貯藏過程中阿根廷魷魚生物胺的變化及產(chǎn)胺菌的分離鑒定

李穎暢，曹娜娜，韓 笑，高小溪，沈 琳，勵(lì)建榮*

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州121013 2 大連東霖食品股份有限公司 遼寧大連116101）

生物胺（Biogenic amine，BA）是一類具有生物活性并含有氨基的低分子質(zhì)量有機(jī)化合物的總稱[1]，廣泛存在于食品中，包括海鮮、肉類、乳制品、水果、蔬菜、巧克力、堅(jiān)果和發(fā)酵產(chǎn)品[2]。生物胺的前體物質(zhì)一般是氨基酸，主要是由游離的氨基酸經(jīng)微生物的脫羧作用或經(jīng)氨基酸脫羧酶脫羧產(chǎn)生[3]。陳踴南等[4]以冰鮮金線魚為原料分離鑒定產(chǎn)組胺關(guān)鍵菌，探究金線魚腌制過程中組胺含量的變化規(guī)律，經(jīng)16S rDNA 基因序列法鑒定，馬胃葡萄球菌和蜂房芽孢桿菌是主要產(chǎn)組胺的細(xì)菌。Lakshmanan 等[5]通過分離鑒定魚和蝦在冰藏過程中主要的產(chǎn)胺菌，發(fā)現(xiàn)大部分的產(chǎn)胺菌為革蘭氏陰性菌，如希瓦氏菌屬、假單胞菌屬、黃質(zhì)菌屬、不動(dòng)細(xì)菌屬等，僅有少數(shù)微球菌屬，屬于革蘭氏陽性菌。生物胺的產(chǎn)生受品種、pH 值、溫度、氧氣、水分和外界環(huán)境等多方面的影響，在不同條件下產(chǎn)生的生物胺不同。

阿根廷魷魚（Illexargentinus）肉質(zhì)鮮嫩，蛋白質(zhì)含量高，并且富含多種人體必需氨基酸，滿足人體營(yíng)養(yǎng)需求，深受消費(fèi)者喜愛[6]，是我國(guó)近幾年水產(chǎn)品加工的主要原材料之一，每年可達(dá)到40 萬t[7]。阿根廷魷魚含有豐富的氨基酸和蛋白質(zhì)，極易在貯藏和運(yùn)輸過程中受微生物的影響而產(chǎn)生大量的生物胺，從而導(dǎo)致生物胺中毒現(xiàn)象發(fā)生。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)阿根廷魷魚的研究主要是針對(duì)其內(nèi)源性甲醛的問題，對(duì)其加工過程中產(chǎn)生生物胺的研究較少，關(guān)于魷魚中不同貯藏溫度下的鮮度變化及產(chǎn)胺菌的研究還未見報(bào)道。

本文測(cè)定25 ℃和4 ℃溫度條件下阿根廷魷魚中主要生物胺含量的變化，分離鑒定阿根廷魷魚中的產(chǎn)胺菌的種類，測(cè)定其產(chǎn)生生物胺的能力，為魷魚在貯藏加工中水產(chǎn)品安全質(zhì)量的監(jiān)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿根廷魷魚，錦州市林西路水產(chǎn)市場(chǎng)；生物胺標(biāo)準(zhǔn)品：色胺（Tryptamine，Trp，≥98%）、2-苯乙胺（2-Phenethylamine，2-Phe，≥99.5%）、組胺（Histamine，His，≥97%）、酪胺 （Tyramine，Tyr，≥99%）、亞精胺 （Spermidine，Spm，≥98%）、精胺（Spermine，Spm，≥97%）、丹磺酰氯（99%）、腐胺（Putrescine，Put，≥99%）、尸胺（Cadaverine，Cad，≥97%），美國(guó)Sigma 公司；L-苯丙氨酸（≥97.3%），天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；L-賴氨酸（≥98%）、L-酪氨酸 （98.8%），加拿大BBI Life Sciences 公司；鳥氨酸鹽酸鹽（≥99%）、溴甲酚紫（≥98%），上海麥克林生化科技有限公司；三氯乙酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硫代巴比妥酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，以上試劑均為生物試劑或分析純級(jí)。乙腈、甲醇均為色譜純級(jí)，美國(guó)Fisher Chomical 公司；瓊脂粉、酵母浸粉、蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；LB 營(yíng)養(yǎng)肉湯、平板計(jì)數(shù)瓊脂，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-2030 高效液相色譜、UV-2550 紫外-可見分光光度計(jì)，日本島津公司；PHSJ-3F 實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Multifuge X1R 冷凍高速離心機(jī)，美國(guó)Thermo 公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore 公司；LRH-150 生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FSH-2A 均質(zhì)機(jī)，常州越新儀器制造有限公司；LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；Eppendorf PCR 擴(kuò)增儀，Eppendorf 中國(guó)有限公司；SW-CJ-2FD 潔凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理 阿根廷魷魚 （0.9±0.15）kg，裝入蒸煮袋中置于25 ℃和4 ℃下貯藏。將貯藏在25 ℃下的樣品每隔12 h 取1 次樣，在4 ℃下貯藏的樣品每隔3 d 取1 次樣，各取樣7 次。取樣時(shí)除去頭、皮和內(nèi)臟，只取胴體肌肉用于各保鮮指標(biāo)和生物胺含量的測(cè)定。所有指標(biāo)測(cè)定均取3 個(gè)平行樣品。

1.3.2 生物胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 配制不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按樣品的方法進(jìn)行衍生。以超純水和乙腈為流動(dòng)相于C18柱 （Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C184.6 nm×250 nm，5 μm）上按表1進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，DAD 檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedures

1.3.3 樣品的測(cè)定 取10 g 魚肉，加入20 mL 5%三氯乙酸，經(jīng)均質(zhì)機(jī)均質(zhì)后超聲提取30 min，4℃離心（8 000 r/min）15 min，移出上清液后殘?jiān)?0 mL 5%三氯乙酸再提取1 次，合并上清液，定容至50 mL，過濾。取0.3 mL 濾液，加入100 μL飽和碳酸氫鈉溶液和50 μL 2 mol/L 氫氧化鈉，加入10 mg/mL 丹磺酰氯（Dns-Cl）衍生劑0.3 mL，振蕩混勻，并置于60 ℃水浴30 min，冷卻后加100 μL 25%氨水，25 ℃下于暗處靜置30 min。冷卻后用乙腈定容至1.5 mL，用0.45 μm 有機(jī)濾膜過濾，待測(cè)。

生物胺含量按式（1）計(jì)算。

式中，X——樣品中單組分生物胺含量（mg/kg）；C——由HPLC 法計(jì)算的進(jìn)樣液生物胺質(zhì)量濃度（mg/L）；V——5%TCA 定容體積（mL），在本研究中為50 mL；M——取樣量（g）。

1.3.4 菌落總數(shù)的測(cè)定 參考《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》（GB 4789.2-2016）[8]方法測(cè)定。

1.3.5 TBA 的測(cè)定 參考丁婷等[9]的方法。

1.3.6 pH 值的測(cè)定 參考《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品pH 值的測(cè)定》（GB 5009.237-2016）[10]方法測(cè)定。

1.3.7 產(chǎn)胺菌的分離純化 參考錢茜茜等[11]的方法。從25 ℃阿根廷魷魚樣品中分離得到11 株，按照分離獲得的時(shí)間標(biāo)記為A1～A11，4 ℃分離得到的產(chǎn)胺菌12 株，記為B1～B12，共23 株生物胺產(chǎn)胺菌。在生物胺初篩培養(yǎng)基上純化2 次以上得到純種菌株。

1.3.8 產(chǎn)胺菌產(chǎn)胺能力鑒定 將純化后的細(xì)菌接種于LB 肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，取0.2 mL 菌懸液接種于10 mL 氨基酸LB 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，30℃，160 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)2 d 后，取培養(yǎng)液1 mL，加入1 mL 5%的三氯乙酸，用冷凍離心機(jī)于4℃，12 000 r/min 離心10 min，取1 mL 上清液如1.3.3 節(jié)中樣品處理方法測(cè)定生物胺含量。

1.3.9 基因序列的測(cè)定 將分離篩選的純菌株分別接種到LB 肉湯中，在30 ℃，160 r/min 的搖床中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后吸取1 mL 細(xì)菌培養(yǎng)液，4 ℃，12 000 r/min 離心10 min，棄上清，將細(xì)菌用100 μL 無菌水沖洗至200 μL，于PCR 擴(kuò)增儀上進(jìn)行細(xì)胞破碎，提取細(xì)菌DNA。PCR 擴(kuò)增條件參照PCR Mix 試劑盒說明書中提供的方法，以產(chǎn)胺菌的菌懸液為模板，選用細(xì)菌16S rDNA 通用引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTG G CTCAG-3' 和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3'。擴(kuò)增得到產(chǎn)胺菌的全長(zhǎng)，送至上海生工生物科技有限公司對(duì)擴(kuò)增得到的產(chǎn)胺菌株進(jìn)行測(cè)序。獲得的基因序列由NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST 相似序列檢索和序列比對(duì)。

1.3.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析采用Origin 9.1 和SPSS 19.0，處理結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物胺標(biāo)準(zhǔn)樣品的回歸方程

由圖1可以看出，8 種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品在22 min 內(nèi)得到完全分離，經(jīng)過測(cè)定色胺、2-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、精胺、亞精胺的出峰時(shí)間分別為 7.151，8.811，9.441，10.152，10.656，13.055，13.593，15.62 min，生物胺標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

2.2 生物胺的變化

圖1 生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)品HPLC 圖Fig.1 Chromatogram of biogenic amine mixed standard by HPLC

表2 生物胺標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear regression equations and correlation coefficients of biogenic amine standards

圖2 不同貯藏溫度下阿根廷魷魚生物胺含量的變化Fig.2 Changes of BA in Illexargentinus at different storage temperature

生物胺的產(chǎn)生與水產(chǎn)品的種類、結(jié)構(gòu)、化學(xué)成分有關(guān)，也與水產(chǎn)品的貯藏環(huán)境和貯藏溫度有關(guān)。由圖2可以看出，在貯藏初期，阿根廷魷魚中的苯乙胺、腐胺、尸胺和酪胺都處于較低水平，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，4 種生物胺含量具有明顯增加的趨勢(shì)。在25 ℃貯藏期終點(diǎn)，除苯乙胺外，腐胺、尸胺、酪胺含量均較4 ℃貯藏終點(diǎn)高，苯乙胺、腐胺、尸胺、酪胺終點(diǎn)含量分別達(dá)到44.703，120.683，105.988，114.553 mg/kg，此時(shí)酪胺超過了歐盟的限量標(biāo)準(zhǔn)[12]。在4 ℃貯藏條件下，生物胺變化規(guī)律與25 ℃條件下阿根廷魷魚生物胺的變化規(guī)律相似，在第9 天，阿根廷魷魚中的生物胺含量快速增加，在貯藏第18 天，阿根廷魷魚中苯乙胺、腐胺、尸胺、酪胺分別達(dá)到51.034，119.426，81.708，77.773 mg/kg。

由圖3可以看出，在貯藏初期，阿根廷魷魚中的組胺、精胺和亞精胺都處于較低水平，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，25 ℃和4 ℃貯藏魷魚中組胺、亞精胺、精胺含量緩慢增加。阿根廷魷魚在貯藏末期，組胺分別達(dá)到13.726 mg/kg 和15.7433 mg/kg，在整個(gè)貯藏期間，精胺和亞精胺含量雖然都有升高，但是變化不明顯，且未超過美國(guó)水產(chǎn)品中組胺的含量不得超過50 mg/kg 的限量[13]，表明阿根廷魷魚中游離組氨酸或精氨酸的總體含量較低，或缺乏相應(yīng)的氨基酸脫羧酶，無法產(chǎn)生相應(yīng)的生物胺。在不同貯藏溫度條件下，精胺和亞精胺雖略有波動(dòng)，但是無明顯規(guī)律可循。Kanki 等[14]研究了其它種類水產(chǎn)品中精胺含量的變化，然而變化也無明顯規(guī)律，這可能是由原材料、加工過程以及微生物等多方面因素綜合導(dǎo)致。

2.3 菌落總數(shù)的變化

圖3 不同貯藏溫度下阿根廷魷生物胺含量的變化Fig.3 Changes of BA in Illexargentinus at different temperature

菌落總數(shù)（TVC）是衡量水產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)，微生物的生長(zhǎng)代謝是魚腐敗變質(zhì)的主要原因之一，微生物的生長(zhǎng)代謝會(huì)產(chǎn)生硫化類、醛類、醇類，甚至在氨基酸脫羧酶的作用下產(chǎn)生生物胺[15]。

阿根廷魷魚在不同溫度貯藏期間的菌落總數(shù)變化如圖4所示。在貯藏初期阿根廷魷魚的初始菌落總數(shù)為3.48 lg（CFU/g），新鮮水產(chǎn)品在通常情況下的TVC 在2～4 lg（CFU/g），表明阿根廷魷魚新鮮度良好。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，25 ℃和4℃貯藏溫度下的魷魚TVC 值均呈顯著增加趨勢(shì)，并且25 ℃下菌落總數(shù)增加速率高于4 ℃。在25℃條件下，阿根廷魷魚中的微生物生長(zhǎng)迅速，在第36 小時(shí)TVC 達(dá)到了5.99 lg（CFU/g），在36 h 后菌落總數(shù)生長(zhǎng)變緩，在第3 天達(dá)到7.59 1g（CFU/g）。在4 ℃貯藏條件下，前期TVC 增長(zhǎng)緩慢，在12～18 d 內(nèi)，微生物迅速上升，第12 天時(shí)TVC 達(dá)到5.15 1g（CFU/g），第18 天達(dá)到了7.24 1g（CFU/g），這可能是由于隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，魷魚體自身發(fā)生一定的自溶反應(yīng)，魚體內(nèi)的氨基酸和蛋白質(zhì)進(jìn)一步溶出，從而被微生物所利用。

2.4 TBA 值的變化

硫代巴比妥酸值（TBA）是反應(yīng)脂類氧化的指標(biāo)[16]，水產(chǎn)品的不飽和酸發(fā)生氧化，產(chǎn)生丙二醛等小分子物質(zhì)，發(fā)生酸敗。TBA 值與肉類脂肪氧化程度有很強(qiáng)的相關(guān)性，TBA 值越大，脂肪的氧化程度越高，酸敗就越嚴(yán)重，因此可以用TBA 值代表魚體脂肪氧化程度，以此來作為判斷水產(chǎn)品新鮮度的重要指標(biāo)[17]。

由圖5可以看出，在不同貯藏溫度下，TBA 含量有明顯的上升趨勢(shì)，在25 ℃貯藏的阿根廷魷魚的TBA 值在初期急速上升，中后期增長(zhǎng)緩慢，在第1 天TBA 值就達(dá)到0.717 mg MDA/kg，在第3天TBA 值才達(dá)到0.967 mg MDA/kg；在4 ℃貯藏條件下，阿根廷魷魚中TBA 值在0～6 d 內(nèi)上升較快，后期變化趨于平緩，在第18 天達(dá)到了1.03 mg MDA/kg。一般情況下，魚肌肉中的TBA 值達(dá)1～2 mg MDA/kg 時(shí)便產(chǎn)生難以接受的氣味[18]，而阿根廷魷魚本身屬于低脂水產(chǎn)品，因此TBA 值較其它魚類含量始終保持偏低狀態(tài)。在阿根廷魷魚貯藏末期，25 ℃和4 ℃樣品的TBA 值分別是初始值的4.36 倍和4.02 倍，因此仍可以說明，阿根廷魷魚中油脂氧化，已經(jīng)達(dá)到腐敗程度。

2.5 pH 值的變化

pH 值是通過表示水產(chǎn)品的酸堿程度，反映魚體新鮮程度的一種方法。在魚體死亡之后，在ATP酶的以及產(chǎn)酸微生物的作用下，魚體內(nèi)產(chǎn)生乳酸，從而導(dǎo)致pH 值降低，魚體產(chǎn)生乳酸的能力與魚體本身有關(guān)，不同的魚體產(chǎn)生的乳酸會(huì)有差別。

圖4 不同貯藏溫度下阿根廷魷魚菌落總數(shù)的變化Fig.4 Changes of TVC in Illexargentinus at different temperature

圖5 不同貯藏溫度下阿根廷魷魚TBA 的變化Fig.5 Changes of TBA in Illexargentinus at different temperature

圖6 不同貯藏溫度下阿根廷魷魚pH 值的變化Fig.6 Changes of pH value in Illexargentinus at different temperature

由圖6可以看出，在貯藏初期，不同溫度貯藏下的阿根廷魷魚的pH 值都略有降低，25 ℃貯藏溫度下，阿根廷魷魚在24 h 達(dá)到最低，隨后pH 值迅速上升，在第3 天pH 值為7.00。4 ℃溫度下阿根廷魷魚的pH 值在第6 天降到最低點(diǎn)，而后繼續(xù)上升，有可能是由于微生物生長(zhǎng)活躍，并產(chǎn)生一些酸性代謝產(chǎn)物，之后由于繼續(xù)分解魚體內(nèi)蛋白質(zhì)，產(chǎn)生部分氨類化合物，以及三甲胺等堿性物質(zhì)，而使pH 值繼續(xù)升高[9]。pH 值的測(cè)定受待測(cè)樣品種類以及測(cè)定部位不同所影響，pH 值的變化程度也不同，所以在實(shí)際應(yīng)用中很難得到一個(gè)可以判定腐敗臨界值的pH 值，因此，應(yīng)該結(jié)合其它鮮度指標(biāo)綜合判斷才更有效。

2.6 產(chǎn)胺菌產(chǎn)胺能力鑒定

25 ℃貯藏條件下各菌株產(chǎn)胺能力見表3，由表3可以看出，在25 ℃條件下分離得到11 株產(chǎn)胺菌，產(chǎn)生物胺的能力均比較強(qiáng)，以生物胺產(chǎn)量50 mg/mL 為限量，其中產(chǎn)腐胺的有11 株，產(chǎn)生尸胺的有10 株，產(chǎn)生組胺的有9 株。其中菌A1的產(chǎn)胺能力最強(qiáng)，能夠產(chǎn)生251.08 mg/mL 腐胺、109.64 mg/mL 尸胺和87.98 mg/mL 組胺，其次為產(chǎn)胺菌A4，腐胺、尸胺、組胺的產(chǎn)胺能力分別為231.71，62.34，111.66 mg/mL，產(chǎn)胺菌A6產(chǎn)生腐胺、尸胺、組胺分別為243.30，57.12，105.21 mg/mL，其它8株菌也有較高的產(chǎn)胺能力。

同樣，4 ℃貯藏條件下各菌株產(chǎn)胺能力見表4，由表4可以看出，4 ℃分離得到的產(chǎn)胺菌共12株，均具有一定的產(chǎn)胺能力，其中產(chǎn)腐胺的有5株，產(chǎn)尸胺的菌有6 株，產(chǎn)組胺的菌有6 株，產(chǎn)酪胺的菌有2 株。菌株B1的產(chǎn)胺能力最強(qiáng)，能夠產(chǎn)生509.78 mg/mL 腐胺、196.49 mg/mL 尸胺、165.92 mg/mL 組胺。其次是菌B8，能夠產(chǎn)生219.88 mg/mL腐胺、110.21 mg/mL 尸胺和115.77 mg/mL 酪胺。錢茜茜等[11]分離出腌干魚中的假單胞菌、氣單胞菌、不動(dòng)桿菌、沙門菌屬、弧菌、巴斯德菌等20 株細(xì)菌，并檢測(cè)到這些菌株的產(chǎn)生物胺能力各不相同，其中沙門菌群具有較強(qiáng)的產(chǎn)腐胺、尸胺、組胺和酪胺的能力。Landeta-Cortés 等[19]從黑斑小鯛和大菱坪中分離出莓實(shí)假單胞菌和丁香假單胞菌2 類產(chǎn)組胺菌，在30 ℃下培養(yǎng)24 h 分別能產(chǎn)生組胺（212.5±53.9） mg/mL 和（135.16±35.16） mg/mL，這可能與微生物的繁殖能力以及本身含有的氨基酸有關(guān)?？梢婔滛~中產(chǎn)胺菌的產(chǎn)胺能力受多種因素影響。

2.7 產(chǎn)胺菌的鑒定

阿根廷魷魚在25 ℃和4 ℃條件下貯藏至腐敗時(shí)篩選出的產(chǎn)胺菌共23 株。由表5可以看出，25 ℃條件下，共篩選得到6 個(gè)菌屬的菌株：檸檬酸桿菌屬（Citrobacter freundii，Citrobacter murliniae，Citrobacter braakii）5 株，蜂房哈夫尼亞菌（Hafnia alvei）2 株，成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans）1 株，變形桿菌（Obesumbacterium proteus）1 株，克呂沃爾氏菌（Kluyvera cryocrescens）1 株，克雷伯氏菌（Klebsiella aerogenes）1 株，同種菌屬的菌株產(chǎn)胺能力也略有不同，其中A4、A11產(chǎn)生相同種類的生物胺，且產(chǎn)胺量相似，屬同一菌屬；A1、A3、A5、A8、A9屬同一菌種，也能夠產(chǎn)生相同種類的生物胺，均能產(chǎn)生一定量的腐胺、尸胺、組胺，而產(chǎn)胺量略有不同。

同樣，由表6可以看出，4 ℃貯藏條件下，共篩選得到腸桿菌屬 （Enterobacteriaceae bacterium）1株，檸檬酸桿菌屬（Citrobacter braakii）1 株，克雷伯氏菌（Klebsiella aerogenes）屬1 株，變形桿菌（Obesumbacterium proteus）3 株，哈夫尼菌屬（Hafnia alvei，Hafnia alvei sensu，Hafnia paralvei）6 株共5 個(gè)菌屬的菌株，與25 ℃條件下產(chǎn)生的菌屬類似，而略有差異，其中B5、B6、B8與在25 ℃條件下分離得到的A4和A11屬同種菌株，產(chǎn)胺能力最強(qiáng)，且25 ℃條件下分離得到的菌株的總體產(chǎn)胺能力較4 ℃條件下分離得到的菌株強(qiáng)，這可是由于不同的阿根廷魷魚體以及溫度對(duì)氨基酸脫羧酶活性的差異造成。生物胺產(chǎn)生菌有嗜冷菌和嗜溫菌兩大類，魚體在不同溫度時(shí)的菌相不同，不僅高溫時(shí)產(chǎn)生生物胺，低溫時(shí)也能產(chǎn)生生物胺，只不過低溫時(shí)菌體代謝緩慢，生物胺的產(chǎn)量很少[20]。Torido 等[21]選擇30 ℃和15 ℃下檢測(cè)竹筴魚、秋刀魚等的產(chǎn)組胺菌，發(fā)現(xiàn)30 下可分離出發(fā)光桿菌屬、摩氏摩根菌、副溶血性弧菌，而15 ℃下則分離得到發(fā)光桿菌屬、溶藻弧菌、希瓦氏菌、腸膜明串珠菌。此外，相同種屬的菌株也存在產(chǎn)胺能力間的差異，有研究發(fā)現(xiàn)金槍魚中篩選出的3 株產(chǎn)組胺菌在TSBH 培養(yǎng)基中的產(chǎn)組胺能力不同[22]，推測(cè)是由于微生物的脫羧酶活性受到溫度、pH 值等多種因素影響，因此魚肉中的微生物在氨基酸培養(yǎng)基初篩時(shí)呈現(xiàn)不同的產(chǎn)胺能力，導(dǎo)致不同溫度下的篩選結(jié)果存在差異。

力能胺產(chǎn)株菌各的到得離分中魚魷廷根阿下件條藏貯25 ℃3表storage conditions Results of biogenic amine production ability of each strain isolated from Illexargentinus at 25 ℃Table 3 -1·mL/mg胺物生株菌Spm Spd Tyr His Cad Put Phe Trp號(hào)編dC 8.16±1.03 eB 7.48±0.19 dC 8.82±0.10 cB 87.98±11.54 bB 109.64±3.93 aA 251.08±10.08 eC 7.23±1.04 fD 6.05±0.08 A1 fD 7.31±0.44 eA 9.40±1.77 dA 12.6±0.99 bB 80.90±3.97 cE 59.08±3.79 aD 185.53±15.04 efB 8.74±1.67 gE 5.74±0.25 A2 dB 9.63±0.23 dA 9.89±3.31 dB 9.26±0.72 bC 73.69±2.36 cF 50.96±2.81 aD 172.54±9.27 dB 9.44±1.53 eE 5.59±0.00 A3 dA 13.03±1.02 eB 7.87±0.78 eD 7.87±1.42 bA 111.66±22.61 cE 62.34±1.74 aB 231.71±11.25 eC 7.32±0.23 fD 6.38±0.01 A4 eD 7.19±0.09 eC 7.11±0.01 dC 8.81±0.21 cG 24.65±1.17 bD 79.24±6.04 aE 109.73±3.78 dB 8.98±0.20 dB 8.54±0.98 A5 fD 7.03±0.15 fC 7.36±0.15 dBC 9.18±0.42 bA 105.21±3.95 cE 57.12±2.97 aA 243.30±14.30 deB 8.65±0.32 efC 7.66±0.74 A6 dD 7.25±0.11 dD 7.07±0.31 cC 8.83±0.08 aA 113.14±4.80 cG 8.82±0.53 bF 62.10±2.50 cB 9.06±0.73 cB 8.58±0.82 A7 eD 7.13±0.08 fE 6.76±0.12 dC 8.53±0.04 cD 59.77±3.30 bA 144.2±6.92 aC 206.55±9.96 eC 7.92±0.31 fE 5.69±0.95 A8 dD 7.04±0.00 dBC 7.67±0.72 cC 8.71±0.44 bB 84.53±4.72 bC 93.51±5.24 aA 265.54±8.60 dC 7.75±0.31 eD 6.53±0.68 A9 fD 7.24±0.04 fD 7.13±0.00 eC 8.49±0.36 cF 42.00±8.91 bA 135.16±11.86 aCD 183.05±14.56 dA 11.67±1.65 dA 10.07±0.26 A10 fD 7.23±0.17 fD 7.10±0.15 deC 8.71±0.53 cE 51.11±1.88 bE 62.85±7.45 aC 202.21±8.51 dB 9.19±0.25 BC 8.12±1.02e A11之據(jù)數(shù)列一同示表母字寫大的后值）；數(shù)（P＜0.05異差性著顯在存間之據(jù)數(shù)行一同示表母字寫小的后值；數(shù)胺：精，Spm胺精：亞，Spd胺：酪，Tyr胺：組，His胺：尸，Cad胺：腐，Put胺乙：苯：Phe注）。（P＜0.05異差性著顯在存間

力能胺產(chǎn)株菌各的到得離分中魚魷廷根阿下件條藏貯4℃4表storage conditions Results of biogenic amine production ability of each strain isolated from Illexargentinus at 4 ℃Table 4 -1·mL/mg胺物生株菌Spm Spd Tyr His Cad Put Phe Trp號(hào)編eD 7.07±0.04 eC 7.02±0.07 dD 8.50±0.28 cC 165.92±9.57 bA 196.49±8.17 aA 509.78±4.24 eE 6.89±0.23 fE 5.68±0.19 B1 dC 7.51±0.06 eC 6.83±0.10 dE 7.46±0.03 aB 225.07±13.87 cG 8.47±1.02 bF 45.87±1.66 cC 9.45±0.26 eCD 6.10±0.76 B2 cC 7.98±0.05 cB 7.62±0.03 dF 6.93±0.07 aB 235.91±6.96 cH 7.76±0.61 bF 41.42±2.4 cDE 7.70±0.68 dC 6.57±0.21 B3 dD 6.98±0.00 dC 6.88±0.18 dF 6.58±0.08 aD 87.77±2.08 dH 6.89±0.80 bH 21.05±2.30 cD 7.89±0.22 eD 6.00±0.11 B4 cB 8.44±0.42 dBC 7.36±0.44 eF 6.72±0.26 aA 251.59±8.59 cG 8.58±0.39 bFG 36.76±0.84 cD 8.11±0.16 eC 6.69±0.13 B5 cD 7.17±0.02 cC 6.82±0.09 cF 6.82±0.40 aB 217.99±15.79 cH 7.26±0.64 bH 21.21±0.47 cE 7.21±0.10 dE 5.47±0.09 B6 dB 8.92±0.52 eB 7.49±0.39 bC 33.46±1.7 fE 6.74±0.08 aE 61.16±1.72 bG 34.47±2.45 cB 10.95±0.33-B7 cC 7.98±0.31 dBC 7.31±0.66 bA 115.77±3.39 eE 6.90±0.01 bD 110.21±3.07 aB 219.88±7.15 cdE 7.47±0.21 deB 7.05±0.39 B8 cA 12.15±0.28 dA 8.95±0.15 eE 7.60±0.24 fE 6.60±0.08 aA 192.43±7.28 bE 58.03±1.02 dBC 9.96±0.80 beB 7.98±0.93 B9 dC 7.58±0.48 edB 7.73±0.8 eF 6.62±0.11-aC 125.40±2.67 bC 88.32±1.12 dD 7.93±0.50 cA 9.44±0.61 B10 dBC 8.11±0.48 eB 7.19±0.55 dD 8.39±0.67-aB 151.12±10.52 bD 76.84±2.73 eE 6.91±0.16 cA 9.98±0.39 B11間之據(jù)數(shù)列一同示表母字寫大的后值）；數(shù)（P＜0.05異差性著顯在存間之據(jù)數(shù)行一同示表母字寫小的后值；數(shù)胺：精，Spm胺精：亞，Spd胺：酪，Tyr胺：組，His胺：尸，Cad胺：腐，Put胺乙：苯：Phe注）。（P＜0.05異差性著顯在存

表5 25 ℃下阿根廷魷魚產(chǎn)胺菌的鑒定結(jié)果Table 5 Results of biogenic amine-producing bacteria isolated from Illexargentinus stored at 25 ℃

表6 4 ℃下阿根廷魷魚產(chǎn)胺菌的鑒定結(jié)果Table 6 Results of biogenic amine-producing bacteria isolated from Illexargentinus stored at 4 ℃

3 結(jié)論

阿根廷魷魚中的優(yōu)勢(shì)生物胺為苯乙胺、腐胺、尸胺和酪胺，4 種生物胺含量隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，且貯藏溫度越高，生物胺增長(zhǎng)速率越快，生物胺含量就越高。組胺、精胺和亞精胺在貯藏期間變化不明顯，色胺在貯藏期間無線性規(guī)律變化。這可能與阿根廷魷魚自身氨基酸組成，以及阿根廷魷魚腐敗微生物的種類有關(guān)。在貯藏期間微生物、TBA 值有明顯的上升變化趨勢(shì)，pH 值則是先降低后升高。

通過對(duì)25 ℃和4 ℃貯藏末期的阿根廷魷魚產(chǎn)胺菌進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)胺菌生長(zhǎng)情況各不相同，分離得到的產(chǎn)胺菌產(chǎn)胺能力也有所不同。在25 ℃條件下，篩選得到檸檬酸桿菌屬（Citrobacter freundii，Citrobacter murliniae，Citrobacter braakii）5株，蜂房哈夫尼亞菌（Hafnia alvei）2 株，成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans）1 株，變形桿菌（Obesumbacterium proteus）1 株，克呂沃爾氏菌（Kluyvera cryocrescens）1 株，克雷伯氏菌 （Klebsiella aerogenes）1 株。在4 ℃貯藏條件下，共篩選得到腸桿菌屬（Enterobacteriaceae bacterium）1 株，檸檬酸桿菌屬 （Citrobacter braakii）1 株，克雷伯氏菌屬（Klebsiella aerogenes）1 株，變形桿菌（Obesumbacterium proteus）3 株，哈夫尼菌屬（Hafnia alvei，Hafnia alvei sensu，Hafnia paralvei）6 株，與25 ℃條件下產(chǎn)生的菌屬類似，而略有差異，25 ℃條件下分離得到的菌株產(chǎn)胺能力較4 ℃條件下分離得到的菌株強(qiáng)，這是由于溫度較高導(dǎo)致氨基酸脫羧酶脫羧能力增加，微生物生理活性增強(qiáng)，從而能夠產(chǎn)生更多的生物胺。