Rb熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)構(gòu)建及檢測(cè)能力評(píng)估

王 博，楊澤健，張 妙，田碧霞，宋少苒，孫 偉，高小倩，周 燦，劉培軍

(1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，陜西西安 710061；2. 陜西省腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710061；3.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科，陜西西安 710061)

Rb基因即視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因(retinoblastoma gene)，是發(fā)現(xiàn)最早、并被鑒定出的抑癌基因。Rb基因的突變可導(dǎo)致眼部惡性視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，在隨后的研究中不斷地發(fā)現(xiàn)在其他腫瘤組織中常處于突變狀態(tài)，包括常見的小細(xì)胞肺癌、乳腺癌以及視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤等[1-2]。Rb蛋白主要通過參與細(xì)胞周期的調(diào)控從而發(fā)揮其抑癌作用[3]，但其功能的失活將影響細(xì)胞周期的調(diào)控，從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。盡管如此，但Rb在癌癥中持續(xù)性丟失的分子和細(xì)胞基礎(chǔ)仍不十分清楚[4]。因此，構(gòu)建一種易于檢測(cè)的報(bào)告基因系統(tǒng)對(duì)于研究Rb基因與腫瘤發(fā)生的關(guān)系和篩選靶向治療藥物具有重要意義。

報(bào)告基因(reporter gene)是一類可以編碼熒光蛋白或酶，從而將看不見的底物轉(zhuǎn)化為發(fā)光或彩色產(chǎn)物的一類基因，是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域基礎(chǔ)研究的一個(gè)重要工具，廣泛應(yīng)用于檢測(cè)細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)。通過在報(bào)告基因上附加元件來調(diào)節(jié)報(bào)告基因的活性，利用光學(xué)成像技術(shù)實(shí)時(shí)報(bào)告其表達(dá)的位置或水平，使了解疾病的分子基礎(chǔ)和體外藥物研發(fā)成為可能[5]。本實(shí)驗(yàn)選擇以熒光素酶作為報(bào)告基因構(gòu)建Rb檢測(cè)系統(tǒng)，為深入研究腫瘤的發(fā)生機(jī)制，促進(jìn)腫瘤的靶向治療研究提供有效工具。

本研究通過經(jīng)典的分子克隆技術(shù)，構(gòu)建出含有特異性Rb反應(yīng)元件的Rb報(bào)告基因載體，使其轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞并篩選穩(wěn)定表達(dá)Rb的單克隆細(xì)胞株，最終在該報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)中通過監(jiān)測(cè)Rb的激活和抑制作用評(píng)估該系統(tǒng)的檢驗(yàn)效能，為Rb基因表達(dá)產(chǎn)物的活性檢測(cè)提供可靠的依據(jù)，也為Rb基因異常的靶向治療研究和療效評(píng)估提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料基因序列合成Rb反應(yīng)元件(擎科生物科技有限公司)；高速高保真PCR酶(TaKaRa公司)；XhoⅠ、HindⅢ內(nèi)切酶(NEB公司)；DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒和E.coliDH5α宿主菌(天根生化科技有限公司)；pGL6-TA報(bào)告基因載體(碧云天生物技術(shù)有限公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(康寧公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；X-tremeGENE HP轉(zhuǎn)染試劑(Roche公司)；T4連接酶、Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega公司)；CDK4/6抑制劑Palbociclib(Selleck公司)。人腎上皮細(xì)胞系HEK293由西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心進(jìn)行保種。

1.2 報(bào)告基因pGL6-Rb-Luc載體的構(gòu)建按照經(jīng)典的分子克隆方法，將Rb反應(yīng)元件克隆到報(bào)告基因載體中，形成Rb熒光素酶報(bào)告基因載體，該載體具體結(jié)構(gòu)見圖1。將Rb反應(yīng)元件序列通過PCR儀緩慢降溫，最終退火形成具有黏性末端的雙鏈DNA序列(表1)。PCR儀退火程序的反應(yīng)體系：Rb反應(yīng)元件上游序列和下游序列各2 μL，5 ×Annealing Buffer 10 μL，ddH2O 36 μL；PCR儀中緩慢降溫進(jìn)行退火程序。從菌液中提取報(bào)告基因pGL6-TA質(zhì)粒，再通過XhoⅠ和HindⅢ 37 ℃雙酶切2 h，凝膠電泳后膠回收純化載體pGL6-TA的雙酶切產(chǎn)物。使用T4連接酶將雙酶切產(chǎn)物和退火產(chǎn)物進(jìn)行DNA連接，再運(yùn)用熱激法將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)，37 ℃培養(yǎng)1 h后涂布LB平板(氨芐青霉素Amp抗性)，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜，其中需要分別設(shè)置ddH2O為陰性對(duì)照組以及對(duì)照質(zhì)粒pUC19為陽性對(duì)照組。次日觀察單克隆菌落生長(zhǎng)情況，挑單克隆并進(jìn)行液體培養(yǎng)擴(kuò)增。對(duì)液體培養(yǎng)起來的菌液再進(jìn)行菌液PCR鑒定，鑒定上游引物5′-CTAGCAAAATAGGCTGTCCC-3′，下游引物5′-CCCGCGCGCCACCCCTC-TGGCGCCACCGTG-3′。對(duì)菌液PCR鑒定陽性克隆，送其質(zhì)粒至測(cè)序公司進(jìn)行鑒定，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)后命名比對(duì)序列完全正確的載體為pGL6-Rb-Luc。

表1 Rb反應(yīng)元件和TA啟動(dòng)子序列

1.3 質(zhì)粒pGL6-Rb-Luc轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞將pGT6-TA和pGL6-Rb-Luc菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，分別提取無內(nèi)毒素的對(duì)照載體pGT6-TA和Rb報(bào)告基因載體pGL6-Rb-Luc。將人腎上皮HEK293細(xì)胞按照合適的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)6孔板中，并使用完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。接種細(xì)胞24 h后，將X-tremeGENE HP轉(zhuǎn)染試劑分別與質(zhì)粒pGT6-TA和pGL6-Rb-Luc進(jìn)行混合，靜置后分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞。

1.4 Rb報(bào)告基因穩(wěn)定表達(dá)單克隆細(xì)胞株的篩選細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，加入終質(zhì)量濃度為1 mg/mL的遺傳霉素對(duì)細(xì)胞進(jìn)行抗性篩選，要求每2 d換1次新鮮的抗性培養(yǎng)基，并持續(xù)篩選2周以上以便得到穩(wěn)定表達(dá)的單克隆細(xì)胞。將該部分混合克隆進(jìn)行細(xì)胞消化，通過分選型流式細(xì)胞儀分選單細(xì)胞并正常抗性培養(yǎng)，對(duì)生長(zhǎng)起來的單克隆細(xì)胞隨后進(jìn)行正常傳代、擴(kuò)大培養(yǎng)，并命名穩(wěn)定表達(dá)對(duì)照質(zhì)粒pGT6-TA的單克隆細(xì)胞株為HEK293-Luc，穩(wěn)定表達(dá)Rb報(bào)告基因質(zhì)粒pGL6-Rb-Luc的單克隆細(xì)胞株為HEK293-Rb-Luc。

1.5 報(bào)告基因細(xì)胞株HEK293-Rb-Luc激活作用的檢測(cè)將上述構(gòu)建好的對(duì)照細(xì)胞株HEK293-Luc和報(bào)告基因細(xì)胞株HEK293-Rb-Luc細(xì)胞消化后，分別細(xì)胞計(jì)數(shù)并按相同細(xì)胞密度接種96孔板。待孔板中細(xì)胞貼壁后，更換無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h。隨后添加胎牛血清進(jìn)行血清刺激培養(yǎng)，分別在0、6、12、24 h不同時(shí)間點(diǎn)，檢測(cè)相對(duì)應(yīng)的熒光素酶發(fā)光值，并設(shè)置5個(gè)復(fù)孔/組。

1.6 報(bào)告基因細(xì)胞株HEK293-Rb-Luc抑制作用的檢測(cè)按照上述同樣的條件和方法接種細(xì)胞，接種24 h后撤除血清饑餓培養(yǎng)24 h。隨后同時(shí)加入血清和濃度分別為0、25、50、75和100 nmol/L的CDK4/6抑制劑Palbociclib[6]共同刺激細(xì)胞12 h，按照上述相同的方法檢測(cè)發(fā)光值，并設(shè)置5個(gè)復(fù)孔/組。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差，各組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組內(nèi)兩兩比較采用LSD(t)檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 構(gòu)建Rb報(bào)告基因載體pGL6-Rb-Luc將退火反應(yīng)后雙鏈具有黏性末端的Rb反應(yīng)元件連接至雙酶切報(bào)告基因pGL6 -TA載體多克隆位點(diǎn)區(qū)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后挑取單克隆進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)挑取的每個(gè)菌液進(jìn)行菌液PCR鑒定。PCR反應(yīng)后產(chǎn)物通過15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，PCR產(chǎn)物大小為153 bp，與理論插入Rb反應(yīng)元件序列大小相同(圖2)。將菌液PCR鑒定陽性的菌液送公司進(jìn)行測(cè)序分析，再將測(cè)序結(jié)果通過在線的BLAST(NCBI)進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果表明陽性克隆插入序列與Rb反應(yīng)元件序列相一致，故已成功構(gòu)建Rb報(bào)告基因載體pGL6-Rb-Luc。

圖2 報(bào)告基因載體pGL6-Rb-Luc的菌液PCR鑒定結(jié)果

2.2 構(gòu)建Rb報(bào)告基因穩(wěn)定表達(dá)單克隆細(xì)胞株HEK293-Rb-Luc將報(bào)告基因?qū)φ蛰d體pGL6-TA和Rb報(bào)告基因載體pGL6-Rb-Luc分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，再通過G418抗性篩選以及流式細(xì)胞儀分選單細(xì)胞培養(yǎng)，故已獲得穩(wěn)定表達(dá)報(bào)告基因的對(duì)照單克隆細(xì)胞株HEK293-Luc以及穩(wěn)定表達(dá)Rb報(bào)告基因的單克隆細(xì)胞株HEK293-Rb-Luc。先將這兩株單克隆細(xì)胞株撤除血清饑餓處理，再回補(bǔ)血清進(jìn)行刺激，在不同時(shí)間點(diǎn)分別檢測(cè)熒光素酶的活性。結(jié)果顯示，恢復(fù)血清培養(yǎng)6、12、24 h后HEK293-Rb-Luc細(xì)胞中熒光素酶的活性顯著升高，相比于0 h的HEK293-Rb-Luc組熒光素酶活性分別升高了5.2、18.9和9.8倍，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖3)。

圖3 血清刺激不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)HEK293-Rb-Luc單克隆細(xì)胞的作用

而對(duì)照細(xì)胞HEK293-Luc在血清刺激后的6、12、24 h，熒光素酶活性與0 h相比無顯著性變化，即組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。該結(jié)果說明構(gòu)建的HEK293-Rb-Luc可以有效的檢測(cè)Rb活化，故已成功篩選出檢測(cè)Rb活化的熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)。

2.3 驗(yàn)證Rb熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)的檢測(cè)能力使用CDK4/6抑制劑Palbociclib檢驗(yàn)Rb熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)的檢測(cè)能力，將HEK293-Rb-Luc細(xì)胞株撤除血清處理24 h后,再加入血清和0、25、50、75、100 nmol/L的CDK4/6抑制劑Palbociclib后共同培養(yǎng)12 h檢測(cè)相應(yīng)的熒光素酶活性。結(jié)果顯示，與未加血清組相比，恢復(fù)血清培養(yǎng)后各組的熒光素酶活性顯著升高，其中加入0 nmol/L CDK4/6抑制劑Palbociclib組的熒光素酶活性升高20.1倍；在同時(shí)添加血清和CDK4/6抑制劑Palbociclib的幾組中，相比于0 nmol/L Palbociclib組，其余各組熒光素酶的活性均顯著降低，Rb活性的抑制率在25 nmol/L Palbociclib組為6.90%，在50 nmol/L Palbociclib組為40.23%，在75 nmol/LPalbociclib組為50.57%，在100 nmol/L Palbociclib組為62.07%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.001，圖4)。通過檢測(cè)恢復(fù)血清對(duì)HEK293-Rb-Luc細(xì)胞株Rb基因的激活作用和CDK4/6抑制劑Palbociclib對(duì)Rb基因的抑制作用，結(jié)果說明已構(gòu)建的Rb熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)HEK293-Rb-Luc細(xì)胞株可以精準(zhǔn)、有效地檢測(cè)Rb活性從而反映Rb活化程度。

圖4 CDK4/6抑制劑Palbociclib對(duì)HEK293-Rb-Luc單克隆細(xì)胞株的抑制作用

3 討 論

細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(cyclin-dependent kinases, CDK)是磷酸化Rb蛋白的主要激酶，在細(xì)胞G1末期細(xì)胞周期蛋白介導(dǎo)CDK與Rb蛋白三者相互作用形成復(fù)合物，進(jìn)而讓CDK磷酸化Rb蛋白，使得Rb蛋白釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F；E2F進(jìn)入細(xì)胞核后，可以轉(zhuǎn)錄激活一系列周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，包括二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase, DHFR)、胸苷激酶(thymidine kinase, TK)、胸苷酸合成酶(thymidylate synthase, TS)、DNA聚合酶α(DNA polymerase, POL)、CDC2、cyclin E、cyclin A和E2F1等，這些周期相關(guān)蛋白的表達(dá)使得細(xì)胞從G1期移型至S期[4,7]。Rb蛋白的磷酸化狀態(tài)一直維持到細(xì)胞完成分裂并進(jìn)入到下一個(gè)細(xì)胞周期時(shí)，Rb再次去磷酸化并結(jié)合到E2F上[8]。同時(shí)，Rb蛋白還可以通過參與p16/Rb信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞老化現(xiàn)象，是因?yàn)镻16INK4A通過抑制CDK4/6對(duì)Rb蛋白的磷酸化，使得E2F和Rb蛋白結(jié)合無法入核發(fā)揮其功能，最終阻止細(xì)胞進(jìn)入S期，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的老化[9]。但目前關(guān)于Rb的活性形式仍然存在一些爭(zhēng)議。DOWDY等[10]發(fā)現(xiàn)，Rb在G1早期被cyclin D和CDK4/6單磷酸化，表現(xiàn)出優(yōu)先的E2F結(jié)合模式，但在G1晚期，cyclin E和CDK2通過磷酸化使Rb失活，發(fā)生DNA損傷反應(yīng)的細(xì)胞激活cyclin D和Cdk4/6，產(chǎn)生單磷酸化Rb，調(diào)控全局轉(zhuǎn)錄，而分化的細(xì)胞則利用未磷酸化的Rb。

特異性分子靶向藥物具有治療靶點(diǎn)明確，治療效果明確以及對(duì)正常組織損傷較小等特點(diǎn)，故近年來被廣泛應(yīng)用到腫瘤臨床治療中[11]。Rb通路與癌癥發(fā)展之間的密切聯(lián)系表明，Rb活性狀態(tài)的調(diào)控可能被用于開發(fā)靶向治療[12]。較多的研究發(fā)現(xiàn)在幾乎所有惡性腫瘤中CDK-Rb-E2F通路都發(fā)現(xiàn)了顯著的變化，目前最新的CDK4/6抑制劑可使細(xì)胞周期恢復(fù)正常，并在治療雌激素受體陽性乳腺癌中得到了很好地應(yīng)用[4,13]。然而，導(dǎo)致臨床上部分患者對(duì)CDK4/6抑制劑耐藥的因素尚不清楚。CONDORELLI等[14]研究中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者暴露于帕博西林或瑞博西林后反而出現(xiàn)了Rb基因的突變，但這些突變是如何在CDK4/6抑制劑的選擇壓力下出現(xiàn)的仍有待進(jìn)一步研究。腫瘤對(duì)靶向藥物的耐藥性也可能與非典型的Rb通路有關(guān)[12,15]。也有研究發(fā)現(xiàn)，Rb重新激活讓晚期腫瘤經(jīng)重編程后轉(zhuǎn)向轉(zhuǎn)移能力較弱的細(xì)胞狀態(tài)，但是由于MAPK通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的適應(yīng)性重新連接而不能夠阻止癌細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)[3]。生物體內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是一個(gè)復(fù)雜的聯(lián)動(dòng)過程，分子靶向治療在關(guān)注某一生物分子的靶向作用時(shí)，容易因忽視整個(gè)機(jī)體對(duì)藥物的反應(yīng)而產(chǎn)生更多的不良反應(yīng)[16]。

腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中Rb及其相關(guān)通路尚不完全明晰、分子靶向治療依然存在的缺陷，都使得探明腫瘤的發(fā)生機(jī)制、尋找更精準(zhǔn)有效的治療方法顯得尤為重要。而報(bào)告基因作為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域基礎(chǔ)研究的常用工具，也是有效靶點(diǎn)前期篩選的重要步驟。目前常見的熒光素酶、各種不同顏色的熒光蛋白以及β半乳糖苷酶等報(bào)告基因應(yīng)用最為廣泛，而其中熒光素酶報(bào)告基因相比其他報(bào)告基因具有靈敏度高、檢測(cè)效率高、操作方便等優(yōu)勢(shì)[17]。

本研究通過構(gòu)建帶有Rb反應(yīng)元件序列的報(bào)告基因載體pGL6-Rb-Luc，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，通過G418抗性篩選出穩(wěn)定表達(dá)Rb報(bào)告基因的單克隆細(xì)胞株HEK293-Rb-Luc，并使用血清刺激和CDK4/6抑制劑Palbociclib檢驗(yàn)HEK293-Rb-Luc的激活和抑制作用。相比于0 h，恢復(fù)血清培養(yǎng)6、12、24 h后HEK293-Rb-Luc細(xì)胞中熒光素酶的活性分別升高了5.2、18.9和9.8倍。相比于0 nmol/L Palbociclib組，25、50、75和100 nmol/L的CDK4/6抑制劑Palbociclib使Rb活性的抑制率分別達(dá)到6.90%、40.23%、50.57%和52.07%。因此，本研究已成功構(gòu)建并篩選出Rb熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)HEK293-Rb-Luc，且能夠高效特異地檢測(cè)Rb的活化水平。