基于抗炎及抗氧化研究人參皂苷對衰老模型大鼠七氟烷麻醉后認(rèn)知功能障礙的改善作用

樊榮

(西安市第一醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710002)

七氟烷是臨床廣泛使用的吸入型麻醉藥物，麻醉和鎮(zhèn)靜效果確切且對呼吸和循環(huán)系統(tǒng)影響較小，但有研究[1-2]發(fā)現(xiàn)，其會對老年患者的認(rèn)知功能產(chǎn)生負(fù)面影響。另有研究[3]顯示，七氟烷會對衰老大鼠的認(rèn)知功能及海馬超微結(jié)構(gòu)造成損害。人參皂苷是人參中主要的活性成分，人參皂苷Re為人參皂苷中重要的一種單體成分，能夠在多種組織中發(fā)揮抗炎和抗氧化作用。研究[4]表明，人參皂苷Re能夠減輕慢性酒精中毒引起認(rèn)知功能損傷。基于此，本實驗將人參皂苷Re用于衰老模型大鼠七氟烷麻醉后的干預(yù)，具體分析了人參皂苷Re對認(rèn)知功能障礙及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)的改善作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 成年雄性SD大鼠購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，D-半乳糖購自北京索萊寶公司，七氟烷購自山東魯南貝特制藥公司，白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)、丙二醛(MDA)的檢測試劑盒購自北京全式金公司，RIPA裂解液、BCA蛋白檢測試劑盒購自武漢艾來德公司，p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK的抗體購自CST公司。

1.2方法 實驗動物隨機(jī)分為對照組、衰老組、衰老+七氟烷組、衰老+七氟烷+人參皂苷組，每組各8只。衰老組、衰老+七氟烷組、衰老+七氟烷+人參皂苷組進(jìn)行衰老模型制備，皮下注射0.125 g/kg 10%D-半乳糖溶液、1次/d、連續(xù)40 d；對照組皮下注射等劑量生理鹽水。衰老+七氟烷組、衰老+七氟烷+人參皂苷組在衰老模型造模完成后放入麻醉箱內(nèi)，通入3.2%七氟烷、持續(xù)6 h；對照組和衰老組放入麻醉箱內(nèi)，通入空氣。經(jīng)上述處理后，衰老+七氟烷+人參皂苷組給予50 mg/kg人參皂苷Re灌胃、1次/d、連續(xù)4周。于直徑1.6 m、高0.5 m的水迷宮內(nèi)進(jìn)行檢測，水深0.22 m，水溫22～26℃。第1～4天進(jìn)行定位航行實驗，在第3象限正中放置直徑12 cm、高度20 cm的平臺，每天訓(xùn)練4次，分別從4個象限將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠找到平臺的時間，若90 s內(nèi)未找到平臺，則逃避潛伏期為90 s；第5天進(jìn)行空間探索實驗，將大鼠從第1象限面向池壁放入水中，記錄大鼠90 s內(nèi)穿越原平臺所在位置的次數(shù)。完成Morris水迷宮檢測后處死大鼠，收集外周血3～5 mL后離心分離血清；收集海馬組織，加入RIPA裂解液后勻漿，離心分離上清，采用試劑盒分別檢測血清及上清中IL-1β、IL-6、TNF-α、SOD、GPX、MDA的含量。取海馬組織勻漿后的上清液，采用BCA試劑盒測定蛋白含量，根據(jù)測定結(jié)果取含有30 μg蛋白的上清樣本進(jìn)行Western blot實驗。將樣本加入聚丙烯酰胺凝膠后進(jìn)行電泳，而后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶在室溫封閉PVDF膜1 h后1∶1 000稀釋的p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK抗體或1∶5 000稀釋的β-actin抗體4℃孵育過夜；TBS-T溶液洗膜3遍、每遍5 min，室溫孵育1∶2 000稀釋的二抗1 h，再次TBS-T溶液洗膜3遍、每遍10 min，最后在凝膠成像系統(tǒng)中顯影，得到p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK、β-actin條帶，根據(jù)條帶的灰度值計算蛋白表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件錄入數(shù)據(jù)，四組間計量資料的比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1學(xué)習(xí)記憶功能的比較 與對照組比較，衰老組大鼠的逃避潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)減少(P<0.05)；與衰老組比較，衰老+七氟烷組大鼠的逃避潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)減少(P<0.05)；與衰老+七氟烷組比較，衰老+七氟烷+人參皂苷組大鼠的逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增加(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的比較

2.2血清及海馬中炎癥因子含量的比較 與對照組比較，衰老組大鼠血清及海馬中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量增加(P<0.05)；與衰老組比較，衰老+七氟烷組大鼠血清及海馬中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量減少(P<0.05)；與衰老+七氟烷組比較，衰老+七氟烷+人參皂苷組大鼠血清及海馬中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量增加(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清及海馬中炎癥因子含量的比較

2.3血清及海馬中氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較 與對照組比較，衰老組大鼠血清及海馬中SOD、GPX的含量減少，MDA的含量增加(P<0.05)；與衰老組比較，衰老+七氟烷組大鼠血清及海馬中SOD、GPX的含量增加，MDA的含量減少(P<0.05)；與衰老+七氟烷組比較，衰老+七氟烷+人參皂苷組大鼠血清及海馬中SOD、GPX的含量減少，MDA的含量增加(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清及海馬中應(yīng)激指標(biāo)的比較

2.4p38MAPK、ERK1/2、JNK表達(dá)的比較 與對照組比較，衰老組大鼠海馬中p-p38MAPK、p-JNK的表達(dá)水平增加，p-ERK1/2的表達(dá)水平減少(P<0.05)；與衰老組比較，衰老+七氟烷組大鼠海馬中p-p38MAPK、p-JNK的表達(dá)水平增加，p-ERK1/2的表達(dá)水平減少(P<0.05)；與衰老+七氟烷組比較，衰老+七氟烷+人參皂苷組大鼠海馬中p-p38MAPK的表達(dá)水平無明顯變化(P>0.05)，p-JNK的表達(dá)水平減少、p-ERK1/2的表達(dá)水平增加(P<0.05)。見圖1，表4。

圖1 各組大鼠海馬中p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK的蛋白條帶

表4 各組大鼠海馬中p-p38MAPK、p-ERK1/2、p-JNK表達(dá)量的比較

3 討 論

人參皂苷Re是人參皂苷中重要的一種單體成分，具有廣泛的生物學(xué)作用。有學(xué)者[5-6]分別將人參皂苷Re用于精神分裂癥大鼠及阿爾茨海默小鼠的干預(yù)，結(jié)果顯示動物的行為學(xué)表現(xiàn)及認(rèn)知功能均明顯改善。本研究結(jié)果顯示，與衰老+七氟烷組比較，衰老+七氟烷+人參皂苷組的逃避潛伏期縮短、穿越平臺次數(shù)增加，表明人參皂苷Re對衰老大鼠七氟烷麻醉后的認(rèn)識功能具有改善作用。

海馬是大腦中與認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶等功能直接相關(guān)的腦區(qū)，海馬結(jié)構(gòu)的損害能夠引起認(rèn)知功能障礙、學(xué)習(xí)記憶能力減退。研究[7-8]表明，在七氟烷誘導(dǎo)認(rèn)知功能障礙的過程中，海馬中的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)的激活與結(jié)構(gòu)損害直接相關(guān)。本研究表明，衰老組及衰老+七氟烷組血清、海馬中IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA的含量增加，SOD、GPX的含量減少且衰老+七氟烷組的上述變化較衰老組更為顯著，表明衰老及七氟烷麻醉均對海馬中的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)具有激活作用。人參皂苷Re具有抗炎和抗氧化作用，能夠在神經(jīng)元細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞中減輕多種病理因素引起的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)[9-10]。本研究結(jié)果顯示，血清、海馬中IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA的含量減少，SOD、GPX的含量增加，表明人參皂苷Re能夠在衰老大鼠七氟烷麻醉后發(fā)揮抗炎和抗氧化作用，這可能是其改善認(rèn)知功能的機(jī)制之一。

MAPK通路是細(xì)胞內(nèi)感受能量變化并調(diào)控凋亡、炎癥、氧化應(yīng)激的重要通路，ERK1/2、JNK、p38MAPK均屬于MAPK家族。報道[11-12]顯示，七氟烷能夠使海馬中的JNK、p38MAPK發(fā)生激活，ERK1/2受到抑制。本研究結(jié)果顯示，衰老+七氟烷組海馬中p-p38MAPK、p-JNK的表達(dá)水平增加，p-ERK1/2的表達(dá)水平減少，表明上述信號通路的變化可能參與了七氟烷誘導(dǎo)的海馬組織炎癥及氧化應(yīng)激激活，進(jìn)而引起認(rèn)知功能減退。在人參皂苷Re干預(yù)后，海馬中p-p38MAPK的表達(dá)水平無明顯變化、p-JNK的表達(dá)水平減少、p-ERK1/2的表達(dá)水平增加，表明人參皂苷Re可能通過ERK1/2和JNK通路發(fā)揮改善認(rèn)知功能及抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用。