草甘膦對(duì)微生物影響的研究進(jìn)展

梁鑫 張寶善 劉繼瑞 余偲 陳思雨

（1. 陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，西安 710119；2. 安康市農(nóng)業(yè)綜合執(zhí)法支隊(duì)，安康 725000）

草甘膦（Glyphosate）在1959年被化學(xué)合成，1971年開(kāi)始用作農(nóng)業(yè)除草劑，因其高效、廣譜、廉價(jià)等特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于去除農(nóng)作物中的雜草［1］?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)它可清除超過(guò)100種一年生雜草和60種多年生雜草，成為世界上應(yīng)用最廣、產(chǎn)量最大的農(nóng)藥品種，其年銷(xiāo)售量一直居農(nóng)藥之首。2019年僅中國(guó)就生產(chǎn)草甘膦5.5×105t，占全球生產(chǎn)量的60%，也是全球第四大應(yīng)用市場(chǎng)。幾十年來(lái)，草甘膦一直被認(rèn)為是一種安全、高效的除草劑，容易經(jīng)過(guò)電化學(xué)氧化、光催化降解、微生物和植物的降解與吸附，還容易被生物作為營(yíng)養(yǎng)重新利用和吸收，對(duì)保障全球糧食產(chǎn)量的貢獻(xiàn)等同于百年來(lái)青霉素對(duì)抗擊疾病的作用。為了更好地使用草甘膦，擴(kuò)大應(yīng)用領(lǐng)域，抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因大豆、煙草、棉花相繼被培育成功并在全球大面積種植［2］。

隨著草甘膦在全球的推廣和使用，一些負(fù)面作用日趨明顯。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）對(duì)草甘膦安全性提出嚴(yán)重質(zhì)疑，并在2015年將草甘膦歸類(lèi)為“可能的人類(lèi)致癌物”（第2A組），引起了全球轟動(dòng)［3］。雖然美國(guó)、歐洲化學(xué)品管理局（ECHA）、聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）和歐盟以外的許多組織（如加拿大、日本、澳大利亞和新西蘭）都對(duì)IARC的說(shuō)法提出反對(duì)意見(jiàn)，但不少?lài)?guó)家和學(xué)者對(duì)草甘膦及其代謝產(chǎn)物的生物安全、暴露值及危害因子等愈發(fā)重視，主要爭(zhēng)論點(diǎn)集中于：（1）在環(huán)境中的殘留量；（2）對(duì)生態(tài)的影響；（3）對(duì)動(dòng)植物和人體的安全性。諸多報(bào)道表明，在海水、淡水、土壤、大氣等環(huán)境中，都不同程度地檢測(cè)到草甘膦及其中間代謝產(chǎn)物氨甲基膦酸（AMPA）。疏松土壤中的蚯蚓在使用除草劑后生命活性下降；使用草甘膦種植的小麥被加工成面粉后，在面粉中檢測(cè)到了草甘膦；草甘膦被用于茶園除草后，在茶園和茶葉上均檢測(cè)到了一定含量的草甘膦及其代謝物AMPA。Ledoux等［4］研究發(fā)現(xiàn)，蜜蜂占主要作物授粉昆蟲(chóng)總數(shù)的80%，它在覓食過(guò)程中，可通過(guò)花粉、花蜜、水和灰塵接觸草甘膦，并將污染物轉(zhuǎn)移到蜂巢［5］。從蜂箱直接采集的蜂蜜樣品和從商店購(gòu)買(mǎi)的蜂蜜樣品中，分別有27%和33%的樣品可檢測(cè)到草甘膦殘留。草甘膦可能會(huì)損害蜜蜂的健康，包括擾亂其腸道菌群、減輕幼蟲(chóng)體重、減少短期記憶、損害覓食者的聯(lián)想記憶［5］，還可能會(huì)降低幼體存活率。在美國(guó)夏威夷，從“有機(jī)”農(nóng)產(chǎn)品上也檢測(cè)到草甘膦殘留物［6］。加拿大食品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)（CFIA）在2015年至2016年期間對(duì)3 188份食品樣品進(jìn)行了測(cè)試，發(fā)現(xiàn)29.7%的樣品含有草甘膦［6］。歐盟對(duì)水果、蔬菜和其他食品進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)45%的樣品可檢測(cè)到的農(nóng)藥殘留，其中大約8%的樣品含有草甘膦。Cuhra等［7］用含草甘膦的飼料養(yǎng)雞，在其肝、脾、肺、腸、心和腎等不同器官中均檢測(cè)到了草甘膦［8-9］。從德國(guó)和丹麥奶牛的尿液中檢測(cè)到草甘膦的含量分別為20 μg/L和40 μg/L，但在不使用草甘膦的地區(qū)，奶牛尿液中的草甘膦含量低于2 μg/L。其它研究結(jié)果顯示，草甘膦對(duì)脊椎動(dòng)物具有遺傳毒性［10］、致畸性、細(xì)胞毒性并會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［11］。

草甘膦會(huì)影響動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)遞質(zhì)，還會(huì)抑制細(xì)胞色素P450酶系的作用與合成，并會(huì)促進(jìn)人體內(nèi)雌激素依賴(lài)性乳腺癌細(xì)胞增殖［12］。其他證據(jù)還顯示，草甘膦還能使人類(lèi)乳腺上皮細(xì)胞、胎盤(pán)細(xì)胞、臍帶細(xì)胞中的DNA以及細(xì)胞水平上的內(nèi)分泌系統(tǒng)受損［13］，并對(duì)精子具有毒性。草甘膦在人體內(nèi)的作用方式主要是抑制乙酰膽堿酯酶（AChE）的活性，AChE又影響雄激素和雌激素的合成，因而草甘膦會(huì)導(dǎo)致人體內(nèi)雌雄激素失衡［14］。因此，近年來(lái)許多國(guó)家對(duì)草甘膦在農(nóng)產(chǎn)品的最大殘留量（MRLs）進(jìn)行了規(guī)定（表1），歐盟的部分國(guó)家、印度、越南和斯里蘭卡等國(guó)提出限制和逐步禁用草甘膦的政策，中國(guó)貴州省在2014年也禁止在茶園中使用草甘膦。

微生物是地球生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，它的存在維持了自然生態(tài)系統(tǒng)的平衡。從草甘膦用于除草劑開(kāi)始，人們認(rèn)識(shí)到其抑制雜草生長(zhǎng)的機(jī)理與抑制微生物的機(jī)理基本相同，由此推斷，草甘膦對(duì)微生物的危害程度可能更甚于對(duì)植物的影響。但分析諸多的研究報(bào)道后發(fā)現(xiàn)，多數(shù)學(xué)者更關(guān)注將微生物作為基因的載體和工具用于尋找微生物的抗（耐）草甘膦基因和發(fā)現(xiàn)可降解除草劑的微生物等方面，而對(duì)草甘膦等除草劑影響微生物尤其是有益微生物的生長(zhǎng)代謝、遺傳變異和生物群落演變的深入研究卻較少。

1 草甘膦對(duì)植物和微生物的作用機(jī)制比較

生化研究表明，原核微生物的細(xì)菌、放線(xiàn)菌，真核微生物的酵母、霉菌與植物的芳香族化合物代謝途徑是一致的，均經(jīng)過(guò)莽草酸途徑進(jìn)行生物代謝［16］?；诿Р菟嵬緩?，在植物學(xué)研究方面開(kāi)發(fā)了以草甘膦為基礎(chǔ)的除草劑和大量的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物；在微生物學(xué)方面，利用大腸桿菌（Escherichia coli）、谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等微生物進(jìn)行生物合成天然和非天然芳香族化合物及其衍生物，如“達(dá)菲”藥物合成前體莽草酸、大宗化學(xué)品己二酸前體順，順-黏康酸、化妝品活性成分熊果苷等化合物。江晶潔等［17］利用阻斷草甘膦莽草酸途徑，通過(guò)合成芳香族氨基酸達(dá)到控制植物生長(zhǎng)的目的，其機(jī)理見(jiàn)圖 1［2］。

有關(guān)草甘膦除草的作用機(jī)理已認(rèn)識(shí)清楚，許多學(xué)者都認(rèn)為草甘膦對(duì)微生物作用的生理生化機(jī)制和對(duì)植物的作用機(jī)制基本相同［18］。莽草酸-3-磷酸合酶（EC 2.5.1.19）是植物、真菌、藻類(lèi)和細(xì)菌莽草酸途徑的關(guān)鍵酶，催化磷酸烯醇丙酮酸（PEP）到莽草酸3-磷酸（S3P）的5-羥基位置的烯醇丙酮酸部分的轉(zhuǎn)移，從而促進(jìn)分支酸和芳香氨基酸的生物合成［19］。草甘膦通過(guò)抑制5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）來(lái)阻止某些細(xì)菌和真菌中苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸的合成，EPSPS也會(huì)導(dǎo)致敏感微生物中莽草酸-3-磷酸和羥基苯甲酸的積累和排泄。動(dòng)力學(xué)特征證明，草甘膦是一種可逆的EPSPS抑制劑，通過(guò)與PEP競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到活性位點(diǎn)。細(xì)菌EPSPS對(duì)草甘膦的敏感性差異很大，Pollegioni等［19］將植物和微生物EPSPS分為兩類(lèi)：敏感類(lèi)（I類(lèi)）和相對(duì)不敏感類(lèi)（II類(lèi)）。細(xì)菌，如鼠傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella typhimurium）、大腸桿菌和假單胞菌（Pseudomonas putida）屬于I類(lèi)，在低濃度除草

劑下EPSP合成酶被抑制，如E. coli的 EPSPS對(duì)草甘膦具有高度敏感性（IC50 1.6 μmol/L）；Ⅱ類(lèi)指草甘膦耐受微生物，包括農(nóng)桿菌CP4（Agrobacterium sp. CP4）、無(wú)色桿菌（Achromo bacter sp.）和假單胞菌PG2982（Pseudomonas sp. PG2982），后來(lái)又發(fā)現(xiàn)了其它的Ⅱ類(lèi)EPSPS，通常是G+細(xì)菌，包括肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）和金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus），其對(duì)草甘膦的抗性是由EPSPS氨基酸序列的變異引起的［20］。

表1 主要農(nóng)產(chǎn)品中草甘膦最大殘留量（MRLs，mg/kg）[15]Table 1 Maximum residues of glyphosate in main agricultural products

圖1 莽草酸合成芳香族氨基酸的途徑及草甘膦對(duì) EPSPS 催化反應(yīng)的作用方式Fig.1 Pathway of shikimic acid to synthesize aromatic amino acids and the action mode of glyphosate on the catalytic reaction of EPSPS

生物學(xué)家根據(jù)草甘膦阻斷植物和微生物莽草酸途徑機(jī)理，通過(guò)基因改良獲得了許多能夠抗草甘膦、或能降解和利用草甘膦的微生物菌株，對(duì)消除草甘膦在自然界富集和阻止生態(tài)被破壞起到了重要作用，同時(shí)將微生物中的抗草甘膦基因用于植物，培育了大豆、玉米、煙草等許多抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物［21］。但人們關(guān)注更多的是：哪些微生物能抗草甘膦？哪些能分解草甘膦？如何將微生物抗草甘膦基因整合于植物中以獲得高抗性的轉(zhuǎn)基因植物？而有關(guān)草甘膦對(duì)微生物的詳細(xì)抑制機(jī)制卻鮮有報(bào)道。

2 草甘膦對(duì)土壤微生物的影響

土壤微生物是保持農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的基礎(chǔ)，也是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)，其多樣性直接關(guān)系到農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。草甘膦是一種極性分子，有磷酸基、氨基和羧基3個(gè)活性基，容易被土壤牢固吸附且不易流失。土壤中草甘膦來(lái)源途徑有：（1）人為活動(dòng)直接噴灑于土壤表層；（2）通過(guò)水灌溉或雨雪帶入；（3）經(jīng)植物葉莖吸收傳輸；（4）通過(guò)微生物及其它生物間接輸送。

長(zhǎng)期以來(lái)，有關(guān)草甘膦對(duì)土壤微生物的影響研究結(jié)果分為兩類(lèi)：一類(lèi)學(xué)者認(rèn)為，其對(duì)土壤微生物個(gè)體和群體影響不大，在土壤生態(tài)系統(tǒng)中，草甘膦可被微生物和植物降解、再吸收，土壤和微生物之間存在自平衡作用［20］。Hart等［22］研究了施用草甘膦19年后的土壤，與未經(jīng)處理的對(duì)照組相比，試驗(yàn)組中微生物生物量、呼吸和氮礦化沒(méi)有差異。Powell等［23］在4年間對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆與近等位系敏感品種進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)二者根系微生物對(duì)凋落物分解速率基本相同，但草甘膦降低了土壤表層凋落物的分解速率，而對(duì)深層凋落物分解速率沒(méi)有影響。凋落物中真菌生物量與細(xì)菌生物量的比值只是偶有不同，原生生物和線(xiàn)蟲(chóng)種群沒(méi)有受到影響。但隨著草甘膦的長(zhǎng)期使用，常在地表水、河床沉積物及地下水中檢測(cè)到草甘膦的主要代謝產(chǎn)物AMPA［24］，因此另一類(lèi)學(xué)者認(rèn)為草甘膦對(duì)土壤微生物有重要影響，可直接作用于微生物個(gè)體和群體變化，進(jìn)而改變土壤有機(jī)質(zhì)含量和植物的抗病特性，最終影響了自然生態(tài)。陶波等［25］研究發(fā)現(xiàn)草甘膦對(duì)大豆根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）的抑制作用與草甘膦濃度呈正比，低濃度草甘膦對(duì)鐮刀菌（Fusarium）產(chǎn)生激活作用，高濃度草甘膦對(duì)鐮刀菌具有抑制作用，但伴隨草甘膦加入時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)大豆根瘤菌的抑制作用逐漸減弱。

將草甘膦直接作用于土壤微生物，研究發(fā)現(xiàn)，1 025 mg/kg草甘膦可完全抑制細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)，（205-1 025）mg/kg的草甘膦對(duì)放線(xiàn)菌的抑制率達(dá)100%，（1.64-205）mg/kg的濃度對(duì)細(xì)菌種群也表現(xiàn)出抑制作用［26］，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著加藥時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)微生物的抑制作用逐漸減弱［27］。Zobiole等［28］發(fā)現(xiàn)，草甘膦處理對(duì)大豆根際土壤中鐮刀菌、熒光假單胞菌（Fluorescent pseudomonads）、錳轉(zhuǎn)化菌（Mn-transforming bacteria）和吲哚乙酸產(chǎn)生菌等微生物種群間的相互作用產(chǎn)生負(fù)面影響，導(dǎo)致有益的熒光假單胞菌、錳還原菌和吲哚乙酸產(chǎn)生菌數(shù)量減少，而有害的鐮刀菌數(shù)量增加。根際假單胞菌、錳還原菌能夠產(chǎn)生大量的次生代謝產(chǎn)物包括鐵載體、氰化氫、胞外酶和各種抗生素，從而提高養(yǎng)分利用率并抑制競(jìng)爭(zhēng)微生物群，介導(dǎo)錳轉(zhuǎn)化（主要是錳還原），從而對(duì)植物養(yǎng)分利用和代謝過(guò)程產(chǎn)生重大影響。

Newman等［29］發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照相比，大豆和玉米經(jīng)草甘膦處理后，各類(lèi)蛋白細(xì)菌（Proteobacteria）相對(duì)豐度均有所增加，尤其γ-桿菌（Gammaproteobacteria）增加最多，玉米中增加1.5%，大豆中增加0.7%，這些菌屬于黃單菌目（Xanthomonadales），主要是華桿菌科（Sinobacteraceae）和黃單胞菌科（Xanthomonadaceae）。經(jīng)草甘膦處理后，酸桿菌（Acidobacteria）的相對(duì)豐度呈下降趨勢(shì)，玉米和大豆的放線(xiàn)菌平均相對(duì)豐度分別從16.45%和14.35%降至14.95%和12.60%。

Mandl等［30］發(fā)現(xiàn)，與機(jī)械除草相比，使用草甘膦處理雜草的葡萄園中，在土壤中沒(méi)有檢測(cè)到毛霉，但有160多種不同的細(xì)菌被發(fā)現(xiàn)，其中一些是第一次在葡萄園土壤中檢測(cè)到。經(jīng)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，經(jīng)除草劑處理的土壤細(xì)菌中總數(shù)比機(jī)械除草處理的土壤中高260%，因此認(rèn)為是除草劑引起了葡萄園土壤中微生物的種類(lèi)變化。貧瘠土壤中微生物的生物量隨著甘膦施用量的增加而減小。

草甘膦加入土壤后，對(duì)酸性土壤、中性土壤和堿性土壤的真菌群落多樣性都產(chǎn)生了一定的影響。陳望舒［31］研究發(fā)現(xiàn)，草甘膦進(jìn)入土壤會(huì)抑制酸性土壤和中性土壤的細(xì)菌多樣性，但可促進(jìn)堿性土壤中的細(xì)菌多樣性。酸性土壤中蠟樣芽胞桿菌（Bacillus）和鏈霉菌屬（Streptomycetaceae）可以降解草甘膦，為自身提供碳和氮源，因此酸性土壤中的草甘膦更容易被降解。另外，通過(guò)對(duì)比施用草甘膦的貧瘠和肥沃土壤中微生物的微量熱曲線(xiàn)發(fā)現(xiàn)，微生物均隨著草甘膦濃度的增大而出現(xiàn)代活動(dòng)變緩的現(xiàn)象，而肥沃土壤對(duì)微生物具有一定的保護(hù)作用，其半致死量（IC50）是貧瘠土壤的2.2倍［32］。

研究還發(fā)現(xiàn)，在較高的草甘膦使用量下，微生物生物量碳（Cmic）降低了45%，可培養(yǎng)細(xì)菌和真菌數(shù)量分別減少了84%和63%，真菌生物量減少了29%［33］。但在此條件下，革蘭氏陰性（G-）菌群的分解代謝活性顯著提高。DGGE分析表明，草甘膦使用量大的土壤中的細(xì)菌群落以G-細(xì)菌為主，通過(guò)基因檢測(cè)抗草甘膦基因的復(fù)制數(shù)量顯著增加，主要為羅爾斯通氏菌（Ralstonia sp.），γ-變形菌（Gammaproteobacterium）和伯克霍爾德菌（Burkholderia sp.）。由于G-細(xì)菌具有特定的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，因此比其它微生物更能抵抗化學(xué)威脅，并能夠降解一些化學(xué)物質(zhì)［34］。雖然草甘膦對(duì)土壤微生物群落的影響不同，但總體趨勢(shì)是隨時(shí)間推移，細(xì)菌群落組成自適應(yīng)地向更耐草甘膦的物種轉(zhuǎn)移［35］。已有學(xué)者初步發(fā)現(xiàn)草甘膦轉(zhuǎn)基因植物根際土壤微生物的變化規(guī)律［20］，草甘膦的使用導(dǎo)致大多數(shù)根際細(xì)菌和所有真菌生物量減少，并通過(guò)改變細(xì)菌群落的組成從而有利于更多耐草甘膦的細(xì)菌微生物群落的產(chǎn)生，隨后這可能影響到碳（C）、氮（N）和磷（P）循環(huán)。草甘膦在轉(zhuǎn)基因作物上使用后最初在分泌物中釋放，后來(lái)從腐爛的組織中釋放，還可通過(guò)根部釋放，在抗草甘膦轉(zhuǎn)基因（GR）的玉米根中也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的轉(zhuǎn)移模式，施用草甘膦4 d后，根際土壤中草甘膦濃度達(dá)到0.07 mg/kg。劉慧璐等［36］研究了種植抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)土壤微生物數(shù)量的影響，連續(xù)幾年的試驗(yàn)結(jié)果均發(fā)現(xiàn)，種植轉(zhuǎn)基因大豆顯著降低了土壤細(xì)菌、氨化細(xì)菌和硝化細(xì)菌的數(shù)量。她們認(rèn)為轉(zhuǎn)基因大豆不同程度地降低了根際土壤細(xì)菌的數(shù)量和細(xì)菌群落的多樣性，并且對(duì)根際土壤細(xì)菌屬（Nitrospira sp.）有一定抑制作用。對(duì)草甘膦影響GR大豆根際Mn氧化劑和Mn還原劑比值的觀察發(fā)現(xiàn)，草甘膦降低了土壤中的植物有效錳和植物對(duì)Mn的吸收，進(jìn)而影響了微生物的變化。

Druile等［37］研究了草甘膦對(duì)叢枝菌根（Arbuscular mycorrhiza）孢子活力及定殖能力的影響，發(fā)現(xiàn)播種1個(gè)月后，未經(jīng)除草劑處理的土壤孢子活力比處理組高5.8-7倍，經(jīng)處理的土壤中植物根系定殖率顯著低于未處理的土壤中植物根系定殖率，又因?yàn)閰仓撬拗骱驼婢B(yǎng)分交換的主要場(chǎng)所，因此草甘膦影響植物根系叢枝菌根真菌的生理活性從而影響到根系植物的定殖作用。該結(jié)果同時(shí)意味著植物和真菌的共生功能受到了影響，并推測(cè)叢枝菌根繁殖體活力的下降可能會(huì)影響植物多樣性［37］。

3 草甘膦對(duì)有益微生物的影響

隨著草甘膦使用時(shí)間延長(zhǎng)，人們發(fā)現(xiàn)自然界中越來(lái)越多的生物含有草甘膦。微生物處在生態(tài)循環(huán)的最低端，草甘膦不僅影響到微生物個(gè)體和群體的變化，更重要的是以微生物為介質(zhì)影響動(dòng)植物和人類(lèi)的生命活動(dòng)。不同種類(lèi)的微生物EPSPS對(duì)草甘膦的敏感性不盡相同，許多革蘭氏陰性細(xì)菌如大腸桿菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella typhimurium）在低濃度的草甘膦條件下生長(zhǎng)被抑制；而農(nóng)桿菌CP4、無(wú)色桿菌和假單胞菌PG2982（Pseudomonas sp.PG2982）等菌株的EPSPS對(duì)草甘膦不敏感，能在高濃度的草甘膦中存活［19］，后來(lái)又發(fā)現(xiàn)一些革蘭氏陽(yáng)性菌，包括肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）也對(duì)草甘膦不敏感，這一類(lèi)菌大部分都屬于有害微生物。 早 在 1987年，Chakravarty等［38］研 究 了 草甘膦和其商品Roundup對(duì)大毒滑銹傘（Hebeloma crustuliniforme）、 紅 蠟 蘑（Laccaria laccata）、 美 洲革 菌（Thelephoraceae americana）、 蒺 藜（Tribulus terrestris）和牛肝菌（Suillus）這5株根生真菌的毒性，在濃度超過(guò)10 ppm時(shí)即可導(dǎo)致這些真菌生長(zhǎng)緩慢。但研究學(xué)者還發(fā)現(xiàn)存在于小麥面粉中的草甘膦殘留物，經(jīng)酵母菌發(fā)酵面團(tuán)1 h后，其含量降低約1/5，這與草甘膦煮沸7 h的量大致相同。Braconi［39］通過(guò)研究草甘膦對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)活性的影響發(fā)現(xiàn)，草甘膦在3.04 mg/L的濃度下對(duì)松二糖的同化作用有抑制性，但對(duì)總代謝活性沒(méi)有影響，而在304 mg/L的濃度下，草甘膦能夠誘導(dǎo)L-脯氨酸的氧化和幾種碳源（纖維二糖、龍膽二糖、麥芽三糖、麥芽糖醇、甘露醇和山梨醇等）的產(chǎn)生，并抑制D-核糖和松二糖的生成。與對(duì)照組相比，高濃度草甘膦能使酵母菌的代謝活性提高80%，他們認(rèn)為酵母菌的這一特性可用來(lái)解釋為何在面包發(fā)酵過(guò)程中，面粉中草甘膦的濃度會(huì)不斷下降［39］。

Clair等［11］研 究 了 3種 食 品 微 生 物 白 地霉（Geotrichum candidum）乳酸乳球菌乳脂亞種（Lactococcus lactis subsp. Cremoris）和德氏乳桿菌保加利亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus）對(duì)草甘膦的敏感性（表2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，念珠菌（G. candidum）和乳酸乳桿菌（L. lactis）對(duì)草甘膦的敏感度比德氏乳桿菌（L.delbrueckii）更高，在Roundup?使用濃度在1 000 ppm下時(shí)，觀察到保加利亞乳桿菌的細(xì)胞內(nèi)容物似乎有漏出。通過(guò)分析不同微生物對(duì)草甘膦的敏感性度發(fā)現(xiàn)，真核細(xì)胞生物四膜蟲(chóng)（Tetrahymena pyriformis）比原核細(xì)胞微生物費(fèi)氏弧菌（Vibrio fischer）對(duì)草甘膦更為敏感［40］。

后來(lái)，Shehata等［41］又研究了草甘膦在體外對(duì)家禽微生物群的潛在病原體和有益微生物的影響，發(fā)現(xiàn)腸沙門(mén)氏菌（Salmonella entritidis）、雞傷寒沙門(mén)氏菌（S. gallinarum）、鼠傷寒沙門(mén)氏菌（S. typhimurium）、產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）和肉毒梭菌（C. botulinum）等高致病菌對(duì)草甘膦具有高度的抗性；而大多數(shù)有益細(xì)菌，如糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、屎腸球菌（E.faecium）、栗褐芽胞桿菌（Bacillus badius）、青春雙 歧 桿 菌（Bifidobacterium adolescentis）、 乳 酸 桿菌（Lactobacillus spp.）和彎曲桿菌（Campylobacter spp.）對(duì)草甘膦是中度至高度敏感的。有益菌中的腸球菌（Enterococcus）會(huì)抑制梭狀芽胞桿菌［42］，而草甘膦對(duì)腸球菌具有毒害作用，因此他推測(cè)草甘膦會(huì)干擾正常的腸道菌群。他還認(rèn)為草甘膦可能是過(guò)去10-15年德國(guó)的牛感染肉毒桿菌風(fēng)險(xiǎn)增加的一個(gè)重要因素［9］。腸球菌和雙歧桿菌（Bifidobacterium）對(duì)草甘膦敏感，而腐殖酸具有保護(hù)腸球菌和雙歧桿菌不受草甘膦殘留影響的功能，有助于減少草甘膦誘導(dǎo)的腸道有益菌失調(diào)的發(fā)生率，并降低肉毒桿菌感染的風(fēng)險(xiǎn)，因此認(rèn)為腐殖酸會(huì)抑制沙門(mén)氏菌等病原體的生長(zhǎng)。

表2 草甘膦對(duì)微生物的抑菌效果［11，41］Table 2 Antibacterial effect of glyphosate on microorganisms

4 能降解草甘膦的微生物

目前，減少生態(tài)環(huán)境中草甘膦的物理、化學(xué)和生物等方法較少。物理法有極性吸附劑吸附熱、酸堿處理等。此外，光催化劑與紫外線(xiàn)聯(lián)用可高效降解水介質(zhì)中的除草劑，但這兩種方法都有一定的局限性。利用微生物降解和轉(zhuǎn)化草甘膦等除草劑是最有效的途徑，也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一［43］，此方法也稱(chēng)生物修復(fù)法，是指通過(guò)使用微生物的降解作用將污染物轉(zhuǎn)化為毒性較小的化合物［44］，微生物及其分泌的酶可高效分解自然環(huán)境中的化學(xué)污染物，是一種成本低且安全高效的方法［45］。草甘膦在自然環(huán)境中的降解速率取決于微生物的降解速率，因此發(fā)現(xiàn)并確定可以降解草甘膦的微生物對(duì)防治草甘膦污染至為重要［46］。

根據(jù)已發(fā)現(xiàn)的微生物降解草甘膦作用機(jī)制，可將微生物降解草甘膦的途徑歸納為肌氨酸途徑和AMPA途徑（圖2）。（1）肌氨酸途徑：在微生物C—P裂解酶的作用下，草甘膦C—P鍵斷裂，生成肌氨酸，生成的肌氨酸在肌氨酸氧化還原酶的作用下，快速代謝生成甲醛和甘氨酸，并參與微生物的多個(gè)生理循環(huán)和提供磷源；（2）AMPA途徑：在草甘膦氧化還原酶（glyphosate oxidoreductase，GOX）作用下，草甘膦C—N鍵斷裂，生成AMPA和乙醛酸，部分AMPA會(huì)被微生物分解代謝，發(fā)生C—P鍵斷裂，未被完全分解的會(huì)被分泌出胞外進(jìn)入環(huán)境或再被其它微生物吸收分解，最終被礦化［47］，而乙醛酸則作為三羧酸循環(huán)的底物，參與微生物正常的代謝途徑。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，微生物的肌氨酸途徑在磷缺乏情況下才會(huì)發(fā)生，由于環(huán)境中大都存在充足的磷源，能滿(mǎn)足微生物的需求，因此草甘膦在環(huán)境中主要代謝生成AMPA。經(jīng)過(guò)肌氨酸途徑代謝的降解菌是將草甘膦作為唯一磷源，誘導(dǎo)C—P裂解酶生成，而在自然環(huán)境下，環(huán)境中充足的磷源會(huì)負(fù)調(diào)節(jié)裂解酶，使降解菌失去裂解草甘膦的能力［48-49］。草甘膦的3種主要中間代謝物是AMPA、肌氨酸和乙酰草甘膦（Acetylglyphosate），它們會(huì)再通過(guò)不同的代謝途徑被分解轉(zhuǎn)化。

圖2 草甘膦降解途徑Fig.2 Degradation pathway of glyphosate

表3 降解草甘膦的微生物［47，51-53］Table 3 Microorganisms that can degrade glyphosate［47，51-53］

表3續(xù)表

自1983年Moore等［50］篩選出了降解草甘膦的假單胞菌PG2982細(xì)菌后，許多學(xué)者相繼發(fā)現(xiàn)了有將草甘膦作為唯一磷源、或唯一碳源、氮源的微生物，也發(fā)現(xiàn)了可同時(shí)利用碳源和氮源進(jìn)行生命活動(dòng)的微生物，這些微生物包括大量的細(xì)菌和真菌。表3根據(jù)降解草甘膦的生化途徑對(duì)已發(fā)現(xiàn)的微生物進(jìn)行了歸納。在生物降解過(guò)程中，微生物代謝導(dǎo)致草甘膦分解成更小的分子，生物降解效率高于其它方法。影響微生物降解草甘膦的主要有微生物種類(lèi)、pH、作用溫度和草甘膦濃度等因素。目前，利用細(xì)菌降解草甘膦的研究比真菌多，用于草甘膦生物降解的C—P裂解酶系統(tǒng)在細(xì)菌中廣泛存在。從土壤中分離的真菌菌株，如帚霉屬（Scopulariopsis sp.）、綠色木霉（Trichoderma viride）、哈茨木霉（T.harzianum）、交鏈孢霉（Alternaria sp.）和黑曲霉（A. niger），這些真菌菌株通過(guò)AMPA途徑降解草甘膦。大多數(shù)微生物將草甘膦作為磷源進(jìn)行代謝，少數(shù)微生物將其作為碳源、氮源進(jìn)行代謝。然而在微生物生長(zhǎng)代謝過(guò)程中，對(duì)碳源的需求遠(yuǎn)高于對(duì)氮、磷源的需求。因此，利用草甘膦作為碳源的微生物可以產(chǎn)生更高效的去除過(guò)程；磷酸鹽影響草甘膦的降解，C—P鍵的裂解是肌氨酸通路的第一步，但在AMPA途徑中，C—P鍵的裂解是第二步，因此，磷酸鹽不影響黃桿菌（Flavobacterium sp.）將草甘膦降解為AMPA，但會(huì)影響假單胞菌（Pseudomonas sp. PG2982）降解草甘膦。研究表明，節(jié)桿菌菌株不能利用草甘膦作為氮源，是因草甘膦降解過(guò)程中釋放的過(guò)量磷酸鹽，抑制了細(xì)胞代謝。此外，在缺氧土壤中的草甘膦微生物降解率低于有氧土壤［54］。

5 總結(jié)與展望

由于草甘膦是一種極性分子，有磷酸基、氨基和羧基這3個(gè)活性基，容易被土壤吸附而不易流失。在草甘膦作為除草劑使用時(shí)，它還會(huì)通過(guò)抑制5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶對(duì)土壤微生物產(chǎn)生負(fù)面影響。長(zhǎng)此以往，草甘膦不僅會(huì)直接作用于土壤的微生物個(gè)體和群體，還會(huì)影響到一些微生物和植物的共生作用，進(jìn)而會(huì)影響土壤有機(jī)質(zhì)含量和植物的抗病性。研究還發(fā)現(xiàn)，土壤中存在著可通過(guò)肌氨酸途徑和AMPA途徑降解草甘膦的微生物，由于現(xiàn)在的土壤中磷源比較充足，因此可降解草甘膦的帚霉屬、綠色木霉、哈茨木霉、交鏈孢霉和黑曲霉等微生物主要通過(guò)AMPA途徑降解和轉(zhuǎn)化土壤中殘留的草甘膦。目前，降解環(huán)境中的草甘膦主要通過(guò)物理和化學(xué)方法，但二者均有一定的局限性。利用微生物降解和轉(zhuǎn)化草甘膦等除草劑的生物修復(fù)法不僅高效，而且還可以和物理化學(xué)法聯(lián)用，但仍存在著草甘膦中間代謝產(chǎn)物的殘留問(wèn)題，今后的研究可在降解草甘膦工藝優(yōu)化層面展開(kāi)。這對(duì)未來(lái)更安全高效地使用草甘膦等除草劑，減少環(huán)境污染均有一定的指導(dǎo)意義。