臘梅花精油的GC-MS分析及抗炎作用研究

戴文敬，羅 超，余惠凡，趙萬紅

(1. 湖北醫(yī)藥學院基礎(chǔ)醫(yī)學院，湖北十堰 442000)

臘梅系臘梅科臘梅屬植物，臘梅花藥用價值和保健價值很高，并且安全無毒，可食用，其香氣獨特。李時珍在《本草綱目》中說：“臘梅花味甘、微苦，采花炸熟，水浸淘凈，油鹽調(diào)食”，既是味道頗佳的食品，又能解熱生津[1]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，臘梅屬植物具有抗氧化、抗菌、抗炎、降血糖、降血脂、抗癌等作用[2-5]。臘梅花提取物可顯著增強大鼠巨噬細胞的吞噬活性和體液免疫功能[6]。臘梅根部(鐵筷子)醇提物可以有效抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)腫脹，并發(fā)現(xiàn)這可能與血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和血小板活化因子(PAF)水平的降低有關(guān)[7]。

已有文獻對重慶北碚區(qū)的臘梅花精油進行GC-MS分析[8]，但對十堰地區(qū)臘梅花精油成分的分析還未見報道。本研究所用的臘梅花精油是由湖北巴山食品有限公司與西南大學聯(lián)合制備，利用超臨界CO2萃取(supercritical fluid CO2extraction, SFE-CO2)、膜分離濃縮等技術(shù)提取制備，保留了臘梅花大部分的活性成分。本研究對臘梅花精油成分進行GC-MS分析，并基于動物實驗對其抗炎作用進行初步研究，為臘梅花資源的開發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器弗氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant, FCA)購自美國SIGMA公司，生產(chǎn)批號SLBW7430；阿司匹林泡騰片購自阿斯利康制藥有限公司，生產(chǎn)批號1710001；大鼠白介素1β(IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(生產(chǎn)批號CQN8FWKD7M)及大鼠TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(生產(chǎn)批號DRHY7MQPPF)均購自Elabscience公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。GCMS-TQ8040型三重四極氣質(zhì)聯(lián)用儀購自島津企業(yè)管理(中國)有限公司；C18小柱，Sep-Pak Vac 35cc(10 g)(零件號WAT043345，批號042238171A)、固相萃取裝置(型號FB65453，序號152601)購自Fisher Scientific公司。

1.2 實驗動物SD大鼠購自湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(鄂)2016-0008，實驗動物使用許可證號SYXK(鄂)2016-0031，并飼養(yǎng)于湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心，自由攝食和飲水，室內(nèi)溫度25 ℃左右，相對濕度為60%～70%。SPF級SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g。本研究所涉及的動物實驗相關(guān)操作均已通過動物倫理委員會的批準。

1.3 GS-MS分析

1.3.1臘梅花精油及處理臘梅花精油(由湖北巴山食品有限公司提供，8%水溶性提取物，含水量92%左右，每毫升精油提取自25.4 g鮮花，相對密度0.994，pH 3.5～4.2，透光率90%～95%)。將臘梅花精油樣品利用固相萃取，C18小柱濃縮，甲醇洗脫后，得到一種黃色具有臘梅花自然香氣的液體。用甲醇稀釋后過濾、離心，加入氣相色譜樣品瓶中。

1.3.2氣相色譜條件色譜柱：Rtx-5MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。程序升溫條件：初始溫度40 ℃，保持5.0 min，以3 ℃/min的速率升至250 ℃，保持5 min，再以20 ℃/min的速率升至300 ℃，保持3 min；柱箱溫度40 ℃；進樣口溫度250 ℃；進樣模式為分流；壓力49.5 kPa；總流量26.0 mL/min；柱流量1.00 mL/min；線速度36.1 cm/s；吹掃流量5.0 mL/min ； 分流比20.0 ； 載氣為氦氣 ； 進樣量1 μL。

質(zhì)譜條件如下：電離方式為EI，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度280 ℃，溶劑延遲4.5 min，ACQ方式Scan，掃描速度769 amu/s，掃描范圍40～400 amu。

1.4 造模[9]及分組SPF級SD大鼠72只，隨機分為空白對照組、模型組、陽性對照組(阿司匹林200 mg/kg)及臘梅花精油低、中、高劑量組(0.1、0.3、0.8 g/kg)。陽性對照組給予阿司匹林灌胃處理，臘梅花精油低、中、高劑量組分別給予0.1、0.3、0.8 g/kg臘梅花精油10 mL/kg灌胃處理，空白對照組和模型組給予等量蒸餾水灌胃處理，每日1次。于第5天灌胃后30 min，對各組大鼠右側(cè)足跖皮下注射FCA 0.1 mL，空白對照組給予生理鹽水0.1 mL。觀察并用排水法[10]測量致炎前及致炎后1、2、3、5、24、48、72 h大鼠足趾體積，計算各時間點大鼠足趾腫脹率。腫脹率=(致炎后各時間點足容積-致炎前足容積)/致炎前足容積×100%。

1.5 足部腫脹組織炎癥因子的檢測致炎后72 h，將大鼠麻醉后處死，分別取下致炎側(cè)足部腫脹組織，用冰PBS清洗、稱重后將組織剪碎，液氮中快速充分研磨至粉末狀，加入對應(yīng)體積的PBS，超聲進一步粉碎， 離心后取上清，按照ELISA試劑盒操作說明檢測腫脹組織中TNF-α和IL-1β的含量。

1.6 足部腫脹組織病理學觀察致炎后72 h，將大鼠麻醉后灌流，剪下致炎側(cè)足趾，小心取下腫脹組織進行固定，脫水、石蠟包埋、切片，染色后鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料均以均數(shù)±標準差表示。經(jīng)正態(tài)性檢驗及方差齊性檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和重復(fù)測量資料的方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 臘梅花精油化學成分的GS-MS鑒定情況通過GC-MS聯(lián)用儀，將臘梅花精油按照1.3.2項中的GC-MS分析條件進行鑒定，通過儀器自帶的NIST08s.LIB和NIST08.LIB譜圖庫檢索，再結(jié)合有關(guān)文獻資料，并按照峰面積歸一法進行定量分析，計算出了精油中各種成分的相對含量。最終確定從超臨界CO2萃取的臘梅花精油中共鑒定出48種香氣成分，其中，醇類25 種(占64.42%)、酯類4 種(占9.27%)、醛類2種(占11.62%)，其他類17種(占13.06%)；相對含量在1%以上的成分有18種，占總含量的83.86%(表1)，由此構(gòu)成臘梅花香氣的主要成分(圖1、表1)。

圖1 GC-MS聯(lián)用儀檢測超臨界CO2萃取臘梅花精油的總離子流圖

表1 超臨界CO2萃取臘梅花精油的GC-MS分析結(jié)果

續(xù)表1

2.2 對FCA致足趾腫脹的影響與空白對照組相比，模型組和臘梅花精油低、中、高劑量組及陽性對照組在注射FCA后足趾腫脹率均升高，在注射FCA后72 h腫脹率達最高；與模型組相比，臘梅花精油低劑量組在注射FCA后僅5、48 h時對大鼠足趾腫脹有明顯抑制作用，而臘梅花精油中劑量組在注射FCA后1、3、5、24、48 h時對大鼠足趾腫脹均有明顯抑制作用，臘梅花精油高劑量組在注射FCA后1、2、3、5、24、48 h時對大鼠足趾腫脹均有明顯抑制作用(P<0.05或P<0.01，圖2)。

2.3 足部腫脹組織中炎癥因子的變化與空白對照組相比，模型組TNF-α、IL-1β均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組相比，臘梅花精油3個劑量組和陽性對照組的TNF-α均明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，表2)。與模型組相比，臘梅花精油中、高劑量組和陽性對照組大鼠腫脹組織中IL-1β明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01，表2)。

圖2 臘梅花精油對FCA所致大鼠足趾腫脹的影響

表2 臘梅花精油對FCA誘導(dǎo)的大鼠腫脹組織中TNF-α、IL-1β含量的影響

2.4 足部腫脹組織的病理變化空白對照組大鼠足部腫脹組織中未見明顯的中性粒細胞浸潤；模型組在皮下結(jié)締組織、肌層、血管周圍都有大量的炎細胞浸潤，并以中性粒細胞為主；臘梅花精油低、中、高劑量組在皮下結(jié)締組織、血管周圍均有大量炎細胞浸潤，但肌肉組織炎細胞浸潤不明顯，并且隨著臘梅花精油劑量的升高，炎細胞浸潤程度降低；陽性對照組在皮下結(jié)締組織有大量炎細胞浸潤，但血管周圍、肌肉組織等部位浸潤程度較輕(圖3)。

3 討 論

本研究應(yīng)用GC-MS聯(lián)用分析超臨界CO2萃取所提取十堰地區(qū)臘梅花精油，共鑒定出48個香氣成分，其中醇類25種(占64.42%)、酯類4種(占9.27%)、醛類2種(占11.62%)。這與文獻報道的重慶北碚區(qū)臘梅花精油的香氣成分有所不同，重慶北碚區(qū)臘梅花精油共鑒定出57種香氣成分[8]，兩者醇類含量相當(67.30%)，且十堰地區(qū)臘梅花精油醇類種數(shù)多于重慶北碚區(qū)臘梅花精油(重慶北碚區(qū)臘梅花精油醇類17種)，這可能是因為不同的產(chǎn)地、氣候等因素對臘梅花化學成分有一定影響。

圖3 FCA致炎后72 h各組大鼠足部腫脹組織的HE染色結(jié)果

FCA在注入大鼠足部數(shù)小時后，注射側(cè)的足部開始出現(xiàn)紅腫，并明顯腫脹而形成原發(fā)性病變。通過弗氏完全佐劑所致原發(fā)性足腫脹實驗制作模型并干預(yù)[9]，發(fā)現(xiàn)臘梅花精油對急性炎癥早期的毛細血管擴張、血管通透性增加和炎癥滲出、水腫有明顯抑制作用，并且其抗炎作用具有劑量依賴性。

在正常生理情況下，機體內(nèi)的TNF-α、IL-1β等炎癥介質(zhì)主要對組織起保護作用，但在炎癥過程中，免疫細胞如巨噬細胞和單核細胞等會釋放大量的促炎因子，從而造成免疫系統(tǒng)損傷，出現(xiàn)紅、腫、熱、痛等癥狀[11-14]。其中，TNF-α在炎癥反應(yīng)過程中有重要作用，其不僅在炎癥反應(yīng)中出現(xiàn)最早，并且能夠激活中性粒細胞和淋巴細胞，使血管內(nèi)皮細胞通透性增加，調(diào)節(jié)其他組織代謝活性并促進其他細胞因子的合成和釋放，從而推動炎癥反應(yīng)的進程[15-16]。FCA皮下注射可產(chǎn)生局部炎癥，出現(xiàn)發(fā)紅、腫脹、發(fā)熱等癥狀，造成TNF-α、IL-1β等的釋放增加，出現(xiàn)足部腫脹，局部炎細胞浸潤增加[17]，并在致炎后72 h其同側(cè)脊髓組織中TNF-α的表達最高[18]。本研究檢測了不同劑量的臘梅花精油對FCA致炎后72 h的大鼠足部腫脹組織中TNF-α、IL-1β含量的影響，同時通過足部病理變化觀察局部炎細胞的浸潤情況，結(jié)果表明，臘梅花精油各劑量組具有抗炎作用，其抗炎作用的發(fā)揮與抑制TNF-α和IL-1β的分泌有關(guān)。

綜上所述，臘梅花精油對大鼠弗氏完全佐劑所致原發(fā)性病變的炎癥模型具有明顯抑制作用，為民間使用臘梅花以及十堰地區(qū)臘梅花資源的開發(fā)利用提供了藥理學基礎(chǔ)，但其抗炎作用的機制仍未完全闡明，有待進一步研究。本研究中所使用的臘梅花精油富集了臘梅花大部分的有效成分，但其成分比較復(fù)雜，發(fā)揮抗炎作用的具體成分，還需要進行更深入的研究。