多囊泡型二氫楊梅素脂質(zhì)體的制備、表征及其抑菌性能

羅帆，曾丹丹，楊遠(yuǎn)廷，，胡洪超，田允波，王文雄，舒緒剛，，楊富杰

（1 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣東廣州510225； 2 香港城市大學(xué)能源與環(huán)境學(xué)院海洋污染國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，香港999077； 3 廣東省水禽健康育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510225）

引 言

截止至今，細(xì)菌類傳染病已對(duì)全球公共衛(wèi)生安全造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)[1]。隨著細(xì)菌耐藥性的增強(qiáng)，越來(lái)越多的抗生素功效顯著下降[2-3]。超級(jí)細(xì)菌的爆發(fā)已導(dǎo)致大批量人口死亡和輿論恐慌，特別是對(duì)于衛(wèi)生條件差的發(fā)展中國(guó)家[4-5]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，耐藥性細(xì)菌每年可能導(dǎo)致全世界約70 萬(wàn)人死亡。一些學(xué)者預(yù)測(cè)，如果不努力減少細(xì)菌耐藥性或開發(fā)新抗生素，到2050 年，這一數(shù)字將達(dá)到1000 萬(wàn)人[6]。 金 色 葡 萄 球 菌（Staphylococcus aureus, S.aureus）是一種最為常見的人類病原菌，廣泛存在于人體各種組織，從表面如皮膚到深層組織如胃腸道、心臟和骨骼等[7]。S.aureus 在健康的皮膚上不會(huì)引起感染，但在深層組織內(nèi)部或血液卻會(huì)引起各種威脅人體生命安全的疾病，如心內(nèi)膜炎、慢性骨髓炎、肺炎或菌血癥等[8]。令人驚訝的是，S. aureus 可以在入侵和共生這兩種狀態(tài)之間切換，這就導(dǎo)致其無(wú)法完全被免疫系統(tǒng)識(shí)別，難以根除[7]。最新流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)，在20%～40%的調(diào)查人口的鼻黏膜共生菌群中均存在S.aureus[9]。因此，迫切需要尋找一種新的治療策略來(lái)應(yīng)對(duì)日益嚴(yán)峻的S.aureus挑戰(zhàn)。

藤茶是一種傳統(tǒng)的中草藥植物，廣泛生長(zhǎng)在中國(guó)南方。根據(jù)《中草藥》記載，藤茶具有清熱利濕、平肝降壓、活血通絡(luò)等多種功效[10]?，F(xiàn)代臨床實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，藤茶富含一種學(xué)名為二氫楊梅素（dihydromyricetin,DMY）的多酚類黃酮物質(zhì)，其嫩莖和嫩葉中含量高達(dá)30%以上[11]。DMY 的許多生物活性已經(jīng)被證實(shí)，如抗癌、抗炎癥，抗酒精中毒，肝保護(hù)和心臟保護(hù)作用等[12-14]。而最新的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，DMY 對(duì)S.aureus 具有較強(qiáng)的抑菌活性。DMY能與S.aureus細(xì)胞膜上的膜脂肪和蛋白發(fā)生相互作用，導(dǎo)致其構(gòu)象發(fā)生變化，破壞細(xì)胞膜的流動(dòng)性，導(dǎo)致細(xì)菌死亡[15]。然而，DMY 存在水溶性低、生物半衰期短、膜滲透力差等缺點(diǎn)，難以進(jìn)行臨床藥物開發(fā)[16]。Liu 等[17]的研究表明DMY 在大鼠體內(nèi)的口服生物利用度僅為4.02%。因此，尋求一種藥物傳遞載體以提高DMY的生物利用率是必要的。

脂質(zhì)體是一種典型的藥物載體，具有低毒、高生物相容性、低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，可搭載容納各種親水親油藥物或一些小顆粒納米粒子[18]?，F(xiàn)代藥物開發(fā)常在脂質(zhì)體的基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和表面修飾，以制備出具有特異生物學(xué)效應(yīng)的新型脂質(zhì)體，極大地拓展了脂質(zhì)體在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[19]。在所有可用修飾壁材中，聚乙二醇（PEG）聚合物是穩(wěn)定脂質(zhì)體最為成功的材料之一[20]。PEG能夠屏蔽免疫系統(tǒng)的感知，避免脂質(zhì)體被吞噬細(xì)胞吞噬，提高藥物的生物利用率[21]。有趣的是，一些細(xì)菌生物實(shí)驗(yàn)表明，脂質(zhì)體的應(yīng)用能進(jìn)一步提高耐甲氧西林的穩(wěn)定性，并延長(zhǎng)藥物對(duì)S.aureus 的抑菌時(shí)間[22]。

本研究以藤茶為原料，采用水熱提取法提取DMY。以蛋黃卵磷脂為脂質(zhì)體模板，聚乙二醇4000（PEG 4000）為修飾壁材制備多囊泡型二氫楊梅素脂質(zhì)體（DMY-lips），以期解決DMY 水解度低、生物半衰期短、膜滲透力差等問題。采用各種表征方法對(duì)制備的DMY-lips 進(jìn)行系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)表征和形態(tài)觀察，并進(jìn)一步研究其對(duì)S.aureus的抑菌活性、抑菌效率和抑菌機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 試劑與儀器

藤茶采集自中國(guó)廣西壯族自治區(qū)梧州市；PEG 4000（分析純），天津市大茂化學(xué)試劑廠；吐溫80（細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)），阿拉丁試劑（上海）有限公司；膽固醇（＞99%），上海麥克林生化科技有限公司；蛋黃卵磷脂（生物醫(yī)藥級(jí)），艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司；LB 營(yíng)養(yǎng)瓊脂和LB 肉湯，北京索萊寶科技有限公司；金色葡萄球菌（S. aureus）取自本單位生化實(shí)驗(yàn)室。

S22PC 型紫外分光光度計(jì)，上海棱光技術(shù)有限公司；Alpha 1-2 LD Plus 型真空冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Christ公司；Spectrum100型傅里葉紅外光譜儀，美國(guó)PerkinElmer 公司；90 Plus PALS 型納米粒度測(cè)試儀，美國(guó)布魯克海文儀器公司；Tecnai G2 F20 型透視電子顯微鏡，美國(guó)FEI 公司；D8 Advance 型X 射線粉末衍射儀，德國(guó)Bruker 公司；TGA2 型同步熱分析儀，美國(guó)梅特勒-托利多儀器公司；CT-3030 電導(dǎo)率儀，深圳市柯迪達(dá)電子有限公司。

1.2 DMY的提取與純度檢測(cè)

將采集好的藤茶莖葉烘干、粉碎，過(guò)篩，封裝備用。準(zhǔn)確稱取20 g藤茶粉末并溶于400 ml去離子水中，使用2 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)溶液pH=5，并置于100℃水浴提取0.5 h。趁熱過(guò)濾，棄濾渣，將提取液旋蒸濃縮至80 ml，放置4℃冰箱冷藏保存。24 h 后過(guò)濾，棄濾液。將DMY 粗提取物溶于15 ml 無(wú)水乙醇中，過(guò)濾，棄濾渣，再將溶液置于60℃鼓風(fēng)烘干保存6 h 以除去溶劑。將固體樣品溶于80℃熱水中，趁熱過(guò)濾，棄濾渣，待溶液自然冷卻析出結(jié)晶后，即得到純DMY樣品。

精確稱取0.01 g DMY 樣品并溶于100 ml 95%的乙醇中，以獲得濃度為0.1 mg/ ml 的DMY 溶液。使用紫外分光光度計(jì)，在λ＝293 nm 處測(cè)量DMY 的吸光度。DMY 的標(biāo)準(zhǔn)濃度（C）與吸光度（A）線性方程為A=48.3085C-0.00829，R2=0.9988。

1.3 DMY-lips的制備

準(zhǔn)確吸取60 μl吐溫80 和0.02 g PEG 4000 并溶于40 ml 磷酸緩沖溶液（pH=6.5）中，得到水相溶液。另取0.04 g DMY、0.05 g 膽固醇和0.30 g蛋黃卵磷脂并溶于16 ml 無(wú)水乙醇中，充分?jǐn)嚢韬蟮玫接拖嗳芤?。在磁力攪拌機(jī)（300 r/min）的轉(zhuǎn)動(dòng)下，使用5 ml注射器吸取油相（含DMY 相液）溶液并逐滴加入水相中。滴定完成后，將混合溶液置于47℃水浴鍋輕微攪拌（100 r/min）3～4 h 以除去乳濁液中無(wú)水乙醇。待溶液保持恒定體積后，即得到DMY-lips溶液。

1.4 DMY-lips載藥率檢測(cè)

吸取5 ml DMY-lips 溶液于離心管中，6000 r/min 下離心20 min。吸取1 ml 上清液于25 ml 容量瓶中并定容，于λ＝293 nm 處測(cè)量未包覆的DMY 的吸光度。根據(jù)式（1）計(jì)算出載藥率

式中，mtotal為體系中DMY 總質(zhì)量，mg；mfree為體系中未包覆的DMY質(zhì)量，mg；EE為載藥率，%。

1.5 結(jié)構(gòu)表征

采用納米粒度測(cè)試儀（DLS）測(cè)定DMY-lips 的粒徑與Zeta 電位；采用透視電子顯微鏡觀察DMYlips 的微觀形態(tài)與粒徑分布；使用紫外分光光度計(jì)（UV-vis）記錄DMY、空白脂質(zhì)體（Blank-lips）和DMY-lips在260～450 nm范圍內(nèi)的波長(zhǎng)。

采用真空冷凍干燥機(jī)凍干Blank-lips 和DMYlips 溶液，得到相應(yīng)的固體樣品。使用傅里葉紅外光譜儀（FTIR）在4000～450 cm-1范圍內(nèi)對(duì)DMY、Blank-lips 和DMY-lips 進(jìn)行紅外分析；使用X 射線粉末衍射儀（XRD）在10°～80°范圍內(nèi)測(cè)定DMY 和DMY-lips 的結(jié)晶相；在N2的保護(hù)下，通過(guò)同步熱分析儀（TGA）考察DMY、Blank-lips 和DMY-lips 在40～900℃下的熱穩(wěn)定性。

1.6 抗菌測(cè)試

1.6.1 抑菌活性測(cè)定 將0.04 g DMY 加于40 ml 磷酸緩沖溶液（pH=6.5）中，60℃溶解，冷卻，得到1.00 mg/ml的DMY溶液。DMY溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

采用瓊脂擴(kuò)散法，以DMY、Blank-lips 溶液為對(duì)照，研究DMY-lips 對(duì)S.aureus 的抑菌性能[23]。配制25 ml 瓊 脂 培 養(yǎng) 基，高 壓 滅 菌20 min（0.1 MPa，121.5℃）。在無(wú)菌超凈臺(tái)中，將滅菌完的培養(yǎng)基倒入無(wú)菌玻璃培養(yǎng)皿中，冷卻凝固。吸入100 μl S.aureus 菌液于培養(yǎng)基中，涂布均勻。借助打孔器在培養(yǎng)基中鉆出三個(gè)直徑為4 mm 的圓孔，各加入80 μl 藥品，封裝培養(yǎng)皿，然后將培養(yǎng)皿置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，多次實(shí)驗(yàn)后用交叉法測(cè)得抑菌圈的直徑。

1.6.2 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定 將0.04 g DMY 加于40 ml 磷酸緩沖溶液（pH=6.5）中，60℃溶解，冷卻，得到1.00 mg/ml的DMY溶液。DMY溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

以無(wú)菌磷酸緩沖溶液（pH=6.5）為空白對(duì)照組，測(cè)試DMY 和DMY-lips 溶液對(duì)S.aureus 的生長(zhǎng)性能的影響。在無(wú)菌超凈臺(tái)中，吸取20 μl S.aureus菌液（106CFU/ml）于無(wú)菌96孔板孔中，加入80 μl滅菌冷卻完的LB 肉湯液體培養(yǎng)基，輕微搖晃均勻，然后加入100 μl 藥品溶液。將96 孔板封裝后放置37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)期間每隔一段時(shí)間使用酶標(biāo)儀測(cè)定菌液的OD600值。每個(gè)處理平行3次實(shí)驗(yàn)。

1.6.3 最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定 以磷酸緩沖溶液（pH=6.5）為稀釋液，采用二倍稀釋法稀釋得到不同濃度的DMY-lips 溶液。在無(wú)菌超凈臺(tái)中，向6 個(gè)96孔板孔中分別加入20 μl S.aureus菌液（106CFU/ml）和80 μl 滅菌冷卻完的LB 肉湯液體培養(yǎng)基，輕微搖晃均勻后，分別向不同板孔中加入100 μl 不同濃度的DMY-lips 溶液以促使混合菌液中DMY 的最終濃度分別為0、0.05、0.10、0.20、0.30 和0.50 mg/ml。將96 孔板封裝后放置37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)期間每隔一段時(shí)間使用酶標(biāo)儀測(cè)定菌液的OD600值，以細(xì)菌被抑制的最低抑菌劑濃度作為MIC[24]。每個(gè)處理平行3次實(shí)驗(yàn)。

1.6.4 生物掃描電鏡觀察 在無(wú)菌條件下，吸取200 μl S. aureus 菌液（106CFU/ml）和800 μl 滅菌好的LB肉湯液體培養(yǎng)基于干凈的2 ml離心管中，再加入1000 μl 2倍MIC（2 MIC）的DMY-lips溶液。封裝離心管，37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)6 h，3000 r/min 離心10 min，倒去溶液，再加入2 ml 2.5%的戊二醛溶液，4℃冷藏12 h 以固定沉淀在管底的細(xì)菌。倒去固定液，使用磷酸緩沖液（pH=7.0）漂洗樣品三次。用1%的鋨酸溶液固定樣品1～2 h，再用磷酸緩沖液（pH=7.0）漂洗樣品三次，使用乙醇溶液梯度洗脫細(xì)菌樣品，干燥，噴金，采用生物掃描電鏡觀察S.aureus 菌體的形態(tài)變化。

1.6.5 電導(dǎo)率測(cè)定 根據(jù)處理前后菌液電導(dǎo)率變化判定細(xì)菌內(nèi)容物的滲漏情況[25]。準(zhǔn)確吸取4 ml S.aureus 菌液（106CFU/ml）于15 ml 離心管中，3000 r/min 離心10 min 以收集菌體，使用滅菌后的磷酸緩沖溶液（pH=7.2～7.4）清洗三次，并重懸至體積為15 ml。吸取2 ml 菌液于新的5 ml 離心管中，加入2 ml 2 MIC 的DMY-lips 或等量磷酸緩沖溶液（對(duì)照組），37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)0、3 和6 h。取出離心管，5000 r/min 離心10 min。吸取1 ml 上清液并用超純水定容至25 ml，用CT-3030 電導(dǎo)率儀測(cè)量其電導(dǎo)率。每個(gè)處理平行3次實(shí)驗(yàn)。

1.7 穩(wěn)定性測(cè)試

將DMY-lips 儲(chǔ)存于不同溫度（4、25 和37℃）的磷酸緩沖溶液（pH=6.5）中以進(jìn)行為期一個(gè)月的穩(wěn)定性考察[26]。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)階段，每隔一段時(shí)間采用紫外分光光度計(jì)和納米粒度測(cè)試儀測(cè)定DMY-lips的載藥率、粒徑和zeta電位。

2 結(jié)果與討論

2.1 TEM與粒徑分析

本研究所得DMY-lips 的宏觀形態(tài)與微觀結(jié)構(gòu)如圖1 所示。由圖1(a)ⅰ看出，新鮮的DMY-lips 溶液為透明淡黃色。通過(guò)激光筆照射，DMY-lips 溶液出現(xiàn)明顯丁達(dá)爾效應(yīng)[圖1(a)ⅱ]，表明樣品為膠體溶液[27]。利用納米粒度測(cè)試儀測(cè)定DMY-lips 溶液的粒徑分布如圖1(b)，可見DMY-lips 粒徑均一，平均粒徑約為155 nm（PDI= 0.077），zeta 電位為(13.23±1.02)mV。由于DMY-lips外殼受PEG 4000包覆，其能降低粒子間的靜電吸引，避免粒子發(fā)生團(tuán)聚，提高粒子的分散性[28]。采用TEM 觀察DMY-lips 微觀結(jié)構(gòu)如圖1(c)、(d)，發(fā)現(xiàn)DMY-lips 為球狀結(jié)構(gòu)，粒徑低于200 nm，分散均勻，與粒徑測(cè)試結(jié)果一致。圖1(d)中，DMY-lips 被發(fā)現(xiàn)具有雙層結(jié)構(gòu)，脂質(zhì)體內(nèi)含多個(gè)囊泡，這將有利于藥物的負(fù)載與跨膜運(yùn)輸[20,29]。Caddeo等[30]研究發(fā)現(xiàn)PEG不僅有利于磷脂分子排列成小且均一的結(jié)構(gòu)，還能促進(jìn)親脂類黃酮的溶解，從而使其在囊泡內(nèi)被負(fù)載。值得注意的是，UV-vis分析表明，DMY-lips 的載藥率為42.93%，優(yōu)于一般工藝制備的脂質(zhì)體的載藥率（低于10%）[31]。

2.2 UV-vis和FTIR分析

為確定DMY 的成功包覆，對(duì)DMY、Blank-lips和DMY-lips 進(jìn)行UV-vis 和FTIR 分析，如圖2 所示。由圖2(a)發(fā)現(xiàn)，Bank-lips 在260～450 nm 范圍內(nèi)無(wú)明顯吸收峰。與此相反，DMY 在292.35 nm 處存在明顯吸收峰，為其肉桂酰系統(tǒng)能級(jí)躍遷的結(jié)果[32]。在進(jìn)行包覆處理后，由于DMY 的共軛體系發(fā)生改變，肉桂酰系統(tǒng)的吸收峰遷移至323.95 nm[33]。在圖2(b)中，DMY 曲線在3291 cm-1處的吸收峰是由—OH 的伸縮振動(dòng)引起的，而1641 cm-1和1329 cm-1分別為C O 和C—OH 的伸縮振動(dòng)峰[34]。對(duì)于Blank-lips曲線，2923 cm-1和2853 cm-1處的吸收峰為脂質(zhì)體外殼PEG4000 上C—H 的伸縮振動(dòng)，而1737 cm-1和1104 cm-1處吸收峰分別對(duì)應(yīng)C O 和C—O—C 的拉伸振動(dòng)[21,35]。值得注意的是，DMY-lips 的FTIR 譜圖與Blank-lips 整體骨架相似，且不存在DMY 的結(jié)構(gòu)特征峰，表明脂質(zhì)體的包覆方式為物理包覆[36]。而DMY-lips曲線在3423 cm-1處新出現(xiàn)吸收峰，可能與DMY 上的—OH 的伸縮振動(dòng)有關(guān)。因此，結(jié)合UVvis 和FTIR 的分析結(jié)果可初步證實(shí)DMY 的成功包覆。

圖1 DMY-lips的宏觀形態(tài)與微觀結(jié)構(gòu)Fig.1 Morphology and microstructure of DMY-lips

2.3 XRD分析

為進(jìn)一步研究DMY-lips 的結(jié)晶結(jié)構(gòu)特征，對(duì)DMY 和DMY-lips 進(jìn)行XRD 分析，如圖3 所示。由圖3（a）發(fā)現(xiàn)DMY具有一系尖銳且強(qiáng)烈的布拉格峰，與Wang 等[37]報(bào)道的XRD 譜圖一致，說(shuō)明DMY 為晶體化合物。相比之下，DMY-lips 的XRD 譜圖發(fā)生明顯變化[圖3(b)]，并且未發(fā)現(xiàn)任何DMY 特征衍射峰，這可能是由于DMY被包覆到脂質(zhì)體內(nèi)部所致。

2.4 TG和DTA分析

在納米藥物的包裝和儲(chǔ)存中，脂質(zhì)體的熱穩(wěn)定性對(duì)其藥物開發(fā)與研究應(yīng)用關(guān)系重大。因此，使用同步熱分析儀考察DMY、Blank-lips 和DMY-lips 在40～900℃下的熱穩(wěn)定性，如圖4 所示。由圖4（a）可以看出，DMY 的熱分解分為四個(gè)階段，150℃以下的質(zhì)量損失為游離水和結(jié)晶水的蒸發(fā)所致，失重率為12.88%；在150～310℃范圍內(nèi)DMY 的失重率為12.62%，對(duì)應(yīng)的DTA 分解溫度為260.34℃，與Zhang等[38]報(bào)道的DMY 的熔點(diǎn)相近；繼續(xù)升高溫度至380℃，對(duì)應(yīng)的DTA 分解溫度為365.78℃，該階段的質(zhì)量損失（12.08%）可能是由吡喃環(huán)與殘余苯環(huán)之間的C—C 化學(xué)鍵的斷裂導(dǎo)致的[39]。此后，DMY 的失重率隨溫度的升高而增大，900℃下DMY 的總失重率為64.97%。相比之下，Blank-lips[圖4(b)]在150～900℃范圍內(nèi)只存在一個(gè)熱分解階段，對(duì)應(yīng)的DTA 分解溫度為398.27℃，總失重率為100%。值得注意的是，完成包覆處理后DMY-lips的熱分解溫度降至369.99℃[圖4(c)]，這可能是由于DMY 的插入擾動(dòng)脂分子的堆積，導(dǎo)致其協(xié)同度降低，進(jìn)而促使脂質(zhì)體的熱穩(wěn)定降低[40]。此外，相比Blank-lips的總失重率為100%，DMY-lips 在40～900℃范圍內(nèi)的總失重率只有86.97%，也為DMY 的成功包覆提供了證據(jù)。

圖2 DMY-lips的譜圖分析Fig.2 Spectrum analysis of DMY-lips(i)DMY;(ii)Blank-lips;(iii)DMY-lips

圖3 DMY（a）和DMY-lips（b）的XRD譜圖分析Fig.3 XRD patterns of DMY(a)and DMY-lips(b)

圖4 熱穩(wěn)定性分析Fig.4 Thermal stability analysis

2.5 抑菌活性分析

圖5 抑菌分析Fig.5 Bacteriostatic analysis

DMY、Blank-lips 和DMY-lips 對(duì)S. aureus 的抑菌效果如圖5 所示。從圖5(a)～(c)中可以看出，Blank-lips 無(wú)抑菌效果，其培養(yǎng)皿三個(gè)藥孔周圍均存在S. aureus 菌落。而DMY 對(duì)S. aureus 抑菌效果也不明顯，抑菌圈為（8.04 ± 0.57）mm。相比之下，DMY-lips 對(duì)S. aureus 的抑菌效果顯著，抑菌圈為（14.38±0.13）mm，說(shuō)明脂質(zhì)體的包覆使DMY 對(duì)S.aureus 的抑菌活性提升了78.86%。為進(jìn)一步對(duì)比DMY 和DMY-lips 的抑菌活性，使用酶標(biāo)儀測(cè)定DMY 和DMY-lips 處理后S.aureus 生長(zhǎng)曲線，如圖5（d）所示。在無(wú)藥物處理（對(duì)照組）的情況下，S.aureus 遵循對(duì)數(shù)生長(zhǎng)原則，培養(yǎng)24 h 后細(xì)菌生長(zhǎng)趨于平穩(wěn)。當(dāng)與DMY 共培養(yǎng)后，S.aureus 細(xì)菌的生長(zhǎng)受到抑制，但在18 h 后又恢復(fù)正常生長(zhǎng)。這主要是由于S.aureus 存在耐受性，即通過(guò)自身交叉保護(hù)反應(yīng)來(lái)抵抗外界不利的生長(zhǎng)環(huán)境，如酸、冷、抗生素藥物等[41]。值得注意的是，圖5（d）中發(fā)現(xiàn)相比DMY，DMY-lips 不僅表現(xiàn)出更好的抑菌活性，而且具有較長(zhǎng)的抑菌作用時(shí)間。經(jīng)DMY-lips 處理的S.aureus，其生長(zhǎng)狀態(tài)受到明顯的抑制。培養(yǎng)24 h 后，DMYlips 組菌液的OD600值（0.63）顯著低于對(duì)照組（1.11）和DMY 組（1.02）。一些學(xué)者推測(cè)，脂質(zhì)體不僅可以提高親脂性藥物的水溶解度，而且還能幫助藥物穿透細(xì)胞膜并擴(kuò)散到細(xì)菌內(nèi)部[42]。此外，脂質(zhì)體的包覆還能減緩藥物釋放，持續(xù)長(zhǎng)久殺菌，避免細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生耐受性[43]。

2.6 MIC分析

MIC 被解釋為能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥品濃度[24]。圖6顯示不同濃度的DMY-lips處理后的金色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線。OD600值高表示細(xì)菌濃度高，抗菌性能差[24]。對(duì)于空白對(duì)照組（0 mg/ml），S.aureus活菌數(shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，呈對(duì)數(shù)曲線生長(zhǎng)，24 h 的OD600值為1.12。在與DMY-lips 共培養(yǎng)后，S.aureus 的生長(zhǎng)受到抑制，活菌數(shù)生長(zhǎng)速率與數(shù)量不及對(duì)照組。DMY-lips 的濃度越高，S.aureus 的OD600越低，抑菌效果更明顯。S.aureus 經(jīng)DMY-lips 濃度為0.05 mg/ml 和0.10 mg/ml 處理24 h 后的OD600分別為0.92 和0.95，表明DMY-lips 對(duì)S.aureus 的MIC 為0.05 mg/ml。

圖6 不同濃度的DMY-lips處理的金色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線Fig.6 Growth curves of S.aureus treated with different concentration of DMY-lips

2.7 生物掃描電鏡與電導(dǎo)率分析

采用生物掃描電鏡觀察DMY-lips 處理前后S.aureus 菌體的微觀形態(tài)變化，如圖7(a)、(b)所示。未處理的細(xì)菌細(xì)胞表面平坦光滑，形態(tài)完整，球狀結(jié)構(gòu)清晰；相比之下，DMY-lips 處理后的菌體形態(tài)扭曲畸形，表面凹凸不平，細(xì)胞發(fā)生粘連，說(shuō)明DMYlips能破壞S.aureus菌體的細(xì)胞壁，導(dǎo)致細(xì)菌胞內(nèi)原生質(zhì)溶出而死亡。為進(jìn)一步揭示DMY-lips 的抑菌機(jī)理，利用電導(dǎo)率儀測(cè)量處理前后菌液電導(dǎo)率變化判定細(xì)菌的滲漏情況，如圖7（c）所示。與對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)DMY-lips 處理的S.aureus 菌液的電導(dǎo)率顯著提升，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增大。相比對(duì)照組（269.00 μS/cm），經(jīng)DMY-lips 處理6 h 后的S.aureus菌液的電導(dǎo)率提升至309.00 μS/cm，說(shuō)明DMY-lips可以破壞菌體的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，導(dǎo)致胞內(nèi)鉀、鈉離子的泄漏，與生物掃描電鏡觀察結(jié)果一致[15]。

2.8 穩(wěn)定性分析

在三種不同的儲(chǔ)藏溫度下對(duì)DMY-lips 進(jìn)行了為期30 d的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，如圖8所示。由圖8(a)可以看出，4℃冷藏的DMY-lips 溶液依然為淡黃色透明，而25℃和37℃保存的DMY-lips 溶液均變化成白色渾濁乳液，這表明25℃和37℃保存的DMY-lips溶液可能變得不穩(wěn)定。為進(jìn)一步研究脂質(zhì)體的載藥性能，采用納米粒度儀和紫外分光光度計(jì)測(cè)定三種DMY-lips 的載藥率、顆粒大小、zeta 電位，如圖8(b)～(d)所示。與4℃保存的DMY-lips 溶液的載藥率、顆粒大小、zeta 電位保持相對(duì)穩(wěn)定不同，25℃和37℃保存的DMY-lips 溶液發(fā)生明顯變化。25℃保存的DMY-lips 溶液的載藥率從39.82%下降至14.15%、顆粒大小從108.42 nm 增大至178.96 nm、zeta 電位從-12.46 mV 變化至-5.60 mV，而37℃保存的DMYlips 溶液的載藥率從39.59%下降至10.05%、顆粒大小 從108.26 nm 增 大 至204.04 nm、zeta 電 位 從-12.49 mV 變化至-2.17 mV。這可能是因?yàn)楦邷丶铀倭酥|(zhì)體的水解和氧化，與Liu等[36]報(bào)道的結(jié)果一致。因此，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明低溫更有利于DMY-lips的完整性保存。

圖7 抑菌機(jī)理分析Fig.7 Antibacterial mechanism analysis

3 結(jié) 論

多囊泡型脂質(zhì)體作為藥物載體可有效提高DMY的水溶解度和膜滲透度，充分發(fā)揮其對(duì)S.aureus抑菌性能。通過(guò)生物掃描電鏡和電導(dǎo)率測(cè)試發(fā)現(xiàn)，DMYlips可以破壞S.aureus的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，導(dǎo)致菌體胞內(nèi)原生質(zhì)泄漏而死亡。利用PEG 4000進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以促使磷脂形成粒徑均一、分散均勻的脂質(zhì)體，有利于增強(qiáng)載藥脂質(zhì)體的穩(wěn)定性和壽命。聚乙醇化脂質(zhì)體的包覆能夠緩解藥物的過(guò)快釋放，延長(zhǎng)DMY的抑菌作用時(shí)間，避免S.aureus產(chǎn)生耐受性（耐藥性）。與其他化學(xué)抗生素相比，DMY-lips具有生物與環(huán)境友好、有序可控等優(yōu)勢(shì)，在未來(lái)納米結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和抗菌藥物開發(fā)中具有巨大潛力。

圖8 不同溫度儲(chǔ)藏一個(gè)月后DMY-lips的穩(wěn)定性Fig.8 Stability of DMY-lips stored at different temperatures for one month