基于高通量測序探索三伏貼對特稟質(zhì)人群腸道微生物影響

周 潔，周幫旻，嘉士健，雷行華，寇瀟月，陳麗妹，曾德軍，袁菱梅，吳賢波

中醫(yī)體質(zhì)學(xué)以中醫(yī)理論為基礎(chǔ)，以分類提煉、快速評估健康信息的方法，對人群進(jìn)行中醫(yī)體質(zhì)分類，并制定針對性的干預(yù)措施，以預(yù)防及治療疾病。其中，由王琦[1]提出的9種體質(zhì)學(xué)說應(yīng)用最為廣泛。特稟質(zhì)為其中之一，該體質(zhì)人群易患哮喘、鼻炎、蕁麻疹等過敏性疾病，對外界環(huán)境適應(yīng)能力差[2]。目前，從中醫(yī)體質(zhì)分類角度對特稟質(zhì)的基礎(chǔ)及臨床研究較少，更多是從西醫(yī)角度針對過敏性疾病的研究。

腸道微生物作為人體中最龐大的微生物群，對過敏反應(yīng)起著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用，也是目前研究過敏反應(yīng)的重要方向[3-8]。因此，可用腸道微生物的變化作為突破口為特稟質(zhì)人群的生理病理改變尋找生物學(xué)基礎(chǔ)。目前，基因測序是獲得腸道微生物信息最為流行的檢測手段，尤其是高通量測序。為探索三伏貼對特稟質(zhì)人群的的影響及其生物學(xué)基礎(chǔ)，本研究基于高通量測序的方法，對受試者腸道微生物的16S rDNA的V3-V4可變區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增測序，比較三伏貼前后特稟質(zhì)受試者腸道微生物變化，觀察三伏貼對特稟質(zhì)受試者腸道微生態(tài)的影響。

1 對象與方法

1.1 病例資料 研究對象均來自2018年成都市新都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院門診患者。研究通過成都市新都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院倫理審查（2018-01）。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～65周歲，性別不限；根據(jù)《中醫(yī)體質(zhì)分類與判定》標(biāo)準(zhǔn)判定體質(zhì)，體質(zhì)辨識結(jié)果為特稟質(zhì)轉(zhuǎn)化分≥40分則納入試驗(yàn)組（特稟質(zhì)人群），平和質(zhì)轉(zhuǎn)化分≥60分且其他8種體質(zhì)轉(zhuǎn)化分均＜30分納入對照組（平和質(zhì)人群，即健康人群）[9]；受試者簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：有急慢性腸道疾病，需長期或間斷服用藥物者；有嚴(yán)重原發(fā)性疾病長期服用藥物者；近期1個(gè)月內(nèi)未接受過抗生素及微生態(tài)制劑治療；近3個(gè)月內(nèi)參加過其他臨床試驗(yàn)者。

根據(jù)研究方案招募20例受試者，其中試驗(yàn)組10例，對照組10例，其基本資料見表1，兩組年齡、性別比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。試驗(yàn)中，特稟質(zhì)受試者1例因懷孕脫落，平和質(zhì)受試者1例因失訪脫落、1例要求退出試驗(yàn)。試驗(yàn)過程中未發(fā)生不良事件。

表1 兩組受試者基本資料比較

1.2 研究方法 采用自身對照的方法，對試驗(yàn)組連續(xù)兩年貼敷三伏貼，對照組不接受任何干預(yù)。分別采集分析兩組受試者2018年7月初伏前及2020年12月的清晨大便標(biāo)本和中醫(yī)體質(zhì)得分。

1.3 三伏貼組方制備 組方為成都市新都區(qū)中醫(yī)醫(yī)院制劑室根據(jù)該院臨床處方經(jīng)驗(yàn)及文獻(xiàn)自主配方，已在臨床應(yīng)用9年[10-11]。藥物組成為延胡索、白芥子、甘遂、細(xì)辛等，按比例研成粉末，用新鮮姜汁調(diào)成膏狀，制作成直徑約1 cm、厚度約2 mm的藥餅，用穴位貼敷固定貼固定在穴位上。

1.4 干預(yù)過程 （1）貼敷穴位：肺俞、脾俞、腎俞、膈腧（均為雙側(cè)）；（2）貼敷時(shí)間：2018、2019年農(nóng)歷“三伏”每伏的第1 d各貼1次，共6次，每次貼敷4 h；（3）觀察反應(yīng)：密切觀察藥物反應(yīng)，記錄并及時(shí)處理不良反應(yīng)。

1.5 高通量測序過程及方法 使用無菌大便采集器采集受試者清晨大便標(biāo)本約2 g，立即密封并放至干冰（-20°）中保存，送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行基因測序、分析。提取糞便樣本中細(xì)菌總DNA后，對16S rDNA V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增子測序，測序平臺為Illumina MiSeq(Illumina,San Diego,CA,USA)，對測序后得到的原始序列片段進(jìn)行拼接、去除嵌合體序列后得到有效序列，并在97%閾值的相似度上進(jìn)行操作分類單元（OTU）分析、物種分類學(xué)分析（比對數(shù)據(jù)庫為Silva_132 16S rRNA database），得到各個(gè)樣本的腸道菌群的物種特征（包括物種名稱、絕對豐度、相對豐度）。使用α多樣性分析、β多樣性分析描述腸道微生物的多樣性特征，使用Metastats分析描述腸道微生物門水平和屬水平的群落構(gòu)成差異，使用LEfSe（LDA Effect Size）分析尋找起重要作用的特異性微生物類群（biomarker）[12-13]。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)得分比較 試驗(yàn)組貼敷兩年三伏貼后，特稟質(zhì)得分降低，平和質(zhì)得分升高，特稟質(zhì)相關(guān)癥狀得到改善（表2）。

表2 特稟質(zhì)受試者兩年前后體質(zhì)轉(zhuǎn)化分比較(?s)

表2 特稟質(zhì)受試者兩年前后體質(zhì)轉(zhuǎn)化分比較(?s)

注： 與2018年7月比較,①P ＜ 0.05

組別 取樣時(shí)間 特稟質(zhì)得分 平和質(zhì)得分試驗(yàn)組2018年7月 53.18±9.85 60.76±16.18（n=9) 2020年12月 34.13±8.59? 72.92±6.99?

2.2 腸道微生物檢測結(jié)果

2.2.1 測序質(zhì)量 從稀疏曲線（圖1）可以看出，當(dāng)測序達(dá)到一定深度時(shí)，各個(gè)樣本的稀疏曲線均趨于平緩，說明該研究的測序工作足夠充分，測序質(zhì)量可靠，每個(gè)樣本的序列數(shù)量足以檢測樣本中存在的大多數(shù)物種。

圖1 各樣本稀疏曲線

2.2.2 α多樣性分析 選擇α多樣性中的Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)對菌落物種組成的豐度及均勻度進(jìn)行綜合評價(jià)，干預(yù)前，兩組受試者腸道微生物的Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。2020年對照2018年，兩組受試者的Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)均無改變（P＞0.05）。尚不能認(rèn)為三伏貼貼敷對特稟質(zhì)受試者的腸道微生物的豐度及均勻度有影響。

2.2.3 β多樣性分析 通過PCoA分析（圖2）發(fā)現(xiàn)，兩組受試者2018年各樣本的坐標(biāo)分布走向相似，說明兩組的腸道微生物的多樣性相似。兩組受試者2020年樣本的坐標(biāo)分布走向相似，尚不能說明三伏貼能夠影響特稟質(zhì)人群的腸道微生物多樣性。

圖2 各樣本的PCoA分析

2.2.4 腸道微生物群落結(jié)構(gòu)及組間差異比較受試者的腸道微生物共檢測出9個(gè)菌屬：Bacter oidetes（擬桿菌屬）、Firmicutes（厚壁菌屬）、Proteob acteri a（變形菌屬）等。2018年，兩組受試者屬水平群落結(jié)構(gòu)無顯著差異，優(yōu)勢菌屬均為Bacter oidetes、Firmicutes，兩個(gè)菌屬總相對豐度占比＞90%。2020年兩組受試者優(yōu)勢菌屬不變，兩個(gè)菌門總相對豐度占比均為89%。

在菌屬水平上對兩受試者2018腸道微生物進(jìn)行組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。相對豐度＞0.01的菌屬，2020年對照2018年，兩組受試者的Bacter oides和Alistipes相對豐度均下降，Blautia相對豐度上升；試驗(yàn)組的Parabacteroides、Parasutterella相對豐度下降（對照組的Faecalibacterium相對豐度上升，Sutt erella相對豐度下降），見表3、4。

表3 試驗(yàn)組兩年前后腸道微生物相對豐度＞0.01的菌屬比較(?s)

表3 試驗(yàn)組兩年前后腸道微生物相對豐度＞0.01的菌屬比較(?s)

Taxon 2018年 2020年 P Alist ipes 0.0354±0.0113 0.004±0.0016 0.006 Bacteroides 0.4588±0.0849 0.0527±0.0249 0.001 Blautia 0.0141±0.0034 0.1051±0.0422 0.010 Parabacteroides 0.0175±0.0069 0.0015±0.0006 0.007 Parasutter ella 0.0106±0.0036 0.0005±0.0003 0.007

表4 對照組兩年前后腸道微生物相對豐度＞0.01的菌屬比較(?s)

表4 對照組兩年前后腸道微生物相對豐度＞0.01的菌屬比較(?s)

Taxon 2018年 2020年 P Alistipes 0.0374±0.012 0.0050±0.0027 0.011 Bacteroi des 0.3649±0.0787 0.0546±0.0249 0.003 Blautia 0.0160±0.0048 0.0918±0.0339 0.011 Faecalibacterium 0.0610±0.0171 0.1434±0.0302 0.024 Sutterella 0.0101±0.005 0.0002±0.0002 0.023

2.2.5 LEfSE分析 圖3為受試者兩年前后腸道微生物基于LeFse分析的物種聚類進(jìn)化樹圖。其中，黃色節(jié)點(diǎn)表示在各組中均未起到重要作用的微生物類群，其他顏色圓點(diǎn)表示在該著色組別中起到重要作用的微生物類群（biomarker）。2018年，實(shí)驗(yàn)組在厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Proteobacter ia）均有b iomarker，而對照組沒有。2020年，兩組受試者在屬水平上的biomarker不同，試驗(yàn)組為Blautia、Sellimonas、But yrici coccus、Rumi nococcacesa_UCG、Subdoligranoul um，對照組為Parvimonas、Ambiguous_taxa、Tyzzer alla_3。

圖3 基于LeFse分析的物種聚類進(jìn)化樹

3 討論

3.1 特稟質(zhì)和平和質(zhì)受試者的腸道微生物多樣性比較無顯著差異，biomarker有顯著差異 本研究發(fā)現(xiàn)，特稟質(zhì)和平和質(zhì)受試者的腸道微生物多樣性（α多樣性和β多樣性）無顯著差異，且各個(gè)菌屬、菌屬的群落結(jié)構(gòu)也沒有差異。但LeFSEf分析發(fā)現(xiàn)，特稟質(zhì)受試者在厚壁菌屬（Firmicutes）和放線菌屬（Proteobacteria）均有biomarker，平和質(zhì)受試者沒有。既往研究表明，過敏性疾病患者的腸道微生物多樣性與健康人無顯著差異，但菌屬的相對豐度有顯著差異[1，5-6]。同樣是過敏疾病患者，研究結(jié)果不同，這是因?yàn)槎鄶?shù)針對過敏疾病的研究均是在受試對象正在發(fā)生過敏反應(yīng)的急性期進(jìn)行，而特稟質(zhì)是一種非穩(wěn)態(tài)的體質(zhì)，它代表的是一種既往發(fā)生過過敏反應(yīng)或有過敏傾向的狀態(tài)，更多地描述的是一種患病傾向而非病理過程，在參與研究的過程中，不一定處于過敏反應(yīng)急性期。既往研究提示不同體質(zhì)的人群其腸道微生物具有特異性表現(xiàn)，如陽虛質(zhì)、痰濕質(zhì)人群與平和質(zhì)人群對比，其腸道微生物均有各自的特征，主要表現(xiàn)為群落結(jié)構(gòu)的不同[14-17]。而研究發(fā)現(xiàn)，特稟質(zhì)受試者與平和質(zhì)受試者腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)相同，但biomarker生物標(biāo)記不同。

3.2 三伏貼可以改善特稟質(zhì)受試者的健康狀態(tài)，可能與調(diào)節(jié)腸道微生物有關(guān) 三伏貼可以改善特稟質(zhì)受試者的健康狀態(tài)，降低其特稟質(zhì)得分，提高其平和質(zhì)得分，其療效可能與調(diào)節(jié)腸道微生物有關(guān)。特稟質(zhì)受試者經(jīng)過兩年三伏貼干預(yù)后，腸道微生物α多樣性無改變，其腸道微生物β多樣性的變化趨勢與平和質(zhì)組兩年前后的變化趨勢一致，三伏貼不影響特稟質(zhì)受試者的腸道微生物多樣性。在腸道微生物屬水平群落結(jié)構(gòu)方面，特稟質(zhì)受試的變化與平和質(zhì)受試者不同，三伏貼影響了特稟質(zhì)受試者腸道微生物屬水平的群落結(jié)構(gòu)。此外，LEfSE分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)三伏貼干預(yù)特稟質(zhì)受試者后，其腸道微生物中的biomark er發(fā)生改變，且與平和質(zhì)受試者不同。該研究通過高通量測序分析三伏貼干預(yù)兩年后特稟質(zhì)受試者的腸道微生物變化后，尚未發(fā)現(xiàn)腸道微生物的多樣性有變化，但其屬水平的群落結(jié)構(gòu)及biomarker有變化。三伏貼改善特稟質(zhì)受試者體質(zhì)狀態(tài)，可能與其腸道微生物屬水平群落結(jié)構(gòu)及biomarker有關(guān)。