紅霉素對煙草煙霧暴露肺氣腫小鼠肺組織樹突狀細胞33D1及共刺激分子CD40、CD80、CD86表達的影響

張龍舉，劉曉麗，杜 飛，李云飛，王 菊

(1.遵義市第一人民醫(yī)院/遵義醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，貴州 遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科一病區(qū)，貴州 遵義 563000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD,簡稱慢阻肺)是全球危害人類健康、導致死亡的一種常見疾病。目前研究認為，COPD是一種由吸煙誘發(fā)的，T淋巴細胞、樹突狀細胞(Dendritic Cells,DCs)等多種細胞及細胞因子參與的炎性反應與異常的自身免疫應答相關(guān)的疾病，COPD的主要發(fā)病機制是基于對吸入有毒顆?；驓怏w的先天性或適應性免疫反應[1]。巨噬細胞、中性粒細胞、DCs、B細胞、CD4+和CD8+T細胞通常被認為是主要的效應細胞[2-5]，但DCs作為目前最重要的抗原遞呈細胞，由它啟動的獲得性免疫應答過程在COPD發(fā)病機制中的作用了解甚少，DCs是目前已知功能最強大的抗原遞呈細胞，被認為是機體免疫應答的始動者，能夠顯著刺激初始T細胞活化增殖與分化，誘導特應性細胞免疫應答反應，隨著人們對COPD免疫炎性反應發(fā)病機制的深入研究，也開始關(guān)注DCs在COPD中可能的發(fā)病機制。本研究擬通過觀察樹突狀細胞在肺氣腫小鼠模型中的表達情況以及紅霉素干預的效應，為臨床慢阻肺防治提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組：取SPF級健康BALB/C小鼠40只[購自揚州大學比較醫(yī)學中心，許可證號：SCXK(蘇)2017-0007]，體重為(22 ± 4)g，鼠齡6～8周，飼養(yǎng)于本院實驗動物中心；隨機分為四組，每組10只。分別為空白對照組、模型組、紅霉素預防組和紅霉素治療組。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學倫理委員會同意。

1.2實驗試劑與儀器：自制有機玻璃煙熏艙1個(規(guī)格55cmx45cmx35cm)；黃果樹牌香煙，每支煙草含焦油量12 mg，煙堿含量1.1 mg；紅霉素腸溶膠囊(購自重慶天圣制藥股份有限公司)；小鼠33D1單克隆抗體(購自美國SANTA CRUZ 生物技術(shù)公司)；CD40、CD80、CD86熒光定量PCR試劑盒(日本takara公司)；SYBR? Premix Ex Taq(購自Takara公司，RR820A，即SYBR green溶液)PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(購自Takara公司，RR047A，即逆轉(zhuǎn)錄試劑盒)；RNAiso Plus(購自Takara，9108，即Trizol)；氯仿(Trichloromethane，購自上海阿拉丁生化，C128130);異丙醇(isopropanol，購自上海阿拉丁生化，I112011);乙醇(ethanol，購自上海阿拉丁生化，E111989)；DEPC(Diethyl pyrocarbonate，購自上海阿拉丁生化，D105557);Stepone plus 熒光定量PCR(ABI);PCR儀(ABI，Veriti);Nano drop 2000(購自Thermo fisher公司)。

1.3實驗方法與步驟

1.3.1小鼠肺氣腫模型的建立及紅霉素干預方法：將小鼠隨機分為四組，每組10只。分別為空白對照組、模型組、紅霉素預防組和紅霉素治療組。模型組、 紅霉素預防組、紅霉素治療組給予煙熏24周建立小鼠肺氣腫模型，紅霉素預防組從第20周開始給予紅霉素(80 mg/kg)灌胃進行預防性干預治療共4周；紅霉素治療組從第25周開始給予紅霉素(80 mg/kg)灌胃治療共4周然后處死小鼠。

1.3.2肺組織取材檢查:實驗結(jié)束，各組大鼠麻醉后處死，取出肺組織，常規(guī)石蠟包埋切片, HE 染色觀察小鼠肺內(nèi)炎癥浸潤情況 ；免疫組化檢測各組肺組織樹突狀細胞33D1的表達；在光學顯微鏡下觀察肺組織中樹突狀細胞33D1陽性細胞數(shù)。

1.4熒光定量PCR檢測小鼠肺組織DCs共刺激分子CD40、CD80、CD86mRNA的表達：取小鼠肺組織約0.5 g剪碎，按照RNAiso Plus說明書的步驟提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒并參照其步驟逆轉(zhuǎn)錄總RNA為cDNA，采用熒光定量PCR試劑盒并嚴格按照說明書的步驟進行定量PCR反應，RT-PCR引物序列見表1。以GADPH為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCt算法對各組mRNA表達量進行分析。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1氣道炎性反應病理學觀察：肺組織切片的蘇木精-伊紅染色,鏡下可見空白對照組肺泡形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，氣管及血管周圍未見炎性細胞浸潤，模型組可見小鼠氣道黏膜固有層中性粒細胞、淋巴細胞浸潤,氣道黏液分泌增多，氣管及血管周圍大量炎性細胞浸潤以中性粒細胞、淋巴細胞為主，肺泡壁破碎，形成肺大皰，紅霉素預防組和紅霉素治療組的兩組炎性反應明顯減輕，表明紅霉素預防治療后得到緩解表現(xiàn)出一定的療效。 見圖1。

空白對照組：肺泡形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，氣管及血管周圍未見炎細胞浸潤；模型組：大量炎性細胞浸潤，肺泡壁破碎，形成肺大皰;紅霉素預防組：肺組織病理改變較模型組減輕;紅霉素治療組： 支氣管周圍炎性細胞浸潤較模型組組減少圖1 肺組織病理學改變(蘇木精-伊紅染色)

2.2小鼠肺組織樹突狀細胞33D1抗原的表達：空白對照組33D1幾乎未表達，模型組 33D1陽性表達明顯增多。紅霉素干預后預防組和治療組 33D1 表達均明顯減少,與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.01),而紅霉素預防組和治療組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2、圖 3。

2.3熒光定量PCR檢測小鼠肺組織DCs共刺激分子CD40、CD80、CD86mRNA的表達：與對照組相比，模型組肺組織中DCs共刺激分子CD40、CD80、CD86mRNA明顯增多，紅霉素干預后表達下降，但仍高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

模型組肺組織 33D1表達高, 紅霉素預防組和治療組表達均有減少圖2 肺組織中 33D1表達(免疫組化 ABC法染色 )

a：與正常對照組相比，P<0.05；b：與模型組相比，P<0.05圖3 肺組織中每200倍視野 33D1陽性細胞數(shù)表達

a:與對照組相比，P<0.01;b:與對照組比較，P<0.05;c:與模型組比較，P<0.01;d:與模型組比較，P<0.05圖4 小鼠肺組織DCs共刺激分子CD40、CD80、CD86mRNA的表達

3 討論

目前認為，COPD是一種由吸煙誘發(fā)的，樹突狀細胞、T淋巴細胞等多種細胞參與的炎性反應與異常的自身免疫應答相關(guān)的疾病，煙草煙霧暴露是導致COPD最重要的發(fā)病因素，煙草煙霧提取物和尼古丁能夠影響DCs的成熟和功能[6]，但目前研究結(jié)論不一。除了DCs外，研究表明，COPD肺組織中DCs共刺激分子也是增高的,Freeman等研究表明，COPD肺組織DCs共刺激分子CD40、CD80、CD86、CD83明顯增高，并且與疾病的嚴重度相關(guān)[7]。但由DCs啟動的獲得性免疫應答過程在COPD發(fā)病機制中的作用還不十分清楚。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素不僅具有抗炎作用，而且還具有免疫調(diào)節(jié)作用，相關(guān)研究表明，大環(huán)內(nèi)酯類可以減少慢阻肺患者急性加重癥狀，改善肺功能和生活質(zhì)量[8-9]，Iino等證實，大環(huán)內(nèi)酯類還可以抑制抗原遞呈細胞共刺激分子CD54、CD80與CD86的表達；但其具體機制還有待進一步研究。

本研究結(jié)果表明，大環(huán)內(nèi)酯類藥物紅霉素干預可以減輕煙草煙霧暴露肺氣腫小鼠氣道的炎性反應，表明紅霉素預防治療后得到緩解，表現(xiàn)出一定的抗炎療效，進一步的研究顯示，肺氣腫小鼠肺組織樹突狀細胞33D1抗原及共刺激分子CD40、CD80、CD86mRNA明顯增多，提示DCs及共刺激分子共同參與了小鼠肺氣腫的發(fā)病過程，這與文獻報道相一致，紅霉素干預后預防組和治療組 33D1及共刺激分子 表達均明顯減少，但仍高于對照組。本研究進一步證實，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素紅霉素可以降低氣道炎性反應，并起到免疫調(diào)節(jié)的作用，主要是通過調(diào)控氣道和肺組織中DCs細胞和共刺激分子，但其具體機制還有待進一步研究。

樹突狀細胞及共刺激分子參與肺氣腫發(fā)病，紅霉素可下調(diào)肺氣腫肺組織樹突狀細胞及共刺激分子表達水平，減輕肺氣腫肺部炎性反應，具體機制有待進一步研究。