μL

1.6.2 血清及組織勻漿中的蛋白測定

均勻切取1 塊羅氏沼蝦的腹肌組織，準(zhǔn)確稱取其重量，按重量體積比［11］加生理鹽水制備成10%的組織勻漿，1 000～3 000 r/min 離心10 min，然后取組織勻漿上清，再用生理鹽水按1:9 稀釋成1% 的組織勻漿待測。測定管分血清組及組織勻漿組，每組6 個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度（含對照組），并且設(shè)3 組平行試驗(yàn)（表3）。蛋白含量（g/L）=［（測定管OD值-空白管OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值）］ ×標(biāo)準(zhǔn)管濃度（0.563 g/L），其中OD為光密度。

表3 血清及組織勻漿中蛋白測定Tab. 3 Determination of protein in serum and tissue homogenate unit: mL

1.6.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

采用 Microsoft Excel 2010 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方中草藥對羅氏沼蝦生長的影響

由表4 和圖1 可以看出，羅氏沼蝦的特定生長率（specific growth rate，SGR）、體長增長率（growth rate of body length，LG）、相對增重率（relative weight gain rate，WG）3 項(xiàng)指標(biāo)隨著飼料中復(fù)方中草藥制劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，與對照組相比，試驗(yàn)組3 項(xiàng)指標(biāo)有明顯提高。飼料系數(shù)（food coefficient，F(xiàn)CR）與對照組相比差異不明顯，但依然呈現(xiàn)先緩慢下降后上升的趨勢。當(dāng)復(fù)方中草藥制劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到2.5%時(shí)，3 項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到最高，F(xiàn)CR 達(dá)到最低（說明飼料轉(zhuǎn)化率提高），當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到3.0%時(shí)，3 項(xiàng)指標(biāo)均有所降低，F(xiàn)CR有所升高（說明飼料轉(zhuǎn)化率降低）。當(dāng)復(fù)方中草藥制劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.0%、1.5%、2.0% 時(shí)，各項(xiàng)指標(biāo)差異不明顯。這表明當(dāng)飼料中復(fù)方中草藥制劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5% 時(shí)，羅氏沼蝦的生長性能最好。

表4 復(fù)方中草藥制劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對羅氏沼蝦生長的影響Tab. 4 Effects of compound Chinese herbal medicine mass fraction on growth in Macrobrachium rosenbergii

2.2 復(fù)方中草藥對羅氏沼蝦血清中免疫指標(biāo)的影響

表4、5 表明，隨著復(fù)方中草藥制劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，羅氏沼蝦血清中的AKP 活性（圖2）以及蛋白含量（圖3）均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)中草藥的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到2.5% 時(shí)，AKP 的活性達(dá)到最大值，蛋白含量達(dá)到最高。當(dāng)中草藥的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到3.0% 時(shí)，羅氏沼蝦血清中的AKP 活性及蛋白含量較D 組（2.5%）明顯下降，但仍高于A 組（1.0%） 。這表明當(dāng)飼料中所添加的復(fù)方中草藥制劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5% 時(shí)，羅氏沼蝦血清中的AKP 活性最高，蛋白含量最大。

表5 各復(fù)方中草藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度分組血清中AKP及蛋白含量Tab. 5 The AKP and protein activity of the compound Chinese herbal medicine mass fraction gradient grouping in Macrobrachium rosenbergii

2.3 復(fù)方中草藥對羅氏沼蝦肌肉中蛋白含量的影響

以中草藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度為橫坐標(biāo)、蛋白含量為縱坐標(biāo)作曲線圖，羅氏沼蝦腹肌中蛋白含量為血清中蛋白含量下方一條平滑的曲線（圖4）。由圖4可以看出，復(fù)方中草藥對羅氏沼蝦肌肉中蛋白含量的影響沒有血清中蛋白含量的明顯，但仍然呈現(xiàn)緩慢上升后下降的趨勢。當(dāng)中草藥的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到2.5%時(shí)，羅氏沼蝦腹肌中蛋白含量達(dá)到最大值。這表明當(dāng)復(fù)方中草藥制劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5% 時(shí)，羅氏沼蝦的免疫力最強(qiáng)，對非特異性免疫活性有明顯的促進(jìn)作用，并且有助于提高羅氏沼蝦的營養(yǎng)價(jià)值，如表6。

表6 各復(fù)方中草藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度羅氏沼蝦肌肉中的蛋白含量Tab. 6 The protein concentration of the compound Chinese herbal medicine mass fraction gradient grouping in Macrobrachium rosenbergii

圖1 復(fù)方中草藥制劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對羅氏沼蝦生長的影響Fig. 1 Effects of compound Chinese herbal medicine mass fraction on growth in Macrobrachium rosenbergii

圖2 復(fù)方中草藥制劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對羅氏沼蝦血清中AKP的影響Fig. 2 Effects of compound Chinese herbal medicine mass fraction on the AKP in Macrobrachium rosenbergii

圖3 復(fù)方中草藥制劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對羅氏沼蝦血清中蛋白活性的影響Fig. 3 Effects of compound Chinese herbal medicine mass fraction on the protein activity in Macrobrachium rosenbergii

圖4 復(fù)方中草藥制劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對羅氏沼蝦肌肉和血清中蛋白含量的影響Fig. 4 Effects of compound Chinese herbal medicine mass fraction on Macrobrachium rosenbergii muscle and serum protein concentration

3 討論

中草藥添加劑取自自然界，其成分具有自然的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，保持天然性外源精華，同時(shí)具有生物活性和雙向調(diào)節(jié)等優(yōu)勢，毒副作用不明顯，不污染環(huán)境，抗藥性小。黃芪、板藍(lán)根、杜仲、魚腥草4 味中草藥含有多糖、甙類、黃酮、氨基酸等多種有效成分，具有促進(jìn)免疫增強(qiáng)和雙向免疫調(diào)節(jié)的作用［12］。本試驗(yàn)證明了富含這些成分的復(fù)方中草藥添加劑可明顯提高羅氏沼蝦的免疫活性。王雷等［13］利用富含上述免疫活性成分的數(shù)種中草藥物制成的飼料對中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis）進(jìn)行投喂，發(fā)現(xiàn)中國對蝦的發(fā)病率和死亡率明顯降低，體內(nèi)的抗菌、溶菌活力等免疫指標(biāo)均有所提高。

羅氏沼蝦屬于無脊椎動(dòng)物，且其體液不具有免疫球蛋白，其主要通過非特異免疫系統(tǒng)和非特異免疫因子的調(diào)節(jié)來抵抗病原體的襲擊［14］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著飼料中復(fù)方中草藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，羅氏沼蝦的血清中AKP 活性、蛋白含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，試驗(yàn)組相較于對照組有很大提高，在各試驗(yàn)組中2.5%的添加量效果最好。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)復(fù)方中草藥添加劑可明顯促進(jìn)羅氏沼蝦的生長。當(dāng)中草藥制劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到1.0%時(shí)，LG、WG及SGR 均有明顯提高。隨著中草藥質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，3 項(xiàng)指標(biāo)均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)中草藥的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到2.5%時(shí)，各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到最大值，并在提高到3.0% 時(shí)明顯下降，但仍然高于A 組（1.0%）。FCR 與對照組相比差異不明顯（P＞0.05），但依然呈現(xiàn)先緩慢下降后上升的趨勢。當(dāng)復(fù)方中草藥制劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到2.5%時(shí)，F(xiàn)CR 達(dá)到最低值（說明飼料轉(zhuǎn)化率提高），當(dāng)增加到3.0%時(shí)，F(xiàn)CR有所升高（飼料轉(zhuǎn)化率降低）。結(jié)果表明，當(dāng)飼料中復(fù)方中草藥制劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%時(shí)，羅氏沼蝦的生長性能最高。這與已有的一些研究結(jié)果一致［15-17］。由此可以推測，復(fù)方中草藥制劑對羅氏沼蝦的促生長作用可能與其提高飼料營養(yǎng)物質(zhì)消化利用率和改善消化道內(nèi)環(huán)境有關(guān)。

由試驗(yàn)可知，復(fù)方中草藥制劑對羅氏沼蝦蛋白含量的影響在肌肉和血清中差異明顯。這一結(jié)果與周遵春等［18］研究結(jié)果一致，證實(shí)了復(fù)方中草藥制劑對羅氏沼蝦蛋白含量具有促進(jìn)作用，可推測出現(xiàn)這一現(xiàn)象可能與復(fù)方中草藥黃芪等屬于雙向免疫調(diào)節(jié)劑（對免疫功能低下者起促進(jìn)作用，而對免疫機(jī)能亢進(jìn)者起抑制作用［19］）有關(guān)，具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步試驗(yàn)予以證實(shí)。

綜上所述，本試驗(yàn)選取黃芪、板藍(lán)根、杜仲、魚腥草4 味中草藥按質(zhì)量比為1∶1∶1∶1 配成的復(fù)方中草藥制劑能夠顯著提高羅氏沼蝦的生長速度，增強(qiáng)AKP 活性，提高羅氏沼蝦體內(nèi)的蛋白含量。進(jìn)而說明復(fù)方中草藥制劑作為羅氏沼蝦飼料添加劑能夠顯著提高羅氏沼蝦的生長性能和免疫力，可有效保障羅氏沼蝦的健康和養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益，可在羅氏沼蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。