果蠅腸道干細(xì)胞及腸道菌群的研究進(jìn)展

金秋霞 王思宏 金麗華

（1. 東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040；2. 延邊大學(xué)分析測(cè)試中心，延吉 133002）

腸道上皮對(duì)內(nèi)部和外部環(huán)境做出應(yīng)答，通過(guò)免疫反應(yīng)、腸道菌群和干細(xì)胞的增殖及分化來(lái)調(diào)節(jié)腸道穩(wěn)態(tài)［1］。黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）的腸道干細(xì)胞形態(tài)、功能及信號(hào)通路與哺乳動(dòng)物類(lèi)似。另外，果蠅腸道內(nèi)聚集著一定數(shù)量的共生菌群［2］，與人類(lèi)的腸道菌群和結(jié)構(gòu)具有較高的保守性。因此，果蠅可以作為研究宿主與菌群相互作用的重要模型［3］。果蠅基因組和共生菌群遺傳模型已廣泛應(yīng)用于宿主與微生物之間復(fù)雜關(guān)系的研究［4］。本文將介紹和討論果蠅腸道干細(xì)胞增殖與分化機(jī)制，以及共生菌群對(duì)腸道穩(wěn)態(tài)的影響，旨為揭示人類(lèi)腸道相關(guān)疾病的發(fā)生和治療奠定理論基礎(chǔ)。

1 果蠅腸道上皮細(xì)胞種類(lèi)

動(dòng)物腸道上皮不僅是消化和吸收的場(chǎng)所，也是機(jī)體防御外來(lái)入侵物的第一道屏障［5］。腸道干細(xì)胞通過(guò)增殖和分化維持腸道上皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，此過(guò)程失衡將導(dǎo)致腸道炎癥或腸道腫瘤的發(fā)生。腸上皮暴露于動(dòng)態(tài)且復(fù)雜的病原體中，宿主與微生物的相互作用能夠影響宿主免疫系統(tǒng)的發(fā)育、消化和營(yíng)養(yǎng)吸收等。模式生物果蠅腸道上皮細(xì)胞的更新機(jī)制與哺乳動(dòng)物小腸細(xì)胞高度相似，信號(hào)傳導(dǎo)途徑也具有一定的保守性［6］。

果蠅中腸是一個(gè)由特殊細(xì)胞組成的動(dòng)態(tài)器官，分為5個(gè)不同形態(tài)和功能區(qū)域（R1-R5）。每個(gè)區(qū)域均由多功能腸道干細(xì)胞（intestinal stem cells，ISCs）、成腸細(xì)胞（enteroblasts，EBs）、腸內(nèi)分泌細(xì)胞（enteroendocrine cells，EEs）、腸上皮細(xì)胞（enterocytes，ECs）和內(nèi)臟肌肉（visceral muscles，VMs）組成（圖1）。ISCs主要位于中后腸，并在整個(gè)成蟲(chóng)階段不斷增殖從而完成自我更新，同時(shí)也能分化為EBs。另外，EBs繼續(xù)可以分化為 ECs或 EEs［7-8］；但研究發(fā)現(xiàn)，EEs也可以通過(guò)ISCs分化產(chǎn)生的EE祖細(xì)胞（EEP）形成［9-10］。

前體細(xì)胞（ISCs&EBs）特異性表達(dá)Snail/Slug家族的轉(zhuǎn)錄因子 escargot（esg）［11］。ISCs表達(dá) Notch途徑配體Delta，并能激活相鄰EBs細(xì)胞Notch的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，使Su（H）進(jìn)核誘導(dǎo)下游靶基因的表達(dá)。ECs特異性表達(dá)Myosin1A和Pdm1［12］，并感知外界信號(hào)刺激，在病原體感染時(shí)發(fā)揮主要的免疫防御作用。少量且零散的EEs細(xì)胞分泌轉(zhuǎn)錄因子prospero（pros）、神經(jīng)肽TK及DH31等，EEs細(xì)胞主要介導(dǎo)器官和器官間的信號(hào)傳遞，通過(guò)分泌多種神經(jīng)內(nèi)分泌肽遠(yuǎn)距離調(diào)節(jié)代謝和腸蠕動(dòng)等多種重要的生理過(guò)程［13］。研究表明，由EEs分泌的slit是ISCs中Robo2的配體，對(duì)EEs自身的分化具有重要的調(diào)節(jié)作用［14］；轉(zhuǎn)錄因子esg也會(huì)通過(guò)抑制pros調(diào)控EEs細(xì)胞選擇性地分化［15］；另外，發(fā)現(xiàn)EBs表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子Klumpfuss同樣抑制EEs細(xì)胞的形成［16］。內(nèi)臟肌肉（VMs）通過(guò)胃腸系統(tǒng)協(xié)調(diào)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和廢物的運(yùn)輸，促進(jìn)蠕動(dòng)的同時(shí)可以分泌信號(hào)因子調(diào)節(jié)腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)［17］。

2 果蠅腸道干細(xì)胞增殖與分化相關(guān)信號(hào)通路

腸道內(nèi)含有大量的多能性干細(xì)胞，可修復(fù)腸道受損以保持其功能完整性。通過(guò)對(duì)果蠅腸道干細(xì)胞的增殖與分化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的深入研究，發(fā)現(xiàn)Hippo、JNK、Notch等信號(hào)通路對(duì)腸道干細(xì)胞的增殖及分化起著重要的調(diào)控作用［18］。另外，研究表明，炎癥與老化等應(yīng)激脅迫條件會(huì)促進(jìn)腸道干細(xì)胞增殖及分化［19-20］

圖1 成蟲(chóng)果蠅中腸細(xì)胞類(lèi)型（A）及果蠅腸道干細(xì)胞增殖與分化（B）［9-10］Fig.1 Adult Drosophila midgut cell types (A) and proliferation and differentiation of Drosophila intestinal stem cells（B)

在果蠅中，經(jīng)典Hippo信號(hào)傳導(dǎo)途徑的核心激 酶 包 括 Hippo、Warts（Wts）、Salvador（Sav） 和Mob腫瘤抑制因子（Mats），Wts與Mats相互作用可觸發(fā)Yorkie（Yki）磷酸化，進(jìn)而和下游轉(zhuǎn)錄因子Scalloped（Sd）形成的Yki-Sd復(fù)合物，不僅可以抑制下游信號(hào)轉(zhuǎn)錄，還會(huì)通過(guò)促進(jìn)核內(nèi)Unpaired表達(dá)，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答［21］。研究發(fā)現(xiàn)，Sd結(jié)合蛋白可以抑制由Hippo信號(hào)缺失引起ISCs過(guò)度增殖現(xiàn)象［22］。另外，非經(jīng)典Hippo信號(hào)傳導(dǎo)途徑，其核心激酶Wts能夠以一種獨(dú)立于經(jīng)典轉(zhuǎn)錄復(fù)合物Yki-Sd的方式與轉(zhuǎn)錄因子Lola相互作用，通過(guò)細(xì)胞自主性和非細(xì)胞自主性方式同時(shí)調(diào)控ISC增殖［23］。c-Jun氨基末端激酶（JNK）作為果蠅應(yīng)激反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)途徑，是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族之一。該通路在受到刺激后通過(guò)蛋白激酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起細(xì)胞應(yīng)答，促進(jìn)EGFR配體的表達(dá)［24］，通過(guò)激酶磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活MAP kinase kinase 4和Hemipterous，引起basket活化，從而促進(jìn)ISCs增殖和再生，補(bǔ)充受損細(xì)胞［25-26］。

Notch信號(hào)通路進(jìn)化上高度保守，由受體、配體及胞內(nèi)效應(yīng)分子組成。果蠅中單通道跨膜受體蛋白Notch有膜蛋白Delta和Serrate兩種配體［27］，通過(guò)細(xì)胞間直接接觸觸發(fā)配體與受體的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，酶切形成Notch的胞內(nèi)域（NICD）進(jìn)入細(xì)胞核，激活相關(guān)基因表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞分化［28］。果蠅腸道中Notch通路的激活促使ISCs-EBs-ECs分化，從而降低了ISCs的數(shù)量；相反，抑制該通路會(huì)使ISCs和EEs增多，形成ISCs或EEs腫瘤。Wg/Wnt信號(hào)通路以蛋白分子擴(kuò)散與受體結(jié)合的方式完成信號(hào)傳遞，在干細(xì)胞中的配體Wingless（Wg）與位于細(xì)胞表面的受體Frizzled結(jié)合，與下游基因Dishevelled和Armadillo控制自身增殖，但不參與后續(xù)分化［29］；由VMs和EBs旁分泌的Wg也起著同樣重要的作用。不同于Wg/Wnt信號(hào)，Jak/Stat信號(hào)參與ISCs分化調(diào)節(jié)過(guò)程。ECs在應(yīng)激條件下會(huì)釋放細(xì)胞因子（Upd、Upd2、Upd3）， 激 活 ISCs中 Jak/Stat信 號(hào)， 促 進(jìn)細(xì)胞分裂，從而維持ISCs的自我更新；高水平的Jak/Stat則會(huì)促進(jìn)干細(xì)胞向ECs分化［30］。果蠅腸道穩(wěn)態(tài)是多種信號(hào)通路共同調(diào)控的結(jié)果，其更加具體而復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍需要進(jìn)一步深入探究。

3 腸道菌群

腸道上皮細(xì)胞與腸道菌群之間存在相互作用以維持腸道穩(wěn)態(tài)。腸道菌群是一種內(nèi)分泌型器官，是與宿主共同進(jìn)化形成的極為復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)。菌群對(duì)機(jī)體產(chǎn)生免疫刺激，使宿主形成免疫屏障，維持機(jī)體自身免疫系統(tǒng)的生長(zhǎng)發(fā)育［31］。腸道菌群既可以介導(dǎo)宿主的營(yíng)養(yǎng)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，從而調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)分配模式；又可以通過(guò)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和消耗飲食成分改變機(jī)體營(yíng)養(yǎng)輸入［32］。腸道菌群通過(guò)糖、脂質(zhì)以及氨基酸等物質(zhì)的代謝來(lái)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的發(fā)育和復(fù)雜的行為，并且通過(guò)腸-腦軸、腸-肝臟軸等來(lái)影響人類(lèi)的情緒、心理健康和行為等［33］。腸道菌群失調(diào)可導(dǎo)致腸道通透性增加，引起腸漏，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)菌移位產(chǎn)生炎癥［34］，促進(jìn)腸道疾病甚至腸道腫瘤的發(fā)生［35］。但是，目前關(guān)于腸道微生物群如何影響宿主行為、腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)及內(nèi)部所涉及的分子和細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)制還不清楚。

果蠅作為共生微生物群遺傳模型已被廣泛應(yīng)用于腸道菌群的研究中［4］。果蠅生活在富含微生物的環(huán)境，為了確保其存活，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一系列防御機(jī)制，尤其腸道免疫反應(yīng)在響應(yīng)和消除潛在病原體的同時(shí)耐受腸道微生物群和飲食微生物的存在。

果蠅腸道菌群可以通過(guò)改變腸道內(nèi)環(huán)境，調(diào)節(jié)宿主基因表達(dá)，影響干細(xì)胞命運(yùn)。無(wú)菌條件培養(yǎng)的果蠅中腸道干細(xì)胞有絲分裂指數(shù)較低，表明菌群刺激干細(xì)胞增殖更新［36］。腸道菌群通過(guò)誘導(dǎo)壓力和耐受機(jī)制改變腸道生理環(huán)境（通過(guò)改變pH和消化酶含量）來(lái)保證果蠅腸道上皮更新及干細(xì)胞活性［37］。另外，通過(guò)菌群與腸道干細(xì)胞之間的相互作用，影響果蠅老化及壽命。成蟲(chóng)期的核心菌群組成相對(duì)穩(wěn)定，但在老化過(guò)程中，許多與增殖分化相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，菌群刺激上皮細(xì)胞的基礎(chǔ)更新水平，使ISCs大量增殖，并激活EGFR等信號(hào)通路，進(jìn)而引起腸道內(nèi)細(xì)菌負(fù)荷急劇增加。因此，腸道菌群失衡將誘發(fā)腸道屏障功能紊亂［38-39］。研究發(fā)現(xiàn)，免疫缺陷（Imd）途徑是應(yīng)對(duì)腸道感染的關(guān)鍵組成部分，該過(guò)程產(chǎn)生的抗菌肽和NADPH氧化酶Duox產(chǎn)生的活性氧（ROS）形成了腸道中兩種互補(bǔ)的防御機(jī)制［40］。Imd途徑中肽聚糖識(shí)別蛋白PGRP-SD突變引起植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，Lp）過(guò)度生長(zhǎng)，Lp分泌的乳酸也隨之增加導(dǎo)致腸道酸化，刺激ROS產(chǎn)生，誘發(fā)機(jī)體早衰［41］。但果蠅在生命早期階段接觸低劑量的氧化劑可以重塑菌群，改善老化病征進(jìn)而延長(zhǎng)壽命［42］。菌群失衡也會(huì)刺激腫瘤生長(zhǎng)，其中，JNK信號(hào)活性水平對(duì)維持上皮屏障功能和宿主-微生物平衡起重要調(diào)節(jié)作用［43］。另外，果蠅組蛋白去甲基化酶KDM5通過(guò)調(diào)控先天免疫通路影響腸道屏障和菌群組成，經(jīng)腸-腦軸改變果蠅社會(huì)行為，并靶向干預(yù)腸道菌群可在一定能程度上改善果蠅的社會(huì)行為異常現(xiàn)象［44］；果蠅腸道微生物中的短乳桿菌能夠產(chǎn)生負(fù)調(diào)控章魚(yú)胺（昆蟲(chóng)中的獎(jiǎng)賞信號(hào)）信號(hào)途徑的木糖異構(gòu)酶，進(jìn)而抑制果蠅的運(yùn)動(dòng)能力［45］。

細(xì)菌通過(guò)產(chǎn)生小分子代謝物向大腦發(fā)送信號(hào)影響動(dòng)物的行為來(lái)調(diào)節(jié)飲食行為［46］，同時(shí)進(jìn)食也會(huì)直接影響腸道菌群的組成，長(zhǎng)期則會(huì)改變菌群的定植［47］。高脂飲食能引起腸道菌群組成發(fā)生變化、腸道屏障功能受損，進(jìn)而引起慢性炎癥反應(yīng)或腸道干細(xì)胞的異常增殖引發(fā)腫瘤性病變［48］。研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)喂食8周高脂食物的母鼠后代出現(xiàn)社交行為缺陷，幼鼠腸道的羅伊氏乳桿菌含量明顯減少，表明腸道微生物群衍生的信號(hào)分子影響了腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)［49］。而果蠅中的高脂飲食通過(guò)JNK和Jak/Stat途徑激活ECs中的細(xì)胞因子表達(dá)，完全依賴(lài)于細(xì)菌數(shù)量調(diào)控，間接誘導(dǎo)干細(xì)胞活性增加［50］。

腸上皮細(xì)胞與微生物及其代謝物的相互作用是腸上皮與其他細(xì)胞類(lèi)型之間相互作用的關(guān)鍵介質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，在腸道內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)并促進(jìn)脂肪吸收的膽汁酸［51］這類(lèi)腸道菌群的代謝產(chǎn)物可以調(diào)控機(jī)體代謝及免疫反應(yīng)。果蠅腸道中的細(xì)菌能夠產(chǎn)生一種短鏈脂肪酸-醋酸鹽，醋酸鹽對(duì)果蠅自身的脂肪代謝和胰島素信號(hào)傳導(dǎo)至關(guān)重要。細(xì)菌來(lái)源的尿嘧啶會(huì)調(diào)節(jié)腸道內(nèi)活性氧（ROS）水平［52］，說(shuō)明腸道微生物可以通過(guò)與先天性免疫協(xié)同作用影響體內(nèi)代謝過(guò)程。EE細(xì)胞分泌與脂質(zhì)代謝和能量穩(wěn)態(tài)相關(guān)的肽，這些肽可以被微生物代謝物（如短鏈脂肪酸，SCFA）激活，完成微生物與宿主免疫系統(tǒng)之間的信號(hào)交流［53］。

4 總結(jié)與展望

腸道微生態(tài)系統(tǒng)是與機(jī)體健康息息相關(guān)的微生態(tài)系統(tǒng)，一方面，細(xì)菌本身依賴(lài)于宿主體內(nèi)環(huán)境及攝入的食物養(yǎng)分；另一方面，細(xì)菌希望宿主具有群居性，這樣有利于繁衍多樣性的后代。果蠅腸道已然成為研究消化道疾病的重要模型［54-55］，果蠅因其遺傳和生理上操作的簡(jiǎn)便性及自身相對(duì)簡(jiǎn)單的微生物群為研究宿主-微生物提供了良好的系統(tǒng)。然而，腸道上皮細(xì)胞對(duì)微生物的響應(yīng)復(fù)雜且多樣，針對(duì)腸道干細(xì)胞與菌群之間的研究仍有許多問(wèn)題有待解決。首先，果蠅腸道內(nèi)的微生物群結(jié)構(gòu)沒(méi)有哺乳動(dòng)物復(fù)雜，微生物對(duì)宿主的影響是否具有特異性，仍有必要深入研究。其次，操縱菌群的手段尚不明確，相關(guān)的信號(hào)傳遞通路尚不清晰，腸道菌群是如何建立和維持長(zhǎng)期腸道定植尚不清楚?？偠灾庖呦到y(tǒng)與菌群的研究仍舊處于探索階段，利用果蠅研究共生菌與宿主的相互關(guān)系及作用機(jī)制可以為人類(lèi)代謝性疾病以腸道菌群為靶點(diǎn)的治療提供新思路。