破囊壺菌生產(chǎn)角鯊烯的研究現(xiàn)狀

李夢凡 謝云軒 謝寧棟 張愛卿 汪光義

（天津大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300072）

角鯊烯（squalene，C30H50）是一種具有重要藥用保健價(jià)值的線性多不飽和三萜類物質(zhì)［1］。作為一種天然的抗氧化劑，它可以保護(hù)細(xì)胞免受自由基的侵害，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，降低各種癌癥的患病風(fēng)險(xiǎn)，特別是能夠有效抑制化學(xué)誘導(dǎo)的肺、結(jié)腸和皮膚腫瘤的發(fā)生［2-3］。角鯊烯還是保濕劑、潤膚乳等護(hù)膚品中的重要成分，對于促進(jìn)皮膚健康具有顯著功效［4］。此外，角鯊烯有助于降低人體的膽固醇水平，對于預(yù)防心血管疾病具有潛在作用［5］。臨床研究表明，日糧中角鯊烯總量的 60%-85% 被有效吸收并分布于各種組織中，較高的角鯊烯攝入量（約500 mg/d）對維持人體的營養(yǎng)健康至關(guān)重要［6］。

目前，商業(yè)角鯊烯制品的主要生產(chǎn)來源是深海鯊魚肝油和某些植物籽油［7］。但是，隨著海洋野生動物保護(hù)法的實(shí)施，以及季節(jié)、地理等因素的限制，未來角鯊烯的持續(xù)供應(yīng)和可獲得性變得不確定［3］。此外，由于鯊魚肝臟中存在二噁英、多氯聯(lián)苯和重金屬等環(huán)境污染物，以及腥味和其他異味，鯊魚肝油的使用受到很大的限制［8］。因此，科學(xué)家和研究人員開始努力尋找商業(yè)化生產(chǎn)高質(zhì)量角鯊烯的替代來源［9］。近年來，微生物作為潛在的角鯊烯替代來源，逐漸進(jìn)入人們的視野［10］。據(jù)報(bào)道，酵母菌具有合成角鯊烯的能力，但其角鯊烯占生物量干重（dry cell weight，DCW）的含量相對較低（0.041 mg/g DCW），因此酵母菌不是生產(chǎn)角鯊烯的優(yōu)選菌株［11-12］。綠色微藻Botryococcus braunii具有合成角鯊烯的能力，但其生長速率很低，故不適合工業(yè)化生產(chǎn)［13］。破囊壺菌可以在異養(yǎng)條件下利用有機(jī)碳快速生長，并通過高密度發(fā)酵高效生產(chǎn)角鯊烯，與依賴光照、生長緩慢、無法高密度培養(yǎng)的自養(yǎng)藻類相比，具有顯著優(yōu)勢［14］。因此，破囊壺菌有望成為角鯊烯商業(yè)化生產(chǎn)最具潛力的微生物替代來源。本文綜述了國內(nèi)外關(guān)于破囊壺菌生產(chǎn)角鯊烯的研究進(jìn)展，同時(shí)提出破囊壺菌發(fā)酵生產(chǎn)角鯊烯過程中存在的問題，并指出分離獲得優(yōu)質(zhì)的破囊壺菌菌株、對其代謝途徑和關(guān)鍵酶的改造是下一步研究的重點(diǎn)。

1 破囊壺菌及其合成角鯊烯概述

破囊壺菌于1936年首次被分離，屬于類真菌的海洋單細(xì)胞異養(yǎng)原生生物，目前被分類至管毛生物界、不等鞭毛類、網(wǎng)黏菌綱、破囊壺菌目［15］，主要包含Aurantiochytrium、Thraustochytrium、Botryochytrium、Parietichytrium、Aplanochytrium、Labyrinthuloides、Oblongichytrium、Sicyoidochytrium、Japonochytrium、Ulkenia，和 Schizochytrium 等 11個(gè)屬［16］。破囊壺菌雖然在分類學(xué)上與真核不等鞭毛綱關(guān)系密切，但在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上卻與雜核藻類（如硅藻和褐藻）更為接近［17］，并且在商業(yè)應(yīng)用中也常被稱作“異養(yǎng)微藻”［18-19］。破囊壺菌在全球海洋具有廣泛的地理分布，從河口、紅樹林、近海到大洋；從熱帶到極地海域，從表層海域到數(shù)千米的深海，破囊壺菌幾乎存在于各類海洋生態(tài)系統(tǒng)［20］。在深海，它們與“海洋雪”有關(guān)，說明潛在的富含營養(yǎng)的底物能夠使其在異養(yǎng)條件下生活［21］；同時(shí)，在含有腐爛生物物質(zhì)（如表層沉積物層、紅樹林或河水）的棲息地中，破囊壺菌的分布更為豐富［22］。在大多數(shù)情況下，破囊壺菌會在腐爛的生物材料上生長［23］，因此在有機(jī)物分解和碳循環(huán)中起著重要的生態(tài)作用。

除其生態(tài)學(xué)意義外，破囊壺菌在生物技術(shù)上也引起了人們的廣泛關(guān)注，因?yàn)樗鼈儾粌H可以像光合微藻一樣積累高水平的三?；视停╰riacylglycerol，TAG），同時(shí)還可以產(chǎn)生大量以二十二碳六烯酸（DHA，C22：6）為主的ω-3多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFAs）［15］。另外，一些破囊壺菌特別是Aurantiochytrium屬的菌株，產(chǎn)生的角鯊烯含量可超過細(xì)胞干重的30%［3，24-25］。目前，角鯊烯銷量仍處于增長期，預(yù)計(jì)到2024年銷售額將達(dá)到2.04億美元（www.marketsandmarkets.com）。當(dāng)前對破囊壺菌產(chǎn)角鯊烯的研究主要集中在菌株的篩選及培養(yǎng)條件的優(yōu)化方面（高產(chǎn)菌株見表1）［26-29］。目前已經(jīng)篩選得到的高產(chǎn)角鯊烯的破囊壺菌主要來源于不同地區(qū)的紅樹林中，這為以后在紅樹林地區(qū)篩選菌株提供了借鑒。

2 破囊壺菌角鯊烯合成路徑

到目前為止，角鯊烯的生物合成途徑已初步探明［37］。已有文獻(xiàn)記載，角鯊烯是經(jīng)胞質(zhì)甲羥戊酸（mevalonate，MVA）途徑或質(zhì)體甲基赤蘚糖醇磷酸（2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate，MEP）途徑合成前體物質(zhì)二異戊烯基二磷酸酯（isopentenyl diphosphate，IPP）及其異構(gòu)體二甲基烯丙基二磷酸 酯（dimethylallyl diphosphate，DMAPP） 后， 再通過一系列酶的催化作用而形成的［38］。MVA途徑于20世紀(jì)60年代首次被發(fā)現(xiàn)，在植物、動物和真菌中普遍存在，是許多真核生物合成角鯊烯前體IPP和DMAPP的唯一來源［39-40］。MVA途徑在細(xì)胞質(zhì)的水溶性成分中起作用，通常為生產(chǎn)倍半萜和三萜類化合物（如角鯊烯）及其相關(guān)化合物（如氧化角鯊烯和雙氧化角鯊烯）提供前體［41］。MEP途徑則是某些植物和微生物中的替代途徑，它發(fā)生在質(zhì)體內(nèi)，以丙酮酸和3-磷酸甘油醛為原料，以MEP和1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate，DXP）為中間體，進(jìn)而合成角鯊烯前體IPP 和 DMAPP［42-43］。

在破囊壺菌中，角鯊烯的生物合成途徑仍在不斷探索中。對少量菌株的初步研究表明，破囊壺菌以乙酰輔酶A（acetyl-CoA）作為起始反應(yīng)物，反應(yīng)經(jīng)過MVA途徑，由甲羥戊酸（mevalonate）合成IPP和其異構(gòu)體3，3-二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP），進(jìn)而由法尼基焦磷酸合酶生成法尼基焦磷酸（arnesyl diphosphate，F(xiàn)PP），最終合成角鯊烯［44-45］；角鯊烯在有氧條件下經(jīng)過角鯊烯環(huán)氧化酶的氧化作用形成（S）-角鯊烯-2，3-環(huán)氧化物，然后經(jīng)過其他酶類的反應(yīng)生成固醇類［46］（圖 1）。

表1 現(xiàn)階段研究較多生產(chǎn)角鯊烯的破囊壺菌菌株匯總Table 1 Summary of the most squalene-producing chytrid strains studied at the present stage

目前，對于破囊壺菌中角鯊烯合成機(jī)理的研究較少。從乙酰輔酶A下游到焦磷酸FPP的甲羥戊酸途徑中涉及的所有基因都已在破囊壺菌進(jìn)行了注釋定位［38］。通過對 Aurantiochytrium sp.KRS101 中角鯊烯合成酶基因的研究，研究者發(fā)現(xiàn)了該菌株在NADPH和Mg2+存在條件下催化兩分子的FPP轉(zhuǎn)化為角鯊烯的縮合反應(yīng)［25］，這是首次對破囊壺菌中角鯊烯合成酶特征進(jìn)行描述的研究報(bào)道。同時(shí)，通過對破囊壺菌Aurantiochytrium sp.TWZ-97轉(zhuǎn)錄組的分析，研究者成功確定了MVA和角鯊烯合成通路（圖1）所涉及的羥甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGR）、角鯊烯合成酶（squalene synthase，SQS）等7個(gè)關(guān)鍵酶的基因，這是迄今為止對破囊壺菌產(chǎn)角鯊烯生物合成通路的一個(gè)較完整的研究［47］。但是，角鯊烯在破囊壺菌中的合成機(jī)理及其調(diào)控機(jī)制仍未完全闡明，亟待研究其代謝通路中關(guān)鍵基因功能以及基因結(jié)構(gòu)，全面揭示角鯊烯合成的分子機(jī)理。

目前已有不少通過修飾MVA和角鯊烯合成通路中的關(guān)鍵基因來提高微生物角鯊烯產(chǎn)量的報(bào)道［50］。例如，利用分子生物學(xué)手段過表達(dá)釀酒酵母中的HMG-CoA還原酶，使工程菌株的角鯊烯生產(chǎn)能力相比野生菌株增加了20倍［25］；通過向釀酒酵母轉(zhuǎn)入質(zhì)粒提高其FPP編碼基因的表達(dá)，使細(xì)胞中的角鯊烯和麥角固醇明顯積累，其中角鯊烯產(chǎn)量高達(dá)9 mg/g DCW，而野生菌株只生產(chǎn)了微量角鯊烯［51］；將MVA通路上5種主要酶（HMGs、HMGR、MK、IDI和DMAPP）的編碼基因整合到單一操縱子并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)角鯊烯產(chǎn)量高達(dá)230 mg/L［42］。將含有高表達(dá)與正常表達(dá)SQS的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)SQS獲得的角鯊烯產(chǎn)量為4.2 mg/L，而正常表達(dá)SQS獲得的角鯊烯產(chǎn)量僅為3.5 mg/L［42］。通過敲除釀酒酵母SHY3的角鯊烯環(huán)氧化酶，使得菌株的角鯊烯積累量提高了5 mg/g DCW［52］。目前，相關(guān)研究主要集中于酵母和大腸桿菌，而將代謝工程手段用于提高破囊壺菌角鯊烯產(chǎn)量的研究還很少。對破囊壺菌角鯊烯生物合成通路及代謝機(jī)理的研究，可以為今后利用分子生物方法提高角鯊烯產(chǎn)量提供有價(jià)值的遺傳信息。

圖1 破囊壺菌合成角鯊烯通路[48-49]Fig. 1 The pathway of squalene synthesis by Thraustochytrids[48-49]

3 影響破囊壺菌生產(chǎn)角鯊烯的因素

微生物生產(chǎn)高附加值代謝產(chǎn)物不僅受到自身遺傳因素的影響，而且與外部營養(yǎng)和環(huán)境條件息息相關(guān)［24］。同樣，破囊壺菌的角鯊烯生物合成也受許多環(huán)境因子的影響，包括碳氮源、溫度、溶解氧、pH、鹽度等［53］。因此發(fā)酵條件的優(yōu)化是利用破囊壺菌生產(chǎn)角鯊烯必不可少的一個(gè)環(huán)節(jié)［54］。

3.1 碳氮源

破囊壺菌屬于異養(yǎng)型原生生物，在其發(fā)酵過程中必須添加適量的碳源和氮源，才能有足夠的物質(zhì)和能量維持自身的繁殖和代謝。碳氮源的種類和濃度，對破囊壺菌的生長繁殖速度、脂質(zhì)累積速度和角鯊烯合成速度均有很重要的影響［55］。

破囊壺菌能夠利用葡萄糖、甘油、果糖和蔗糖等多種碳源進(jìn)行生長和代謝［56］，碳源的種類影響破囊壺菌的生物量和角鯊烯的生產(chǎn)，但是目前的研究主要集中在葡萄糖濃度優(yōu)化，對碳源種類對角鯊烯產(chǎn)量的影響的研究相對較少［29-30］。本課題組通過評估5種不同的碳源（濃度為20 mg/L）對Aurantiochytrium sp.TWZ-97角鯊烯產(chǎn)量的影響，即葡萄糖、果糖、甘油、蔗糖和淀粉，以測試它們對細(xì)胞生長和角鯊烯產(chǎn)生的影響，發(fā)現(xiàn)葡萄糖是生產(chǎn)角鯊烯的最佳碳源［47］。一些研究通過使用廉價(jià)易得的原料代替葡萄糖來培養(yǎng)破囊壺菌，如破囊壺菌Aurantiochytrium sp. T66以木質(zhì)纖維素水解液為原料獲得的角鯊烯產(chǎn)量達(dá)1 g/L［35］，同時(shí)Schizochytrium limacinum SR21使用經(jīng)化學(xué)預(yù)處理的云杉木質(zhì)纖維素水解液代替葡萄糖來生產(chǎn)角鯊烯（角鯊烯產(chǎn)量16.34 mg/g DCW）［36］，裂殖壺菌屬的 Schizochytrium sp.KH105以葡萄糖和酒廠廢水為粗碳氮源進(jìn)行發(fā)酵（角鯊烯產(chǎn)量3.4 g/L）［24］等。破囊壺菌常用的氮源包括酵母粉、蛋白胨、胰蛋白胨、谷氨酸鈉、玉米漿、尿素等有機(jī)氮源及硫酸銨、乙酸銨、硝酸銨等無機(jī)氮源［57］。不同氮源對不同破囊壺菌菌株的生長和角鯊烯積累的影響具有很大差異，在Aurantiochytrium sp. BR-MP4-A1生產(chǎn)角鯊烯的研究中，通過優(yōu)化氮源，發(fā)現(xiàn)谷氨酸鈉、酵母提取物和胰蛋白胨能促進(jìn)細(xì)胞生長和角鯊烯的產(chǎn)生，通過優(yōu)化3種氮源的最佳濃度，谷氨酸鈉、酵母提取物和胰蛋白胨的最佳濃度分別為6.61 mg/L、6.13 mg/L和4.50 mg/L，角鯊烯含量和角鯊烯產(chǎn)量分別達(dá)到0.72 mg/g DCW和5.90 mg/L［26］。從目前總體的研究結(jié)果看，葡萄糖為破囊壺菌產(chǎn)角鯊烯的最優(yōu)碳源，谷氨酸鈉、酵母提取物和胰蛋白胨為最優(yōu)氮源。

針對碳氮源的研究，除了選擇適當(dāng)?shù)奶嫉捶N類外，碳氮源的濃度也是影響破囊壺菌細(xì)胞生長和代謝的重要因素［58］。在較低濃度范圍內(nèi)，隨著碳源濃度的升高，破囊壺菌的生長速度加快；當(dāng)碳源濃度增加到一定量時(shí)，其生長速度會減緩甚至生長受到抑制［59］。氮源濃度的升高能夠促進(jìn)菌體的生長，但不利于油脂以及角鯊烯的積累［60］。破囊壺菌Schizochytrium mangrovei PQ6在以酵母提取物為唯一氮源時(shí)，在濃度為0.5%-4%范圍內(nèi)，1%的酵母提取物濃度對角鯊烯的產(chǎn)生和細(xì)胞的生長最有利［32］。當(dāng)以葡萄糖為碳源時(shí)，葡萄糖濃度變化對角鯊烯的產(chǎn)量也有很大的影響。表2列舉了一些破囊壺菌在最佳碳源條件下的角鯊烯產(chǎn)量。將葡萄糖濃度優(yōu)化至30 g/L時(shí)，破囊壺菌Aurantiochytrium mangrovei FB3的角鯊烯含量提高到2.21 mg/L［3］。破囊壺菌Aurantiochytrium sp. TWZ-97在10 g/L-40 g/L葡萄糖濃度之間培養(yǎng)，角鯊烯濃度沒有顯著變化［47］。與之相反的是，盡管破囊壺菌Aurantiochytrium sp.18W-13a的生物量隨葡萄糖濃度（20 g/L-90 g/L）的增加而增加，但其角鯊烯產(chǎn)量（mg/g DCW）卻降低了［61］。這些相異的結(jié)果表明，在不同濃度碳源的影響下，同一屬的不同菌株可能顯示出不同的生長特性。因此，了解菌株的生理對于培養(yǎng)策略的優(yōu)化至關(guān)重要。

總之，不同破囊壺菌菌株對碳源和氮源的選擇性不同，因此在實(shí)際操作中應(yīng)當(dāng)針對不同菌株使用不同的培養(yǎng)基成分及配比。葡萄糖是最常用的碳源，谷氨酸鈉、酵母提取物和胰蛋白胨是最合適的氮源。同時(shí)，在生產(chǎn)中應(yīng)適當(dāng)考慮實(shí)際效益情況，盡量選擇來源廣、易獲取，價(jià)格低的原料進(jìn)行生產(chǎn)，盡量降低生產(chǎn)成本，以獲得最大的經(jīng)濟(jì)效益。

3.2 鹽度

海洋微生物因其生長環(huán)境而表現(xiàn)出對NaCl 特殊的敏感性，NaCl 不僅可以維持細(xì)胞內(nèi)滲透壓平衡，而且還參與酸堿平衡調(diào)節(jié)、氨基酸利用等一系列代謝活動［26］。因此，NaCl 濃度是影響海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)的重要環(huán)境因子［63］。破囊壺菌的生長代謝也受到 NaCl 濃度影響，在保持滲透壓平衡的前提下適量減少培養(yǎng)基中 NaCl 濃度可以促進(jìn)其細(xì)胞增殖，其生長速度和脂肪酸產(chǎn)量均有一定程度提高［64］。角鯊烯的產(chǎn)量受NaCl濃度的影響很大，在較高NaCl濃度條件下角鯊烯產(chǎn)量和生物量均有不同程度的降低。例如，Aurantiochytrium sp. 18W-13a在25%-50% 的海水濃度條件下，角鯊烯產(chǎn)量達(dá)到最大值0.9 g/L（171 mg/g DCW），比先前報(bào)道的產(chǎn)量高出幾百倍，當(dāng)75% 海水濃度條件下，角鯊烯產(chǎn)量和生物量顯著降低［61，65］。同樣，破囊壺菌 Aurantiochytrium sp.TWZ-97在（0-7.5）g/L NaCl濃度范圍內(nèi)，菌株的生長無明顯變化（10.4±0.26）g/L，當(dāng)NaCl濃度為2.5 g/L時(shí)角鯊烯產(chǎn)量最高，為125.2 mg/L，是空白的1.89倍；然而，當(dāng)培養(yǎng)基中NaCl濃度高于7.5 g/L時(shí)，破囊壺菌的生物量和角鯊烯濃度下降［47］。以上研究表明NaCl 濃度對破囊壺菌的生長及其代謝產(chǎn)物的合成積累均有較大影響。但 NaCl影響角鯊烯合成的機(jī)理尚未明確，文獻(xiàn)中也鮮有報(bào)道。

表2 海洋破囊壺菌在最佳碳源條件下的角鯊烯產(chǎn)量Table 2 Squalene production of marine Thraustochytrids under optimal carbon source conditions

3.3 培養(yǎng)時(shí)間

在有氧培養(yǎng)條件下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，角鯊烯含量會減少，這可能與角鯊烯向固醇等下游代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化有關(guān)［66］。角鯊烯是固醇生物合成的關(guān)鍵中間體，并且角鯊烯環(huán)氧化酶催化在固醇途徑中利用角鯊烯的第一步是生成（S）-角鯊烯2，3-環(huán)氧化物，這是一個(gè)需要氧氣的步驟［67］。足夠的分子氧濃度對于此步驟的活性至關(guān)重要［68］。因此，細(xì)胞角鯊烯在有氧條件下會被進(jìn)一步代謝以合成固醇，而不是在當(dāng)前的富氧條件下積累。

為了防止角鯊烯的進(jìn)一步氧化，培養(yǎng)時(shí)間的準(zhǔn)確把握是優(yōu)化破囊壺菌角鯊烯產(chǎn)量的重要條件。針對不同的菌株，角鯊烯產(chǎn)量達(dá)到最高值的培養(yǎng)天數(shù)常常不同。例如，破囊壺菌Aurantiochytrium sp. T66的角鯊烯產(chǎn)量從培養(yǎng)24 h的0.05 g/L增加到96 h的0.72 g/L，繼續(xù)培養(yǎng)到第120 h角鯊烯產(chǎn)量下降到0.44 g/L［35］。破囊壺菌 Schizochytrium mangrovei FB1 培養(yǎng)3 d后角鯊烯含量達(dá)到最高值0.16 mg/g DCW，5 d后僅為 0.04 mg/g DCW［45］。Aurantiochytrium mangrovei FB 3在固定的葡萄糖濃度下，角鯊烯含量和產(chǎn)量在指數(shù)生長期（第1天）達(dá)到最高2.21 mg/L，但從第2天（初始穩(wěn)定期）開始下降，從培養(yǎng)的第1天到第5天，角鯊烯含量和產(chǎn)量分別下降了至少10倍和4 倍［3］。破 囊 壺 菌 Aurantiochytrium sp. BR-MP4-A1的角鯊烯含量與培養(yǎng)時(shí)間高度相關(guān)，角鯊烯的最高含量在36 h（0.567 mg/g DCW）達(dá)到，但此后迅速下降［26］。與上述結(jié)果不同，Schizochytrium mangrovei PQ6的角鯊烯含量分別在培養(yǎng)的第4天和第5天達(dá)到最大值，分別為12.56 g/L和60.97 mg/g DCW。這種差異可能是由不同菌株的生長代謝特性所致［32］。

3.4 中試放大

微生物在生物反應(yīng)器中的放大培養(yǎng)，是在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模培養(yǎng)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，模擬工業(yè)化條件所進(jìn)行的工藝研究，其目的是驗(yàn)證相關(guān)工藝流程規(guī)?；\(yùn)行的可行性，以及菌株是否具有放大培養(yǎng)和工業(yè)化生產(chǎn)的潛力，從而為正式商業(yè)化生產(chǎn)的工藝設(shè)計(jì)提供數(shù)據(jù)［69］。

破囊壺菌Schizochytrium mangrovei PQ6分別在30 L和150 L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)生產(chǎn)角鯊烯，獲得的含量均為33 mg/g DCW，產(chǎn)量分別達(dá)到0.99 g/L和1.01 g/L［32］。本課題組的研究發(fā)現(xiàn)，Aurantiochytrium sp. TWZ-97在250 mL搖瓶中角鯊烯產(chǎn)量為140.4 mg/L，當(dāng)在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)時(shí)，角鯊烯產(chǎn) 量 為 188.6 mg/L［47］。Aurantiochytrium sp. T66 在250 mL燒瓶中培養(yǎng)時(shí)，最大角鯊烯產(chǎn)量為69.31 mg/g DCW（0.72 g/L），但在1 L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)時(shí)，其最大產(chǎn)量增加至88.47 mg/g DCW（1.0 g/L）［35］。

在目前的破囊壺菌放大試驗(yàn)中，由于物理或化學(xué)參數(shù)在放大前后會有所改變，因此實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)規(guī)模的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)條件和細(xì)胞的生理狀態(tài)存在顯著差異［70］，會影響角鯊烯的產(chǎn)量和質(zhì)量［71-72］。現(xiàn)有的放大技術(shù)難以實(shí)現(xiàn)破囊壺菌發(fā)酵低能耗、高效率、高產(chǎn)角鯊烯的目標(biāo)［73］，因此對其進(jìn)行放大發(fā)酵研究仍然是工業(yè)化生產(chǎn)的一大難點(diǎn)。

4 激素對角鯊烯產(chǎn)量的調(diào)控

為了進(jìn)一步提高微生物發(fā)酵生產(chǎn)角鯊烯的效率，除優(yōu)化其培養(yǎng)的環(huán)境條件外，角鯊烯生物合成途徑中關(guān)鍵酶活性的代謝調(diào)控也是研究熱點(diǎn)之一［74］。

茉莉酸甲酯（MeJA）是一種有效的脂類調(diào)節(jié)劑，可以調(diào)節(jié)植物的各種生理過程，如生長、衰老、生殖以及對機(jī)械損傷和發(fā)病的反應(yīng)［75-76］。在有關(guān)茉莉酸甲酯對角鯊烯生物合成影響的眾多研究中，主要通過提高角鯊烯合成酶的活性來促進(jìn)角鯊烯產(chǎn)量［77］，目前對角鯊烯生物合成通路中其它調(diào)控位點(diǎn)的影響還不明確［78］。0.1 mmol/L濃度的茉莉酸甲酯加入到Schizochytrium mangrovei培養(yǎng)基中，導(dǎo)致角鯊烯在48 h迅速積累，達(dá)到未處理組的1.6倍［74］。在Chlamydomonas reinhardtii培養(yǎng)過程中加入1 mmol/L茉莉酸甲酯發(fā)現(xiàn)，茉莉酸甲酯抑制了細(xì)胞的生長，并且加入茉莉酸甲酯后與對照組相比，角鯊烯產(chǎn)量增加了4倍，同時(shí)發(fā)現(xiàn)MEP通路中5種酶的編碼基因的表達(dá)水平均上調(diào)［79］。茉莉酸甲酯對角鯊烯產(chǎn)量的提高有一定的作用，并且提高了角鯊烯合成酶的活性，但是其對通路上其他酶活性的影響還需要進(jìn)一步研究。

特比奈芬是一種著名的角鯊烯環(huán)氧化酶抑制劑，抑制該酶的活性可防止角鯊烯進(jìn)一步降解，并可能增加角鯊烯在細(xì)胞中的積累［80］。在培養(yǎng)Chlamydomonas reinhardtii過程中加入50 mg/L特比奈芬，角鯊烯產(chǎn)量達(dá)到18.7 nmol/mg DCW，當(dāng)特比奈芬濃度提高到150 mg/L時(shí)，細(xì)胞被殺死，并且未檢測到角鯊烯和固醇，說明角鯊烯環(huán)氧酶活性是固醇生物合成和細(xì)胞存活所必需的［81］。在3種硅藻Phaeodactylum tricornutum，Thalassiosira pseudonana和Chaetoceros muelleri中加入10 μmol/L特比奈芬，未觀察到角鯊烯積累，但是觀察到其它固醇成分的微小變化，說明硅藻對特比奈芬不敏感，并且特比奈芬可以作用于除角鯊烯環(huán)氧化酶以外的其它酶類［78］。10 mg/L和100 mg/L特比奈芬濃度使破囊壺菌Aurantiochytrium mangrovei FB3的角鯊烯產(chǎn)生明顯的積累，與對照組相比，角鯊烯含量分別增加36%和 40%［45］。破囊壺菌 Schizochytrium mangrovei PQ6在加入特比奈芬培養(yǎng)的條件下發(fā)生輕微的細(xì)胞生長抑制，同時(shí)角鯊烯產(chǎn)量顯著增加至100 mg/L，與對照組相比增加了56.44%［32］。因此，特比奈芬對破囊壺菌角鯊烯產(chǎn)量的促進(jìn)作用因菌株而異，并且相關(guān)的生物學(xué)機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入探究。

綜上所述，添加合適的激素類物質(zhì)可以不同程度促進(jìn)破囊壺菌的角鯊烯產(chǎn)量，但是國內(nèi)外學(xué)者在這方面的研究仍然有限。我們不僅要繼續(xù)發(fā)掘能促進(jìn)角鯊烯生產(chǎn)的激素類物質(zhì)，還需要對這些物質(zhì)影響角鯊烯生產(chǎn)的機(jī)理進(jìn)行研究，以更好更快的實(shí)現(xiàn)破囊壺菌角鯊烯制品的工業(yè)化生產(chǎn)。

5 結(jié)語

隨著生活水平的不斷提高，人們對角鯊烯的認(rèn)識不斷深入，傳統(tǒng)鯊魚肝油和植物籽油的來源已越來越難滿足人們對角鯊烯產(chǎn)品日益增長的需求。因此，作為潛在的替代來源，海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)角鯊烯具有深入研究發(fā)展的需要。為了提高破囊壺菌的角鯊烯產(chǎn)量，目前的研究主要集中在菌株的分離篩選、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化、發(fā)酵工藝流程改進(jìn)等方面。為了進(jìn)一步提升破囊壺菌生產(chǎn)角鯊烯的能力，未來的研究可以從角鯊烯合成通路入手，通過對角鯊烯合成通路中的基因及相關(guān)酶的研究，調(diào)控其關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，最終運(yùn)用分子生物手段提高角鯊烯的產(chǎn)量。雖然當(dāng)前對破囊壺菌代謝途徑的研究及基因改造已取得初步進(jìn)展，但是利用破囊壺菌大規(guī)模生產(chǎn)角鯊烯仍面臨諸多困難，包括由于目前高產(chǎn)角鯊烯的原始菌株少，細(xì)胞生長和角鯊烯產(chǎn)量不穩(wěn)定，角鯊烯在破囊壺菌中的合成機(jī)理及其調(diào)控機(jī)制仍未完全闡明，能夠提高角鯊烯產(chǎn)量的激素類物質(zhì)種類少等。因此，未來仍應(yīng)繼續(xù)篩選高產(chǎn)角鯊烯的破囊壺菌并優(yōu)化其培養(yǎng)發(fā)酵條件，深入研究角鯊烯生物合成通路中關(guān)鍵基因的結(jié)構(gòu)和功能并全面揭示角鯊烯合成的分子機(jī)理，同時(shí)應(yīng)進(jìn)一步探索激素類物質(zhì)對破囊壺菌角鯊烯積累過程的影響，為實(shí)現(xiàn)破囊壺菌生產(chǎn)角鯊烯的工業(yè)化應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)，從而推動角鯊烯在醫(yī)藥、食品、保健品、化妝品等諸多領(lǐng)域的應(yīng)用。