CpG1826 對(duì)重組新型冠狀病毒亞單位疫苗的協(xié)同免疫增強(qiáng)效果研究

楊宏宏 沈錢通 李思奇 安彤 于鵬程 張?jiān)?徐凱 陳彥霖 陳剛 高孟 莊昉成

1 杭州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院310053； 2 中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病研究所， 北京102206； 3 浙江普康生物技術(shù)股份有限公司，杭州310053

新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，該病毒致病性強(qiáng)可引起重癥肺炎并導(dǎo)致死亡，是當(dāng)前嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題[1-2]，而接種疫苗是目前針對(duì)新型冠狀病毒防控的主要措施之一。 在候選疫苗中， 重組亞單位疫苗因其具有安全性高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)勢(shì)而受到廣大研究者關(guān)注，但該類疫苗需要佐劑增強(qiáng)免疫原性[3]。傳統(tǒng)鋁佐劑作為世界范圍內(nèi)應(yīng)用最廣泛的人用疫苗佐劑[4]，已經(jīng)在抗HPV和HBV 疫苗中發(fā)揮重要作用[5-6]。 鋁佐劑通過延緩抗原釋放和降低抗原降解并刺激天然免疫細(xì)胞來發(fā)揮佐劑作用[7-8]，然而鋁佐劑更偏向誘導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答，而對(duì)誘導(dǎo)Th1 類免疫應(yīng)答的能力較弱[9]。為了克服鋁佐劑疫苗的缺陷，考慮開發(fā)聯(lián)合佐劑以提高疫苗的免疫效力。CpG ODN 是一種含非甲基化的寡聚脫氧核苷酸基序，能夠通過激活DC 或巨噬細(xì)胞的Toll 樣受體，提高亞單位疫苗的Th1 應(yīng)答[10-12]。根據(jù)CpG 基序的不同，已有多種CpG 被證明具有很好的免疫佐劑作用，如1826 和1018 等。 本研究旨在以CpG1826作為協(xié)同佐劑，評(píng)價(jià)其與鋁佐劑對(duì)大腸埃希菌表達(dá)的SARS-CoV-2 亞單位疫苗的協(xié)同免疫增強(qiáng)效果。

材料與方法

一、材料

原核表達(dá)載體pET28a 和大腸埃希菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞由浙江省醫(yī)學(xué)生物工程疫苗研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒提取、膠回收等常規(guī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑盒以及辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG、HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 購(gòu)自北京康維世紀(jì)生物科技有限公司； 蛋白Marker 購(gòu)自上海雅酶生物科技有限公司；CpG1826 由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成（5'-TCCATGACGTTCCTGA CGTT-3'，全硫代修飾）；鋁佐劑（氫氧化鋁）購(gòu)自丹麥的Croda 公司；SARS-CoV-2 的S 蛋白兔單克隆抗體購(gòu)自北京義翹神州生物技術(shù)有限公司； 競(jìng)爭(zhēng)性ELISA 檢測(cè)中和抗體試劑盒購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司； 小鼠IFN-γ 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（ELISPOT）試劑盒購(gòu)自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；SARS-CoV-2 的S 蛋白多肽庫(kù)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；Vero-E6 細(xì)胞和SARS-CoV-2毒種由中國(guó)CDC 病毒病研究所保存；清潔級(jí)BALB/c小鼠（試驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：20170005023355），4～8 周齡，所有動(dòng)物在浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)[SYXK（浙）2018-0012]。

二、大腸埃希菌表達(dá)的sRBD 亞單位抗原的制備

根據(jù) GenBank SARS-CoV-2 的基因序列（MN908947.3），選取其刺突蛋白上的受體結(jié)合區(qū)（RBD）基因，按照大腸埃希菌密碼子偏好進(jìn)行優(yōu)化，委托北京擎科生物進(jìn)行人工基因合成，所得合成基因在N 端引入組氨酸標(biāo)簽后插入pET28a表達(dá)質(zhì)粒， 得到重組表達(dá)載體pET28a-HIS-RBD，經(jīng)熱激法轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞得到重組表達(dá)菌株。 所得重組表達(dá)菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，離心收集菌體，在冰浴下超聲破碎菌體，提取包涵體沉淀。 所得包涵體沉淀用尿素溶液變性重懸溶解后， 經(jīng)Ni-NTA 純化系統(tǒng)純化， 用透析液進(jìn)行透析、 過濾除菌， 即為所需SARS-CoV-2 RBD（sRBD）重組抗原。

三、sRBD 亞單位抗原的免疫印跡鑒定

將純化的重組sRBD 蛋白經(jīng)SDS-PAGE 分離后，通過電轉(zhuǎn)印法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，脫脂奶粉封閉后加入SARS-CoV-2 的S 蛋白兔單克隆抗體（1∶1 000），37 ℃孵育1 h 后洗膜3 次， 加入HRP標(biāo)記羊抗兔抗體 （1∶1 000），37 ℃孵育30 min 后洗膜3 次，最后加ECL 顯色、拍照。

四、動(dòng)物小鼠免疫

將BALB/c 小鼠隨機(jī)分成3 組， 鋁佐劑疫苗組（sRBD 蛋白20 μg/只，氫氧化鋁佐劑250 μg/只）、CpG+鋁佐劑疫苗組（sRBD 蛋白20 μg/只，CpG1826 10 μg/只，氫氧化鋁佐劑250 μg/只）、空白 對(duì)照組（CpG1826 10 μg/只， 氫氧化鋁佐劑250 μg/只），每組18 只小鼠，雌雄對(duì)半。 具體免疫程序?yàn)殚g隔1周腹腔免疫，共免疫3 針。 在首針免疫7、14 和28 d后，每組分別取免疫小鼠6 只（雌雄對(duì)半），取血分離血清，同時(shí)處死取脾淋巴細(xì)胞。

五、間接ELISA 法測(cè)定小鼠血清結(jié)合抗體效價(jià)

用包被液稀釋至終濃度1 μg/mL 的sRBD 蛋白包被96 孔板，4 ℃包被過夜。洗板后用含有1%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸鹽吐溫緩沖液封閉。 將血清用含1% BSA 的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）按梯度3 倍稀釋，每個(gè)稀釋度血樣作3 個(gè)復(fù)孔加至96 孔板中，同時(shí)以稀釋液作為陰性對(duì)照。 37 ℃孵育1 h，洗板3次后加入HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 酶標(biāo)抗體（1∶30 000），37 ℃孵育30 min，洗板3 次后加TMB 顯色液顯色。用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔OD450值， 以陰性對(duì)照OD450均值的2.1 倍為cut-off 值， 以O(shè)D450均值高于cut-off 值的最大稀釋倍數(shù)作為血清結(jié)合抗體效價(jià)。

六、競(jìng)爭(zhēng)性ELISA 法測(cè)定小鼠血清結(jié)合抗體水平

所得小鼠血清稀釋150 倍后， 參照競(jìng)爭(zhēng)性ELISA 中和抗體檢測(cè)試劑盒說明書， 與等體積HRP偶聯(lián)的SARS-CoV-2 RBD 蛋白混合，37 ℃孵育30 min。隨后將混合液加入預(yù)包被ACE-2 蛋白的96孔板，每個(gè)小鼠血清設(shè)置2 個(gè)復(fù)孔，37 ℃孵育15 min，同時(shí)以稀釋液作為陰性對(duì)照。 酶標(biāo)儀于450 nm 處測(cè)定各孔OD 值。 小鼠血清結(jié)合抗體水平通過血清抗體對(duì)RBD 蛋白與ACE-2 細(xì)胞受體蛋白之間結(jié)合能力的競(jìng)爭(zhēng)性抑制來實(shí)現(xiàn)， 具體計(jì)算方法如下：血清中和抗體=（1-樣品孔OD 均值/陰性對(duì)照孔OD均值）×100%。

七、活病毒血清中和抗體的測(cè)定

小鼠血清用含DMEM 培養(yǎng)基作連續(xù)倍比稀釋[1 ∶（4 ～256）]， 分 別 與SARS-CoV-2 病 毒 液（2×103CCID50/mL）按體積比1∶1 混勻，37 ℃孵育1 h。所得病毒抗體混合液分別接種于長(zhǎng)滿單層Vero-E6細(xì)胞的96 孔板中，每個(gè)血清稀釋度設(shè)置2 個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置病毒原液陽性對(duì)照孔及DMEM 培養(yǎng)液的陰性對(duì)照孔，用顯微鏡觀察各孔細(xì)胞病變情況。 抗體效價(jià)以能中和相應(yīng)病毒而阻止細(xì)胞病變的血清最高稀釋度計(jì)算。

八、免疫小鼠特異性IFN-γ 檢測(cè)

對(duì)小鼠實(shí)施頸椎脫臼，無菌條件下取脾臟制備淋巴細(xì)胞懸液并稀釋至5×106個(gè)細(xì)胞/mL。將制備的淋巴細(xì)胞懸液接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，用SARS-CoV-2 RBD 多肽作為刺激物，按ELISPOT試劑盒說明書檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞中特異性分泌IFN-γ 的效應(yīng)T 細(xì)胞數(shù)。

九、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.2.1 軟件處理相關(guān)數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用x±s 表示，組間差異用單因素方差分析， 組間兩兩比較采用SNK 法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、 重組蛋白sRBD 的表達(dá)、純化與鑒定

所得重組菌經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)在相對(duì)分子質(zhì)量為28 000 處有一條特異性條帶，相對(duì)分子質(zhì)量大小與理論值相符（圖1），免疫印跡結(jié)果顯示該特異性條帶能被SARS-CoV-2 的S 蛋白兔單克隆抗體特異性識(shí)別（圖2）。

圖1 SARS-CoV-2 重組蛋白R(shí)BD 在大腸埃希菌中表達(dá)的SDS-PAGE 分析

圖2 SARS-CoV-2 重組蛋白R(shí)BD 的Western 印跡法分析

二、 CpG1826 對(duì)免疫小鼠血清結(jié)合抗體效價(jià)的影響

1.采用間接ELISA 檢測(cè)免疫小鼠血清結(jié)合抗體效價(jià)

表1 可見，首針免疫7、14 和28 d 后，3 組小鼠特異性血清IgG 水平的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=7.643、10.010 和21.440，P 均<0.01）。在首針免疫14 d后（即二針免疫7 d 后），鋁佐劑疫苗組和CpG+鋁佐劑疫苗組的特異性結(jié)合抗體水平均高于對(duì)照組（t=3.877 和5.534， P 均<0.01）， 但是鋁佐劑疫苗組和CpG+鋁佐劑疫苗組之間的結(jié)合抗體水平差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.583， P>0.05）。 在首針免疫28 d 后（即三針免疫14 d 后），CpG+鋁佐劑疫苗組的特異性結(jié)合抗體水平高于鋁佐劑疫苗組 （t=2.892，P<0.05）。

表1 免疫后小鼠特異性血清IgG 水平檢測(cè)

2.競(jìng)爭(zhēng)性ELISA 法測(cè)定小鼠血清結(jié)合抗體水平結(jié)果

如表2 所示，在首針免疫7、14 和28 d 后，三組間 差 異 均 有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義 （F=15.790、19.920 和159.400，P 均<0.01）；其中首針免疫7 d 后，鋁佐劑疫苗組和對(duì)照組均未產(chǎn)生結(jié)合抗體， 而CpG+鋁佐劑疫苗組已產(chǎn)生結(jié)合抗體，與鋁佐劑疫苗組存在顯著差異（t=4.185，P<0.01）；首針免疫14 d 后（即二針免疫7 d 后）， 鋁佐劑疫苗組和CpG+鋁佐劑疫苗組的結(jié)合抗體水平均高于對(duì)照組 （t=6.823 和5.251，P 均<0.01），且CpG+鋁佐劑疫苗組的結(jié)合抗體水平高于鋁佐劑疫苗組（t=3.267，P<0.01）；首針免疫28 d 后 （即三針免疫14 d 后）， 鋁佐劑疫苗組和CpG+鋁佐劑疫苗組的結(jié)合抗體水平均隨時(shí)間推移而提升，且兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.441，P<0.05）。

表2 免疫后小鼠血清結(jié)合抗體抑制率的測(cè)定

三、CpG1826 對(duì)免疫小鼠血清中和抗體水平的影響

對(duì)首針免疫28 d 后（即三針免疫14 d 后）的小鼠血清進(jìn)行活病毒中和試驗(yàn)，結(jié)果顯示，3 組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=8.470， P<0.01）；與對(duì)照組相比，鋁佐劑疫苗組和CpG+鋁佐劑疫苗組的小鼠活病毒血清中和抗體幾何平均滴度 （GMT） 分別為8.00±5.06 和65.33±51.70，均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生明顯的中和抗體（t=3.873 和3.095， P 均<0.05），且CpG+鋁佐劑疫苗組的中和抗體水平高于鋁佐劑疫苗組 （t=2.703，P<0.05）。

四、CpG1826 對(duì)免疫小鼠特異性IFN-γ 水平的影響

通過ELISPOT 檢測(cè)免疫后小鼠脾淋巴細(xì)胞特異性IFN-γ 分泌水平， 結(jié)果如圖3 所示， 首針免疫7、14 和28 d 后（即首針免疫7 d 后、二針免疫7 d后、三針免疫14 d 后），三組間效應(yīng)T 細(xì)胞數(shù)均存在顯著差異（F=25.360、36.990、660.400，P 均<0.01），3次檢測(cè)中CpG+鋁佐劑疫苗的小鼠脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的特異性IFN-γ 效應(yīng)T 細(xì)胞數(shù)分別為179.68±69.26、395.58±139.64、563.50±43.79，均高于鋁佐劑疫苗組（t=3.969、5.292 和22.310，P 均<0.01）。 隨著免疫次數(shù)的增加， 相較于鋁佐劑疫苗組，CpG+鋁佐劑疫苗組小鼠脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性IFN-γ 的效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)上升更快，增加更加顯著。

圖3 ELISPOT 檢測(cè)免疫小鼠特異性IFN-γ 水平

討 論

CpG ODN 作為一種良好的疫苗佐劑，其在體內(nèi)被Toll 樣受體9（TLR9）識(shí)別后，通過一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，直接或間接刺激各種免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，促進(jìn)Th1 型為主的免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)體液和細(xì)胞免疫水平[12-13]。 Dou 等[14]發(fā)現(xiàn)CpG ODN 作為佐劑與禽白血病病毒抗原gp85 配伍后免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后， 相比弗氏佐劑，CpG ODN 能夠顯著提高其血清中禽白血病抗體水平， 為CpG ODN 的體液免疫效應(yīng)提供了科學(xué)依據(jù)；Fu 等[15]認(rèn)為不同序列的CpG ODN 作為佐劑能夠有效提高滅活的H5N1 型禽流感病毒疫苗的細(xì)胞免疫應(yīng)答， 可顯著提高IL-6、IL-12 和TNF-α 等Th1 型細(xì)胞因子相對(duì)表達(dá)量，為CpG ODN 增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答提供了理論基礎(chǔ)。目前已有CpG1018 作為佐劑成功應(yīng)用于上市的乙型肝炎疫苗， 這為CpG ODN 的臨床安全性奠定了良好的基礎(chǔ)[16]。

本研究表明， 將SARS-CoV-2 亞單位疫苗與自行設(shè)計(jì)的對(duì)免疫細(xì)胞有刺激作用的CpG1826、鋁佐劑配伍后免疫小鼠，小鼠血清的IgG 水平、結(jié)合抗體水平、中和抗體水平均顯著高于單用鋁佐劑的疫苗組，且其小鼠血清的結(jié)合抗體水平上升早于單用鋁佐劑的疫苗組，說明CpG1826 作為協(xié)同佐劑，其與鋁佐劑對(duì)大腸埃希菌表達(dá)的sRBD 亞單位抗原的協(xié)同免疫增強(qiáng)作用， 可以加速機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答，縮短sRBD 蛋白結(jié)合抗體的產(chǎn)生時(shí)間，有效提高機(jī)體的中和抗體水平。 同時(shí)，CpG1826 特有的免疫刺激途徑，能在短時(shí)間內(nèi)（首針免疫7 d 后）激活機(jī)體產(chǎn)生高水平的Th1 型細(xì)胞免疫應(yīng)答，顯著提升機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)sRBD 的特異性IFN-γ 的效應(yīng)T 細(xì)胞水平。Th1 途徑免疫應(yīng)答的激活，能增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫反應(yīng)，能刺激產(chǎn)生特異性的細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞殺傷反應(yīng)，這對(duì)清除宿主體內(nèi)已感染病毒的細(xì)胞很有意義。

綜上所述，增強(qiáng)免疫刺激、平衡Th1/Th2 型免疫應(yīng)答的CpG1826 可以彌補(bǔ)單純應(yīng)用鋁佐劑的不足。 CpG1826 有望成為一種SARS-CoV-2 亞單位疫苗的候選佐劑，提升疫苗的免疫增強(qiáng)效果，提高機(jī)體的抗感染保護(hù)作用， 然而CpG1826 作為SARSCoV-2 亞單位疫苗佐劑真正應(yīng)用于臨床還有很長(zhǎng)的路要走， 包括符合藥用輔料級(jí)別的CpG1826 的制備、安全性評(píng)價(jià)等，都需要進(jìn)一步研究和完善。 此外，CpG1826 作為佐劑所產(chǎn)生的疫苗抗體持久性也應(yīng)該是研究關(guān)注的焦點(diǎn)，對(duì)此我們正進(jìn)一步探索。

利益沖突 本文利益各方就知識(shí)產(chǎn)權(quán)分配已達(dá)成一致，無利益沖突