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    細(xì)菌素的研究與應(yīng)用進(jìn)展

    2021-05-14 06:01:36田露吳咪緱敬軒龔國(guó)利
    生物技術(shù)通報(bào) 2021年4期
    關(guān)鍵詞:丙氨酸耐藥性細(xì)菌

    田露 吳咪 緱敬軒 龔國(guó)利

    (陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,西安 710021)

    食源性病原體是影響食品質(zhì)量的重要因素,威脅著人類的身體健康,甚至造成致命的影響[1]。例如,單核細(xì)胞增生李斯特菌、腸球菌、鏈球菌、葡萄球菌、芽孢桿菌和大腸桿菌等病原體進(jìn)入人體組織后,會(huì)引起呼吸道感染、全身感染和腸道感染及癌癥等疾病。因此,在食品中添加化學(xué)防腐劑或天然防腐劑是必不可少的。

    天然防腐劑,主要是由微生物分泌的次生代謝產(chǎn)物或體內(nèi)存在的具有抗菌作用的物質(zhì)。在微生物中,乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)可產(chǎn)生一系列活性抗菌物質(zhì)(有機(jī)酸、過氧化氫或細(xì)菌素)[2],其中細(xì)菌素因高抑菌、低毒性等特點(diǎn)而具有較強(qiáng)的生物保存潛力。

    細(xì)菌素是由核糖體合成的具有20-60個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的分泌抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs),具有疏水性,能抑制革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性食品致病菌,因此提供了新的策略與病原菌作戰(zhàn)[3]。其中,LAB產(chǎn)生的乳酸鏈球菌(Nisin)已被食品藥品管理局授予“一般認(rèn)為安全”(generally recognized as safe,GRAS)的安全性指標(biāo)[4]。Nisin被發(fā)現(xiàn)能抑制奶酪和其他食物中肉毒桿菌孢子的萌發(fā)。乳酸桿菌產(chǎn)生的Pediocin PA-1,具有延長(zhǎng)多種即食產(chǎn)品貨架期的潛力,特別是抑制單核細(xì)胞增生李斯特菌的生長(zhǎng)[5]。

    細(xì)菌素對(duì)其產(chǎn)生菌也有毒性,但通過一系列免疫蛋白,它們可以進(jìn)行自我保護(hù)[6]。編碼細(xì)菌素、免疫蛋白和其他輔助蛋白的基因排列成操縱子,這些操縱子存在于基因組、質(zhì)粒或其他可移動(dòng)的基因元件中。一般來說,這些操縱子是可誘導(dǎo)的,需要分泌和細(xì)胞外積累的肽誘導(dǎo)[7]。

    微生物對(duì)細(xì)菌素的敏感性是由于細(xì)菌素與細(xì)菌細(xì)胞表面和細(xì)胞膜的相互作用所致。細(xì)胞膜通透性和孔隙形成是細(xì)菌素攻擊靶細(xì)菌的主要機(jī)制[8]。然而,一些食物致病菌對(duì)Nisin和Pediocin等細(xì)菌素產(chǎn)生耐藥性的報(bào)道表明,耐藥性的增加可能會(huì)損害細(xì)菌素在生物保存中的潛在作用[9]。因此,為解決細(xì)菌素耐藥性問題,需進(jìn)一步了解細(xì)菌素的功能及其降解機(jī)理。

    由于細(xì)菌細(xì)胞膜表面電荷和膜流動(dòng)性是細(xì)菌素在抑菌過程中所利用的兩個(gè)特性,對(duì)這些特性的操縱會(huì)使細(xì)菌素?zé)o效,從而導(dǎo)致細(xì)菌素耐藥性[8]。然而,許多研究表明,不同細(xì)菌素組合使用或與其他抗菌化合物組合使用可克服細(xì)菌素的耐藥性。由于細(xì)菌素是由核糖體合成的抗菌肽,因此通過生物工程技術(shù)改造特定的氨基酸殘基能夠使其更有效地抵抗食品腐敗菌[9]。本文綜述了細(xì)菌素的分類、合成和抑菌機(jī)理以及生產(chǎn)方法,介紹了細(xì)菌對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)生抗性的機(jī)制以及減輕細(xì)菌素耐藥性的方法,進(jìn)一步闡明了細(xì)菌素在食品保鮮中作為天然防腐劑的潛在應(yīng)用。

    1 細(xì)菌素的分類

    細(xì)菌素最初被分為I、II、III和IV四類。其中I類細(xì)菌素包含19-50個(gè)氨基酸,如羊毛硫氨酸、N-甲基羊毛硫氨酸、脫氫酪氨酸和脫氫丙氨酸等非編碼氨基酸[10]。I類細(xì)菌素可進(jìn)一步劃分為Ia類(Lantibiotics)、Ib類(Labyrinthopeptins)和Ic類(Sanctibiotics)。

    II類細(xì)菌素是一類具有熱穩(wěn)定性、未經(jīng)修飾的小肽,可進(jìn)一步劃分為IIa類(類片球菌素)、IIb類(兩肽未修飾的細(xì)菌素)、IIc類(環(huán)狀細(xì)菌素)和IId類(未修飾的、線性的和非類片菌素)[11]。其中較為典型的Bactofencin A是一種具有某些特殊功能的新型IId細(xì)菌素,它與某些真核生物的陽(yáng)離子抗菌肽相似,具有高度陽(yáng)離子化的特征[12]。此外,Bactofencin A的另一個(gè)獨(dú)特之處在于,它與特異性免疫蛋白不同,它表現(xiàn)出dltB同源物介導(dǎo)的免疫功能,可降低細(xì)胞壁的負(fù)電荷,從而阻礙細(xì)菌素與細(xì)胞之間的相互作用[12]。

    III類細(xì)菌素是一類分子量大且熱不穩(wěn)定的細(xì)菌素。如大腸桿菌產(chǎn)生的大腸桿菌素,彎曲乳桿菌、益生乳酸菌和糞腸球菌產(chǎn)生的Helveticin M、Helveticin J和 Enterolysin A[13]。其中 Helveticin M 可破壞革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁和革蘭氏陰性菌的外膜,因此對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有效。

    IV類細(xì)菌素由碳水化合物或脂質(zhì)成分的大復(fù)合物組成,已被終止并被命名為由溶菌素S和Nisin 27組成的溶菌素[14]。因此,細(xì)菌素主要分為以上3類。具體分類及屬性,見表1。

    2 細(xì)菌素的合成及其抑菌機(jī)理

    產(chǎn)生活性細(xì)菌素的基因通常在操縱子簇中,存在于基因組,質(zhì)?;蚱渌梢苿?dòng)的遺傳元件中。這些操縱子的表達(dá)是可誘導(dǎo)的,需要自誘導(dǎo)肽的誘導(dǎo)[23]。細(xì)菌素的表達(dá)通常受兩組分系統(tǒng)調(diào)控,但在某些情況下受三組分系統(tǒng)調(diào)控。Nisin是通過激活兩組分調(diào)控系統(tǒng)而充當(dāng)其表達(dá)的自誘導(dǎo)劑。但是,某些細(xì)菌素例外,它們具有自己獨(dú)特的調(diào)節(jié)與表達(dá)方式。例如,LsbB細(xì)菌素,位于lsbB基因下游的轉(zhuǎn)錄終止子,通過將RNA穩(wěn)定性提高3倍來調(diào)節(jié)其表達(dá),從而使表達(dá)增加30倍[23]。有研究表明,細(xì)菌素Brevicin 174A的產(chǎn)生和自我抗性受兩種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的控制,它們?cè)谄渲谐洚?dāng)積極的自我調(diào)節(jié)作用[7]。

    細(xì)菌素是作為前體肽合成的,但前體肽不具備生物活性,需經(jīng)過加工、翻譯修飾和轉(zhuǎn)運(yùn)后才能形成成熟的細(xì)菌素[24]。用于修飾和輸出的基因位于細(xì)菌素生物合成基因附近。細(xì)菌素的類型不同,修飾可能會(huì)有所不同。像ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和Sec依賴性蛋白這樣的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白用于細(xì)菌素的分泌[25]。

    表1 細(xì)菌素的分類及屬性Table 1 Classification and properties of bacteriocins

    不同種類的細(xì)菌素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌有不同的作用機(jī)制。由于大多數(shù)細(xì)菌素是陽(yáng)離子型的,因此細(xì)菌素分子與細(xì)菌表面陰離子成分之間的相互作用在細(xì)菌素產(chǎn)生活性的初始階段起著至關(guān)重要的作用。細(xì)菌素采取構(gòu)型,以使帶正電的基團(tuán)與帶負(fù)電的細(xì)菌表面發(fā)生靜電相互作用,而疏水性表面朝向膜排列并穿過脂質(zhì)雙分子層,刺入脂質(zhì)雙分子層后,肽段自締合或聚合形成復(fù)合物[26]。細(xì)菌素誘導(dǎo)靶細(xì)菌細(xì)胞膜通透性,可能是通過形成離子選擇性孔而引起的。這些孔會(huì)導(dǎo)致鉀、鎂、磷離子、氨基酸和ATP等小分子的流出,從而引起膜電位的擾動(dòng),pH梯度和質(zhì)子泵的功能受到抑制。細(xì)胞中低水平的ATP和離子缺乏會(huì)導(dǎo)致DNA、RNA、蛋白質(zhì)和多糖合成受到抑制,最終導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞死亡[27]。

    細(xì)菌素需磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)對(duì)接分子(如脂質(zhì)II或甘露糖滲透酶)與膜相互作用。也存在某些細(xì)菌素可能不需要靶受體進(jìn)行對(duì)接。Garvicin ML,來源于乳球菌DCC43的環(huán)狀細(xì)菌素,利用麥芽糖ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和滲透酶作為受體[28]。對(duì)接分子可增強(qiáng)羊毛硫細(xì)菌素孔的傳導(dǎo)性和穩(wěn)定性,但目標(biāo)膜中的受體可能決定II類細(xì)菌素的特異性[8]。I類細(xì)菌素是帶有羊毛硫氨酸殘基的羊毛硫細(xì)菌素,形成分子內(nèi)硫醚環(huán)[29]。II類細(xì)菌素很小,具有窄譜的抑菌活性。羊毛硫細(xì)菌素在“楔形”模型中形成孔,而II類細(xì)菌素通過“桶壁”孔或“地毯”機(jī)制增加膜通透性[8]。

    3 細(xì)菌素的生產(chǎn)方法

    研究表明,細(xì)菌素主要是通過菌株的發(fā)酵生產(chǎn)。由于微生物發(fā)酵法產(chǎn)生的細(xì)菌素產(chǎn)量低且純化繁瑣。因此開發(fā)了固相肽化學(xué)合成法(solid phase peptide chemical synthesis,SPPS)和異源表達(dá)法生產(chǎn)細(xì)菌素。

    3.1 發(fā)酵法

    在含有乳清粉(5% W/W)和酵母提取物(0.2%W/W)的培養(yǎng)基中,用乳酸乳球菌ATCC發(fā)酵生產(chǎn)Nisin。將種子培養(yǎng)物(2.5% W/W)接種到發(fā)酵液中,一旦乳酸濃度達(dá)到25 g/L,停止發(fā)酵并將溫度升高至50℃,以停止細(xì)菌的生物活性。所獲得的Nisin濃度為3 000 IU/mL,蒸發(fā)發(fā)酵液以得到濃縮的Nisin[30]。

    細(xì)菌素的產(chǎn)量取決于發(fā)酵培養(yǎng)基的組成,發(fā)酵培養(yǎng)基約占生產(chǎn)成本的30%。多種低分子復(fù)雜介質(zhì)使蛋白質(zhì)純化變得更加繁瑣,從而增加了生產(chǎn)成本[31]。對(duì)反應(yīng)動(dòng)力學(xué),發(fā)酵過程建模以及用便宜培養(yǎng)基代替昂貴培養(yǎng)基的研究將是促進(jìn)細(xì)菌素生產(chǎn)和應(yīng)用的重中之重。

    3.2 化學(xué)合成法

    由于微生物發(fā)酵法產(chǎn)生的細(xì)菌素產(chǎn)量低,純化繁瑣,因此開發(fā)了SPPS生產(chǎn)細(xì)菌素。用于合成肽的試劑和構(gòu)建基元的價(jià)格降低,以及催化天然蛋白翻譯和修飾的化學(xué)進(jìn)步,使化學(xué)合成法成為生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的一種替代方法。

    細(xì)菌素AS-48是由70個(gè)氨基酸組成的環(huán)狀肽。首先合成線性肽,并通過Asn/Asp(Asx)特異性連接酶將其環(huán)化。合成后的環(huán)狀細(xì)菌素在0.24-1.27 μmol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)大腸桿菌,金黃色葡萄球菌,糞腸球菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌均有活性[32]。以HMPB-ChemMatrix樹脂為原料,采用Fmoc/tBu合成Pediocin PA-1。Pediocin PA-1的總產(chǎn)率為11%,對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的MIC值為6.8 μmol/L。Pediocin PA-1也顯示出對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的顯著抗菌活性[33]?;瘜W(xué)合成是獲得純細(xì)菌素以避免微生物發(fā)酵后繁瑣純化細(xì)菌素的良好起點(diǎn)。但低產(chǎn)量仍是一個(gè)瓶頸,需要進(jìn)一步優(yōu)化工藝以提高產(chǎn)量。

    3.3 異源表達(dá)法

    隨著基因工程技術(shù)的廣泛應(yīng)用,許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)通過異源分泌表達(dá)產(chǎn)生細(xì)菌素可克服發(fā)酵法與合成法的部分缺點(diǎn)。通常用于產(chǎn)生細(xì)菌素的表達(dá)宿主為細(xì)菌和酵母細(xì)胞。

    從中國(guó)大港油田中分離出熱反硝化地芽孢桿菌NG80-2。該分離物可表達(dá)廣譜地桿菌素I和II。在大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞中擴(kuò)增并異源表達(dá)地桿菌素I和II的編碼序列。與地桿菌素II相比,地桿菌素I對(duì)許多耐藥病原微生物具有活性。地桿菌素I與Nisin相似,它通過與脂質(zhì)II分子結(jié)合以劑量依賴的方式抑制肽聚糖的合成[34]。因此開發(fā)異源表達(dá)系統(tǒng)以提高細(xì)菌素產(chǎn)量,且有助于擴(kuò)大其在食品和制藥行業(yè)中的應(yīng)用[35]。

    4 細(xì)菌對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制

    所有生物都有適應(yīng)環(huán)境變化的內(nèi)在趨勢(shì)。目標(biāo)細(xì)菌持續(xù)暴露在細(xì)菌素當(dāng)中會(huì)產(chǎn)生抵抗細(xì)菌素的成分,從而導(dǎo)致細(xì)菌素耐藥性。由于反復(fù)使用細(xì)菌素,致使某些細(xì)菌對(duì)細(xì)菌素的耐藥性日趨嚴(yán)重。目標(biāo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制不同,革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞壁由相對(duì)較厚的多層肽聚糖組成,溶葡萄球菌素可裂解葡萄球菌類細(xì)胞壁肽擴(kuò)張層中的聚甘氨酸交聯(lián)鍵[36]。目標(biāo)細(xì)菌也可通過中和細(xì)胞壁的凈負(fù)電荷來逃逸細(xì)菌素。細(xì)菌對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制各不相同,以下總結(jié)了細(xì)菌對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)生耐藥性的常見機(jī)制。

    4.1 細(xì)菌素對(duì)接分子膜受體的變化

    細(xì)菌素系于脂質(zhì)II、甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)、十一異戊二烯焦磷酸磷酸酶、麥芽糖ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體和鋅離子依賴性金屬內(nèi)肽酶上。甘露糖特異性磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(Man PTS)基因在耐細(xì)菌素的單核細(xì)胞增生李斯特菌中表達(dá)較低,表明受體密度低影響細(xì)菌素的結(jié)合[36]。Garvicin ML需要麥芽糖ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體復(fù)合物作為受體,缺乏這種復(fù)合物會(huì)導(dǎo)致腸球菌科的耐藥性。

    4.2 細(xì)胞壁磷壁酸的D-丙氨酸化

    由于磷壁酸組成的變化,獲得耐藥性的細(xì)菌細(xì)胞壁負(fù)電荷降低。磷壁酸是一種富含磷酸根的陰離子聚合物,它由聚甘油磷酸酯組成,該磷酸甘油酯通過糖脂錨定蛋白與膜相連[37],或聚核糖醇磷酸可形成磷壁酸核心,也可存在于其他多元醇中,如甘露醇、赤蘚糖醇和阿拉伯糖醇中。磷壁酸的核糖醇磷酸骨架可被D-丙氨酸取代以形成D-丙氨酸酯鍵。通常,磷壁酸給細(xì)胞壁帶來負(fù)電荷,但當(dāng)它D-丙氨酸化后,給細(xì)胞壁帶來正電荷,從而導(dǎo)致陰離子聚合物的中和。金黃色葡萄球菌對(duì)達(dá)托霉素的耐藥性是由磷壁酸的D-丙氨酸化引起的。在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中,由dlt操縱子編碼的4種蛋白質(zhì)是合成磷壁酸D-丙氨酸酯所必需的。鼠李糖乳桿菌的研究表明了這4種蛋白質(zhì)(DltA-D)的作用[38]。DltA充當(dāng)D-丙氨酰-D-丙氨酸載體蛋白連接酶(Dcl),該酶通過ATP水解激活D-丙氨酸,并將其轉(zhuǎn)移至由dltC編碼的D-丙氨酸載體蛋白(Dcp)的磷酸泛素輔助因子上。疏水性DltB是一種膜蛋白,它是D-丙氨酸與磷壁酸結(jié)合和活化D-丙氨酸跨細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)移所必需的。DltD負(fù)責(zé)將D-丙氨酸從膜載體DltB轉(zhuǎn)移到磷壁酸[38]。已發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌中dlt操縱子的失活賦予了病原菌對(duì)細(xì)菌素的敏感性。此外,糞便大腸桿菌和肺炎鏈球菌中dltA的缺失導(dǎo)致磷壁酸中缺乏D-丙氨酸,使該菌株對(duì)細(xì)菌素更加敏感[39]。與野生型相比,在糞便大腸桿菌的耐片球菌素的突變體中觀察到D-丙氨酸的變化:磷的比率增加,中和細(xì)胞壁表面電荷,從而增加了片球菌素?cái)U(kuò)散至增生間隙的通透性屏障[40]。

    4.3 細(xì)胞膜磷脂的L-賴氨?;?/h3>

    由于磷壁酸通過D-丙氨酸化成為一種毒力劑,一些細(xì)菌用L-賴氨酸修飾陰離子磷脂,產(chǎn)生堿性賴氨酰磷脂酰甘油,它賦予細(xì)胞質(zhì)膜正電荷,可以保護(hù)細(xì)菌免受細(xì)菌素的侵害,包括達(dá)托霉素[41]。在高抗性單核細(xì)胞增生李斯特菌,金黃色葡萄球菌,糞腸球菌等菌株中,已觀察到膜磷脂的賴氨酸含量增加。由mprF基因編碼的MprF蛋白是磷脂賴氨?;匦璧?。事實(shí)上,MprF可用賴氨酸或丙氨酸修飾細(xì)菌磷脂酰甘油,以改變膜電荷[42]。

    磷脂酰甘油的極性頭被Ala-tRNA(Ala)依賴性的丙氨酰-磷脂酰甘油合酶或Lys-tRNA(Lys)依賴性的賴氨酰-磷脂酰甘油合酶氨?;欣谝赘屑?xì)菌暴露在細(xì)菌素當(dāng)中時(shí)得以生存[43]。這種含氨基酸的膜脂是應(yīng)激狀態(tài)的標(biāo)志,并適應(yīng)不斷變化的環(huán)境條件[44]。

    4.4 細(xì)胞膜脂肪酸組成的變化

    耐細(xì)菌素病原體中飽和脂肪酸和支鏈脂肪酸的比例增加,可表現(xiàn)為更高的膜剛性,更少的流動(dòng)性,防止細(xì)菌素滲透進(jìn)入病原體細(xì)胞[45]。有趣的是,病原體采取相同的策略來逃避氨芐青霉素、氯霉素、紅霉素和四環(huán)素等抗生素。畢竟細(xì)菌素是抗生素的一個(gè)子集。芽孢桿菌和假單胞菌產(chǎn)生的AMPs被用作抗生素[46],而LAB產(chǎn)生的AMPs被用作食品防腐劑。多黏菌素、達(dá)托霉素和表面活性物質(zhì)等是具有抗生素用途的環(huán)脂肽[47]。

    4.5 細(xì)菌素之間的交叉耐藥性

    由于細(xì)菌素的聯(lián)合使用,尤其是具有不同作用機(jī)理的細(xì)菌素組合使用,可能會(huì)減少或阻止細(xì)菌素耐藥性的發(fā)展,因此對(duì)于確定“對(duì)兩種細(xì)菌素中的一種產(chǎn)生耐藥性之后是否會(huì)發(fā)生交叉耐藥性”至關(guān)重要[48]。Crandall等[49]報(bào)道單核細(xì)胞增生李斯特菌對(duì)Nisin的耐藥性賦予了對(duì)pediocin PA-1的交叉耐藥性。在另一項(xiàng)研究中,單核細(xì)胞增生李斯特菌顯示出對(duì)Nisin、pediocin PA-1和leuconocin S的耐藥性。Gravesen等[48]發(fā)現(xiàn),Nisin和IIa類細(xì)菌素(pediocin PA-1和leucocin A)之間有一定程度的交叉耐藥性。他們還觀察到IIa類細(xì)菌素(pediocin PA-1、leucocin A和carnobacteriocin B2)之間完全交叉耐藥。

    5 克服細(xì)菌素耐藥性的方法

    細(xì)菌素可通過不同的機(jī)制產(chǎn)生耐藥性,即使是在同一菌種的不同菌株之間也是如此。此外,屬于不同類別的細(xì)菌素可能有相似的耐藥機(jī)制。但細(xì)菌素耐藥性的發(fā)展不會(huì)妨礙細(xì)菌素的預(yù)期用途,因?yàn)橛幸恍┎呗钥捎糜陬A(yù)防或克服這種耐藥性。

    單憑細(xì)菌素可能不足以破壞食物中的病原微生物。過量的細(xì)菌素可能導(dǎo)致非特異性殺菌作用,并且可能對(duì)消費(fèi)者造成危害。因此,考慮將細(xì)菌素與其他抗菌劑結(jié)合以增加其抑菌作用。在這方面,植物精油已顯示出希望[50]。百里香、小茴香、香菜、薄荷、鼠尾草、熏衣草、牛至和肉桂精油已被用作食品防腐劑。牛至精油(0.6%)和Nisin(500 IU/g)組合可抑制肉末腸炎沙門氏菌[51]。百里香精油(0.6%)與Nisin(500-1 000 IU/g)組合可抑制單核細(xì)胞增生李斯特菌的生長(zhǎng)[52]。用Nisin(0.3 ppm)修飾的百里香素可抑制香腸中的傷寒沙門氏菌[53]。除精油外,輻照也可以提高細(xì)菌素的功效。封裝的Nisin與牛至和肉桂精油組合可增強(qiáng)單核細(xì)胞增生李斯特菌對(duì)γ射線的敏感性[54]。

    除了將細(xì)菌素與其他抗菌化合物組合之外,將兩種具有不同作用機(jī)理的細(xì)菌素組合也可提高對(duì)細(xì)菌靶標(biāo)的效力。細(xì)菌素的組合使最小抑菌濃度顯著降低,從而降低抑菌劑量。許多研究表明,將兩種細(xì)菌素一起使用具有很多優(yōu)勢(shì),如Nisin和Pediocin AcH或Leucocin F10的組合。當(dāng)同時(shí)或按順序添加Nisin和Nisin 13時(shí),可更有效地對(duì)抗單核細(xì)胞增生李斯特菌[55]。研究表明,細(xì)菌素AS-48和Nisin已被共同用于對(duì)抗金黃色葡萄球菌,并發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)使用一種細(xì)菌素相比,該組合在抑菌方面更加有效。由于對(duì)特定細(xì)菌素的抗性可能會(huì)擴(kuò)展到其他細(xì)菌素,尤其是同一亞類的細(xì)菌素[56]。因此,在組合使用不同的細(xì)菌素之前,應(yīng)研究交叉耐藥性發(fā)展的初步測(cè)試,使耐藥性的出現(xiàn)最小化。

    另一種方法是合理設(shè)計(jì)細(xì)菌素以提高抑菌活性。與抗生素不同,細(xì)菌素可以在某些氨基酸處突變,以使其更有效地對(duì)抗靶標(biāo)。像Nisin A已通過單個(gè)Met21-Val取代被修飾為Nisin V,與Nisin A相比,其抗單核細(xì)胞增生李斯特菌的功效增強(qiáng)[57]。已經(jīng)對(duì)Nisin進(jìn)行了一些誘變研究,以提高其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌的功效。用乳鏈菌肽Durancin GL進(jìn)行定點(diǎn)誘變的丙氨酸掃描突變分析表明,幾個(gè)氨基酸殘基對(duì)其抗菌活性具有重要意義,而突變后的殘基會(huì)提高抗菌活性[58]。Lacticin 3147還可以在選定的氨基酸殘基處突變,以增強(qiáng)其抗菌活性。研究表明,Bactofencin A已在幾個(gè)氨基酸殘基處突變,以了解哪些氨基酸殘基對(duì)其抗金黃色葡萄球菌活性是必不可少的,哪些氨基酸殘基突變以進(jìn)一步增強(qiáng)其抑菌活性[59]。考慮到所有方法,生物工程技術(shù)將始終是增強(qiáng)細(xì)菌素抗菌活性最有希望的方法。

    6 細(xì)菌素在食品領(lǐng)域的應(yīng)用

    如今,消費(fèi)者要求提供安全、健康、美味、保質(zhì)期長(zhǎng)且加工少的食品。LAB是食品級(jí)微生物,已被廣泛用于食品保存中,其中許多具有GRAS安全性指標(biāo)。因此,LAB產(chǎn)生的細(xì)菌素和其他代謝物通常也被認(rèn)為是具有一定特性的安全化合物(如穩(wěn)定性、抗菌活性、毒性低、無(wú)風(fēng)味變化)[60]。到目前為止,只有Nisin和Pediocin PA-1被商業(yè)化為食品添加劑。但其他細(xì)菌素也為其在食品領(lǐng)域用作生物防腐劑提供了廣闊的前景,如腸球蛋白AS-48[61]。

    細(xì)菌素在食品中的應(yīng)用方式一般有兩種,一種是以純化或半純化細(xì)菌素制劑形式添加,如Nisin是50多個(gè)國(guó)家唯一獲許可用作生物防腐劑的細(xì)菌素。然而,由于多種因素,如吸附到食物成分,酶降解,不良的溶解性或食物基質(zhì)中分布不均,細(xì)菌素在食物系統(tǒng)中的有效性通常很低。通過將產(chǎn)生活細(xì)菌素的細(xì)菌應(yīng)用于食品中可克服使用純化細(xì)菌素的局限性[62]。將乳酸菌添加到乳制品(酸奶和奶酪)中將確保在整個(gè)成熟和儲(chǔ)存過程中連續(xù)產(chǎn)生細(xì)菌素,并可作為發(fā)酵中的輔助培養(yǎng)物使用。

    另一種是以細(xì)菌產(chǎn)生的濃縮發(fā)酵液的形式添加。例如,ALTA 2431TM(Quest)是一種來自Pediocin PA的發(fā)酵產(chǎn)物[63]。產(chǎn)生細(xì)菌素的菌株也可直接接種到食品中作為發(fā)酵劑、輔料或保護(hù)性培養(yǎng)物。實(shí)際上,LAB及其細(xì)菌素已在傳統(tǒng)食品生產(chǎn)中用作發(fā)酵劑。但是在數(shù)千種細(xì)菌素中,只有少數(shù)用于食品保存,因?yàn)槠渌氖怯卸镜?。中草藥中的?xì)菌素和真菌毒素與肝毒性有關(guān)。同時(shí)細(xì)菌素是一組抗菌劑,能夠引起與抗生素相同的危害[64]。因此,應(yīng)避免在食品等重要物品中濫用細(xì)菌素。在積極發(fā)現(xiàn)新的細(xì)菌素的同時(shí),應(yīng)積極探索其工程化、與其他殺菌劑相結(jié)合,同時(shí)也應(yīng)探索其他食品保鮮方式,并降低細(xì)菌素的毒性,為其作為生物防腐劑奠定基礎(chǔ)。

    近來,細(xì)菌素也被摻入包裝膜中以控制食源性致病菌,從而確保細(xì)菌素逐漸釋放到食品中并避免與食物成分相互作用而使細(xì)菌素失活[65]。此外,一些研究表明,與高壓、有機(jī)酸、酚類化合物和脈沖電場(chǎng)等物理化學(xué)方法結(jié)合使用時(shí),細(xì)菌素對(duì)革蘭氏陰性菌的抗菌活性顯著增強(qiáng)。

    7 展望

    細(xì)菌素在食品加工、保存和食品安全中具有廣闊的應(yīng)用前景。隨著分子生物技術(shù)的進(jìn)步,基因工程技術(shù)的成熟,可通過基因工程和蛋白質(zhì)工程以生產(chǎn)新型細(xì)菌素,從而提高細(xì)菌素的應(yīng)用潛力。但是選擇新型細(xì)菌素作為生物防腐劑之前需深入了解細(xì)菌素產(chǎn)生的分子機(jī)制、免疫機(jī)制和作用方式,并進(jìn)行綜合研究從而評(píng)估其安全性。雖然一些細(xì)菌素如Nisin在特定的食品體系中得到了商業(yè)化的應(yīng)用,但由于細(xì)菌素的局限性以及各種食品基質(zhì)的其他影響因素,限制了細(xì)菌素的廣泛應(yīng)用。細(xì)菌素的這些局限性可通過設(shè)計(jì)細(xì)菌素,使其熱穩(wěn)定和pH穩(wěn)定、改善擴(kuò)散率來克服。此外,生產(chǎn)和純化成本也阻礙了細(xì)菌素的廣泛應(yīng)用。這些問題可通過細(xì)菌素在營(yíng)養(yǎng)需求量最小的細(xì)菌宿主中異源表達(dá)來克服。這將在很大程度上直接降低生產(chǎn)成本。然而,像抗生素耐藥性一樣,細(xì)菌素耐藥性也可能是災(zāi)難性的,因此在日常生活中探索使用細(xì)菌素時(shí)應(yīng)格外小心。此外,還需要毒理學(xué)數(shù)據(jù)以確定GRAS的安全性指標(biāo)和細(xì)菌素應(yīng)用于食品中的法律批準(zhǔn)。

    細(xì)菌素可與其他保鮮方法結(jié)合使用,以減少微生物引起的食品腐敗。已經(jīng)證明,使用化學(xué)防腐劑、物理處理(熱)或新型溫和的非熱物理方法(脈沖電場(chǎng)、高靜水壓、真空或改良的大氣包裝)可有效地提高許多細(xì)菌素的活性。使用合適的組合不僅在經(jīng)濟(jì)上具有吸引力,而且可以提高食品的安全性、感官和營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量。隨著將細(xì)菌素和產(chǎn)生細(xì)菌素的菌株摻入食品基質(zhì)和包裝材料中的新技術(shù)出現(xiàn),預(yù)計(jì)未來在食品保鮮行業(yè)中對(duì)細(xì)菌素的需求將會(huì)增加。因此,細(xì)菌素作為天然食品防腐劑顯然可以替代常規(guī)的苛刻的物理和化學(xué)防腐劑。

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