基于Illumina MiSeq高通量技術(shù)比較甘肅藏區(qū)傳統(tǒng)牦牛發(fā)酵乳制品細(xì)菌菌群多樣性

朱 瀟，梁 琪*，王湘竹，劉 瑛

（1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室 蘭州730070 2 甘肅臨夏州燎原乳業(yè)有限公司 甘肅臨夏731100）

甘肅藏區(qū)分布于甘肅省西南部，平均海拔3 000 m，地形復(fù)雜多樣，擁有獨(dú)特的高原氣候，強(qiáng)紫外線輻射（單日最高UVI 可達(dá)12.5），平均氣溫低（年平均氣溫低于5 ℃）且晝夜溫差較大（近10年最高晝夜溫差達(dá)到22 ℃），含氧量少（空氣中的年平均氧含量?jī)H為平原地區(qū)的50%），蘊(yùn)含著豐富的微生物資源。牦牛是一種在青藏高原地區(qū)分布的珍稀物種，藏民們一般使用牦牛奶制作各種乳制品，這些乳制品是藏族家庭的主要生活來源[1]。酸牦牛乳是一種黏稠、芳香、營(yíng)養(yǎng)豐富的發(fā)酵乳制品，藏民家庭采用的傳統(tǒng)發(fā)酵工藝主要分為2 種：第1 種為自然發(fā)酵，不添加任何發(fā)酵劑[2]，這類酸乳可以很好地保存當(dāng)?shù)爻Ｄ曜匀恍纬傻膬?yōu)勢(shì)菌種；第2 種是在少數(shù)藏區(qū)家庭，將藏靈菇粒作為發(fā)酵劑進(jìn)行發(fā)酵。藏靈菇也被稱為開菲爾，是一種顆粒狀天然發(fā)酵劑[3-4]，含有穩(wěn)定的微生物群落。此外，藏民將大量牦牛奶脫脂后經(jīng)自然發(fā)酵并晾曬制成曲拉，主要提供日常消費(fèi)，并且可以長(zhǎng)期保存。制作曲拉時(shí)需要長(zhǎng)時(shí)間將牦牛乳暴露于自然環(huán)境中，因此其含有高原環(huán)境中的多種微生物[5]。

國(guó)際上對(duì)于細(xì)菌群落組成的研究方法，主要有傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和基于分子生物學(xué)技術(shù)的非培養(yǎng)方法[6]。高通量技術(shù)屬于非培養(yǎng)方法，能夠在不偏向優(yōu)勢(shì)菌群的情況下檢測(cè)總體菌群，可以更加真實(shí)、客觀且全面地了解微生態(tài)系統(tǒng)中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)信息，目前已成功應(yīng)用于食品微生物學(xué)研究[7-8]。近年來，隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，對(duì)于乳制品中微生物種類和豐度的研究成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。Ercolini 等[9]采用聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳分析藍(lán)紋奶酪中細(xì)菌組成時(shí)發(fā)現(xiàn)，即使同一塊奶酪，不同部位細(xì)菌種類也存在明顯差異。Quigley 等[10]利用454 基因組測(cè)序平臺(tái)對(duì)60 個(gè)愛爾蘭軟、半硬和硬奶酪的細(xì)菌菌群多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)地的奶酪中細(xì)菌群落組成存在顯著差異。Alderet-Tapia 等[11]通過454 焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)原奶、發(fā)酵乳清、發(fā)酵乳和一種墨西哥手工自制成熟奶酪的細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析，也發(fā)現(xiàn)制作奶酪過程中，不同類型乳制品的細(xì)菌群落存在差異性。目前，利用Illumina MiSeq 高通量測(cè)序平臺(tái)分析甘肅藏區(qū)各類傳統(tǒng)乳制品細(xì)菌菌群多樣性的研究鮮見報(bào)道。

本研究對(duì)甘肅藏區(qū)酸牦牛乳、曲拉乳、藏靈菇酸奶的細(xì)菌菌群多樣性進(jìn)行表征。通過高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)比較分析，揭示細(xì)菌群落組成的差異性和相似性，對(duì)藏區(qū)益生性微生物資源的研究與發(fā)展奠定試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

其中藏靈菇粒在無菌脫脂牛奶中（28 ℃下培養(yǎng)24 h）被增活3 次，制成藏靈菇酸奶。

TruSeqTMDNA 試劑盒，美國(guó)Illumina 公司；凝膠提取試劑盒，美國(guó)Axygen Biosciences 公司；2%瓊脂糖凝膠，西班牙biowest 公司；FastPfu 聚合酶，北京全式金生物；MetaVxTM文庫(kù)構(gòu)建試劑盒，美國(guó)GENEWIZ 公司；PCR 引物由金唯智公司設(shè)計(jì)。

1.2 儀器與設(shè)備

miniG 型離心機(jī)、漩渦混合器，德國(guó)IKA 公司；5424R 型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國(guó)eppendorf公司；Nanodrop 2000 型超微分光光度計(jì)，美國(guó)thermofisher 公司；Qubit 2.0 熒光計(jì)，德國(guó)Life 公司；tecan 型酶標(biāo)儀，瑞士F200 公司；Agilent 2100生物分析儀，美國(guó)Agilent Technologies 公司；Illumina MiSeq 300PE，美國(guó)Illumina 公司；GeneAmpR9700 型PCR 儀，美國(guó)ABI 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA 提取 使用Qubit 2.0 熒光光度計(jì)得到DNA 樣品的濃度，使用MetaVxTM文庫(kù)構(gòu)建試劑盒構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。

1.3.2 PCR 擴(kuò)增及測(cè)序 以30～50 ng DNA 為模板，利用金唯智公司設(shè)計(jì)的一系列PCR 引物（包含“CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT”序列的上游引物和包含“GGACTACNVGGGTWTCT AATCC”序列的下游引物）擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA的V3-V4 的2 個(gè)高度可變區(qū)。PCR 擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性2 min，95，55，72 ℃分別持續(xù)30 s共30 次循環(huán)，72 ℃延伸5 min。

使用Agilent 2100 生物分析儀檢測(cè)文庫(kù)質(zhì)量，并且通過Qubit 2.0 熒光光度計(jì)檢測(cè)文庫(kù)濃度。DNA 文庫(kù)混合后，按Illumina MiSeq 300PE儀器使用說明書進(jìn)行PE250/300 雙端測(cè)序，由MiSeq 自帶的MiSeq Control Software（MCS）讀取序列信息[12]。

1.3.3 分析項(xiàng)目 兩兩組裝通過雙端測(cè)序后的reads，保留序列長(zhǎng)度大于200 bp 的序列，并過濾含有N 的序列。去除嵌合體后進(jìn)行OUT 分析。使用Silva132[13]數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)16S rRNA，進(jìn)行序列聚類（相似性97%）。在OUT 分析結(jié)果下，分別計(jì)算Shannon、Chao1 等α 多樣性指數(shù)，并繪制稀釋曲線[14]?；趗nweighted unifrac 分析比較樣本間是否有顯著的細(xì)菌群落差異，并用PCoA（Principal co-ordinates analysis）及層次聚類顯示出樣本的β多樣性。最后使用PICRUSt 進(jìn)行功能預(yù)測(cè)分析。

為實(shí)施繼續(xù)醫(yī)療教育，圖書館添購(gòu)書籍增加藏書量是必不可少的舉措。為了保障所添購(gòu)書籍能夠發(fā)揮實(shí)際作用，在添購(gòu)之前就必須確定相關(guān)書籍的購(gòu)買方向，避免花大量資金添購(gòu)的書籍沒有實(shí)質(zhì)作用的尷尬局面。因此，在添購(gòu)書籍之前有項(xiàng)必要的準(zhǔn)備工作需要完成，就是統(tǒng)計(jì)醫(yī)院醫(yī)務(wù)人員所需要閱讀、學(xué)習(xí)的醫(yī)學(xué)知識(shí)，以此為基礎(chǔ)來選擇醫(yī)學(xué)書籍的購(gòu)買方向。隨著社會(huì)科技的發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)完全融入到人們生活之中，目前年輕一代醫(yī)務(wù)人員更多的傾向于網(wǎng)絡(luò)書籍的閱讀，因此圖書館也應(yīng)改變以往常態(tài)，建立一個(gè)網(wǎng)絡(luò)閱讀平臺(tái)，將書籍信息發(fā)布在平臺(tái)上，更好的完善圖書館的供應(yīng)需求，激發(fā)年輕一代醫(yī)務(wù)人員學(xué)習(xí)興趣，多多提倡網(wǎng)絡(luò)交流，以此促進(jìn)醫(yī)療事業(yè)發(fā)展[3]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用cutadapt 1.9.1、Qiime 1.9.1、RDP Classifier 2.2、R 3.3.1、Cytoscape 3.5.1、STAMP 2.1.3、LEfSe 1.0 等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)的特點(diǎn)

圖1是樣品的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖，大約在500 bp 處可見清晰、明亮的條帶，且無明顯的非特異擴(kuò)增現(xiàn)象，說明PCR 擴(kuò)增成功，結(jié)果滿足后續(xù)測(cè)序要求。

圖1 PCR 產(chǎn)物凝膠電泳Fig.1 Electrophoresis of PCR amplified product

通過高通量測(cè)序，9 份樣品共獲得1 389 098條原始序列；篩選后得到平均長(zhǎng)度為470 bp 的511 070 條高質(zhì)量16S rRNA 基因序列，表1顯示了每個(gè)樣本的分析讀數(shù)。所有樣本的覆蓋估計(jì)量的觀測(cè)值（高于0.999）進(jìn)一步支持了以下結(jié)果。通過Shannon 和Simpson 指數(shù)對(duì)9 份樣品中的細(xì)菌多樣性進(jìn)行評(píng)價(jià)。由表1看出，酸牦牛乳、曲拉乳、藏靈菇酸奶樣品中細(xì)菌的平均Shannon 指數(shù)分別為0.171±0.100，0.014，0.337±0.105。Simpson 指數(shù)分別為：0.540±0.269，0.072，0.976±0.228。Shannon 指數(shù)越大，表示每個(gè)個(gè)體都屬于不同的種屬，從而多樣性指數(shù)越高。因此，本研究中3 種類型傳統(tǒng)乳制品多樣性排序?yàn)椋翰仂`菇酸奶＞酸牦牛乳＞曲拉乳。

表1 甘肅藏區(qū)不同傳統(tǒng)牦牛發(fā)酵乳制品α-多樣性Table 1 α-Diversity of different traditional yak fermented dairy products in Tibetan areas of Gansu

2.2 稀釋曲線

稀釋曲線顯示了在給定恒等百分比下，每個(gè)樣本所獲得的序列讀數(shù)隨識(shí)別的OTUs 數(shù)量的變化。理想情況下，通過曲線的平臺(tái)期可以確定最佳覆蓋范圍，這表明增加讀取次數(shù)并不會(huì)改變可以確定的OTUs 數(shù)量[15]。由圖2可見，OTUs 的數(shù)量隨著測(cè)序量的增加而不斷上升，當(dāng)?shù)竭_(dá)一定測(cè)序深度時(shí)，各樣品的稀疏曲線逐漸達(dá)到平穩(wěn)，這說明隨著測(cè)序量的增加不會(huì)再有較多的OTUs 和種系被發(fā)現(xiàn)，樣品中細(xì)菌的多樣性已經(jīng)被充分展現(xiàn)。

2.3 樣品細(xì)菌門水平組成

本研究采集的樣品共鑒定出5 個(gè)細(xì)菌門（表2），分別為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門 （Bacteroidetes）、藍(lán)菌門（Cyanobacteria）和綠彎菌門（Chloroflexi）。主要門為厚壁菌門，占細(xì)菌總序列的99.52%。一直以來，厚壁菌門是乳制品中研究的主要細(xì)菌[16]，該門分別占酸牦牛乳、曲拉乳和藏靈菇酸奶樣本細(xì)菌序列的99.60%，99.97%和99.05%；變形桿菌是亞優(yōu)勢(shì)門，占總細(xì)菌序列的0.02%～0.49%。擬桿菌門、藍(lán)菌門、綠彎菌門等小門占總細(xì)菌序列的0.08%。藍(lán)菌門存在于樣品HZ3、HZ4 及HZ6 中，而綠彎菌門僅存于HZ3 中。

圖2 樣品稀釋曲線Fig.2 Sample dilution curve

2.4 樣品細(xì)菌屬水平組成

如表3所示，在屬水平上分析了各樣品細(xì)菌的相對(duì)豐度，鑒定出11 種細(xì)菌菌屬。其中，乳桿菌屬（Lactobacillus）和鏈球菌屬（Streptococcus）來自于同一動(dòng)物門（厚壁菌門）為高豐度，其次是球菌屬（Macrococcus）、乳球菌屬（Lactococcus）、大腸志賀菌屬（Escherichia-Shigella）和拉烏爾菌屬（Raoultella）。

表2 各樣品門水平菌群分布相對(duì)豐度（%）Table 2 The relative abundance of horizontal flora distribution in phylum level of each sample （%）

在所有樣品中均檢測(cè)到了乳桿菌屬和鏈球菌屬。乳桿菌屬在各樣品中最為豐富，均達(dá)到90%以上，其中：酸牦牛乳為78.59%～96.19%，曲拉乳為99.37%，藏靈菇酸奶為94.71%～95.60%。在鏈球菌屬水平下，酸牦牛乳中鏈球菌屬含量最高（2.06%～16.74%），其次是藏靈菇酸奶（3.56%～4.22%），在曲拉乳中最低為0.58%；而對(duì)于球菌屬水平，只有在酸牦牛乳中發(fā)現(xiàn)其存在，且在ZH5 中高達(dá)5.13%，其余2 類樣品中尚未發(fā)現(xiàn)；未鑒定出屬也具有較高的豐度，酸牦牛乳為0.01%～0.36%，曲拉乳為0.02%，藏靈菇酸奶為0.01%～0.19%。

此外，水棲菌屬（Enhydrobacter）、狹義梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto_1）、尖葉菜豆屬（Phaseolus_acutifolius）均在酸牦牛乳中被檢測(cè)到，而在藏靈菇酸奶、曲拉乳中未被檢測(cè)到或豐度值過低（＜0.05%）。

表3 各樣品屬水平菌群分布相對(duì)豐度（%）Table 3 The relative abundance of horizontal flora distribution in genus level of each sample （%）

2.5 樣品細(xì)菌屬水平豐度熱圖

圖3是9 個(gè)樣品在屬水平下的物種豐度熱圖，圖中顏色越深則說明所含的菌屬越多。由圖3可知，9 個(gè)樣本中乳桿菌屬含量最高，其次是球菌屬。

其中，還有一些在數(shù)據(jù)庫(kù)匹配中未鑒定出的屬，也具有較高的豐度。在不同類型的傳統(tǒng)牦牛發(fā)酵乳制品樣品中，酸牦牛乳HZ4、HZ3、HZ6 及HZ1 所含菌屬種類較多。曲拉乳菌屬含量最少，說明每類樣品中菌群的豐度存在差異。因此，不同類型的樣品中菌群多樣性存在差異性。

圖3 屬水平物種豐度熱圖Fig.3 The heat maps of species abundance on genus

2.6 樣品細(xì)菌群落相似性分析

用R 語言分析3 類傳統(tǒng)乳制品中的細(xì)菌群落，提取的前2 個(gè)主成分方差的累積貢獻(xiàn)率共為97.76%，分別為95.75%及2.01%（圖4）。在PC1軸上，酸牦牛乳存在部分交疊現(xiàn)象，說明第1 主成分是導(dǎo)致3 類樣品細(xì)菌菌群差異的主要因素。而在PC2 維度上9 個(gè)樣品均可以得到很好的區(qū)分，各樣本所表示的點(diǎn)在空間上都有一定的距離，所產(chǎn)生的差異可能是由于原料、處理方式及環(huán)境因素不同所致[17]。

樣本聚類分析是通過使用樣本序列之間的進(jìn)化信息，來比較環(huán)境樣本是否在特定的進(jìn)化譜系中具有顯著的細(xì)菌群落差異，根據(jù)兩樣本間的分支長(zhǎng)度判斷，兩樣本越相似，樣本間的分枝長(zhǎng)度越短。從圖5可知，9 份樣品可分為兩大類，其中6 份酸牦牛乳相似性較高，并與1 份藏靈菇酸奶聚為1 類，另1 份藏靈菇酸奶與曲拉乳聚為1類。在第1 類中，藏靈菇酸奶與酸牦牛乳產(chǎn)生了明顯的分枝，而6 種酸牦牛乳也聚為4 組。第2類中藏靈菇酸奶與曲拉乳的分枝較長(zhǎng)，相似性較低。以上聚類結(jié)果表明，不同種類的傳統(tǒng)乳制品細(xì)菌群落多樣性差異較大；而在不同來源的同種類乳制品中，細(xì)菌群落多樣性也存在一定的差異性。這與PCoA 分析的結(jié)果一致。

2.7 樣品PICRUSt 功能預(yù)測(cè)分析

PICRUSt 全稱為 “Phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states”。該軟件通過被測(cè)微生物基因組全長(zhǎng)的序列推斷其共同祖先的基因功能，然后根據(jù)Greengenes 數(shù)據(jù)庫(kù)推斷該物種的基因功能，預(yù)測(cè)菌群代謝功能[17]。

圖4 不同類型乳制品中菌群結(jié)構(gòu)UniFrac非加權(quán)主坐標(biāo)分析Fig.4 Unweighted UniFrac principal coordinate analysis of the bacterial communities in the different types of dairy products

圖5 基于Unweighted UniFrac 距離矩陣的UPGMA 聚類分析圖Fig.5 UPGMA cluster analysis graph based on Unweighted UniFrac distance matrix

如表4所示，除RNA 處理與修飾、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動(dòng)力學(xué)、核結(jié)構(gòu)功能、真核細(xì)胞的胞外結(jié)構(gòu)及細(xì)胞骨架缺失之外，另外20 個(gè)基因功能家族均具有數(shù)值。所有樣品中，碳水化合物代謝、翻譯、復(fù)制/重組/修復(fù)、基本功能預(yù)測(cè)及未知功能占比之和為49.84%～50.32%。基本功能預(yù)測(cè)占主導(dǎo)水平，占比為12.08%～12.18%。

表4 COG 功能分類豐度統(tǒng)計(jì)表（%）Table 4 Statistical table of abundance of COG functional classification （%）

3 討論

系統(tǒng)掌握甘肅藏區(qū)牦牛發(fā)酵乳制品的細(xì)菌群落組成，具有一定的科學(xué)價(jià)值。首先，可以確認(rèn)藏區(qū)牦牛發(fā)酵乳制品中的益生菌群，根據(jù)結(jié)果篩選合適的培養(yǎng)基，獲得目標(biāo)細(xì)菌的概率可以改善；其次，確定了不同細(xì)菌菌群在各類傳統(tǒng)乳制品中的比例關(guān)系。

乳酸菌是來自不同動(dòng)物乳中的主要菌群。采用高通量篩選方法，對(duì)牛、羊、水牛和人奶進(jìn)行檢測(cè)的報(bào)告，已經(jīng)確定了乳酸菌reads，該序列占總序列的N40%[18]。Wu 等[19]采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)依賴法，報(bào)道發(fā)酵牦牛奶比新鮮牦牛奶含有更高水平的乳酸菌菌群，且乳酸菌為主要的細(xì)菌。牦牛由于常年生活在高原地區(qū)，它們對(duì)寒冷、低氧、強(qiáng)紫外線的耐受度很高，并且主要食用高原牧草，這些因素可能會(huì)影響其細(xì)菌菌群的組成。

在本研究的3 類傳統(tǒng)牦牛發(fā)酵乳制品中，酸牦牛乳呈現(xiàn)出較高的物種豐度，6 種酸牦牛乳樣品間也存在一定的細(xì)菌菌群差異，這是由于發(fā)酵過程中，原料、環(huán)境因素和其它外部環(huán)境條件變化導(dǎo)致[20]。在門水平上，酸牦牛乳的優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門和變形菌門；而在屬水平上，乳桿菌屬和鏈球菌屬為酸牦牛乳中的高豐度，與國(guó)內(nèi)外發(fā)酵動(dòng)物酸奶（俄羅斯的酸牛奶[21]、意大利的酸驢乳[22]、新疆的酸羊奶[23]）的研究結(jié)果一致。其中，乳桿菌屬為第1 優(yōu)勢(shì)菌屬，豐度高達(dá)78.59%～96.19%，區(qū)別于其它動(dòng)物生乳中乳球菌屬為第1 優(yōu)勢(shì)菌[18]，這是由于乳桿菌屬的耐酸性較強(qiáng)[23]。

Schornsteiner 等[24]發(fā)現(xiàn)奧地利手工硬奶酪的制作工藝和成熟條件影響了樣品的微生物的分類。雖然在曲拉的生產(chǎn)過程中有一個(gè)加熱環(huán)節(jié)，但仍有部分微生物存活了下來。因?yàn)槿榍宓乃峄谥谱髑倪^程中尤為重要。Zhang 等[25]研究曲拉生產(chǎn)過程中微生物的變化，得出酸敗乳清中各菌群的水平均高于乳清液，此時(shí)乳酸菌迅速成為優(yōu)勢(shì)菌群。這是由于酸化后的蛋白質(zhì)中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)比酸化前分布更加均勻，使得微生物更容易吸收。本文所采集的曲拉乳尚未進(jìn)行自然環(huán)境的風(fēng)干，可以將生產(chǎn)中的環(huán)境因素影響降低，更加客觀地得出曲拉微生物的多樣性。

目前，藏靈菇已被證明是一種具有功能性的食品微生物資源[26-28]，國(guó)內(nèi)一些研究人員將重點(diǎn)放在了藏靈菇的微生物區(qū)系調(diào)查上，藏靈菇中的細(xì)菌和真菌以共生平衡的狀態(tài)存在于多糖和蛋白質(zhì)基質(zhì)中[29-30]，在發(fā)酵過程中，藏靈菇顆粒將一定比例的菌群脫落到牛奶培養(yǎng)基中，隨著顆粒的形成，生物量增加；發(fā)酵后，顆粒將從牛奶培養(yǎng)基中回收，可再次發(fā)酵。然而，大多數(shù)細(xì)菌（多達(dá)80%）屬于乳酸菌屬。Zhou 等[31]通過PCR-DGGE 確定了3個(gè)藏靈菇酸奶的優(yōu)勢(shì)菌種和酵母菌種，Gao 等[32]通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，在4 種藏靈菇酸奶中發(fā)現(xiàn)了可培養(yǎng)的細(xì)菌和酵母種類，隨后又通過高通量測(cè)序技術(shù)揭示了這4 種藏靈菇酸奶的細(xì)菌多樣性，共發(fā)現(xiàn)了11 種菌屬，且優(yōu)勢(shì)菌屬為乳酸桿菌屬、乳球菌屬及醋酸菌屬，與本研究得到的優(yōu)勢(shì)菌屬（乳酸桿菌屬、鏈球菌屬）略有不同，這是由于地域及原料奶不同所致。

通過對(duì)樣品進(jìn)行PICRUSt 功能預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，雖然藏區(qū)發(fā)酵乳的來源、類型和細(xì)菌多樣性各不相同，但樣品中各基因功能類似。藏區(qū)采用自然發(fā)酵，添加藏靈菇粒等沿用了數(shù)千年的方法制作酸牦牛乳及曲拉。這使產(chǎn)品具有良好的發(fā)酵特性，并極大的提高了其食用價(jià)值。

4 結(jié)論

采用高通量技術(shù)對(duì)采自甘肅藏區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵酸牦牛乳、曲拉乳、藏靈菇酸奶3 類傳統(tǒng)乳制品進(jìn)行細(xì)菌多樣性分析。在所有樣品中，共檢測(cè)到5 個(gè)菌門、11 個(gè)細(xì)菌菌屬，優(yōu)勢(shì)菌門均為厚壁菌門（Firmicutes）及變形菌門（Proteobacteria），優(yōu)勢(shì)菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）及乳球菌屬（Macrococcus），酸牦牛乳的細(xì)菌豐度高于曲拉乳及藏靈菇酸奶。此外基于PICRUSt 功能預(yù)測(cè)分析表明，基本功能占主導(dǎo)水平，這是甘肅藏區(qū)傳統(tǒng)乳制品中的乳酸菌優(yōu)良性能得以穩(wěn)定延續(xù)數(shù)千年的原因之一。