高效原油污染降解菌的篩選、鑒定及菌群的構(gòu)建

朱淑芳 EHENEDEN Iyobosa 寧海軍 尚潔昊 李武陽 孟憲剛

（蘭州交通大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，蘭州 730070）

石油是地下巖石中生成的、液態(tài)的、以碳氫化合物為主要成分的可燃性礦產(chǎn)，且直接從油井中開采出來未加工的石油稱為原油［1］。原油按組成分類分為蠟基原油、環(huán)烷基原油和中間基原油3類。石蠟基原油中烷烴較多；環(huán)烷基原油含環(huán)烷烴、芳香烴較多；中間基原油介于二者之間［2］；根據(jù)相對密度分為重質(zhì)原油（d420，0.9-1.0）和低質(zhì)原油（d420，0.77-0.85），重質(zhì)原油也稱為稠油，稠油與普通原油相比，膠質(zhì)和瀝青質(zhì)的含量較高［3］。由于原油中含有烷烴、環(huán)烷烴、芳香烴、含硫化合物等，其芳香烴中一些苯系物（甲苯、乙苯和二甲苯）揮發(fā)性大，在原油的加工、運輸、儲存過程中容易釋放到環(huán)境中，會對人體的血液、神經(jīng)系統(tǒng)具有較強危害［4］。硫化物是形成酸雨的主要原因，SO2有刺激性氣味，人吸入后會導(dǎo)致肺水腫甚至死亡［5］。

石油在開采、加工、運輸過程中難免會產(chǎn)生石油污染物，石油污染已經(jīng)成為我國突出的環(huán)境問題之一［6-7］。目前，工業(yè)上大多數(shù)都是用物理化學(xué)法處理原油污染物，而物理化學(xué)法處理成本高，存在二次污染。所以，以原油為唯一碳源，利用微生物降解原油污染物成了研究的熱點。據(jù)研究報道，降解石油烴的微生物有200多種，其中，細菌對原油的降解能力優(yōu)于真菌和放線菌［8］。常見原油降解菌有假單胞菌屬（Pseudomonas）、棒桿菌屬（Corynebacterium）、微球菌屬（Micrococcus）、產(chǎn)堿桿菌屬等（Alcaligenes）［9-10］。但這些菌株大都針對部分石油烴成分或者是輕質(zhì)原油，對于高黏度、高密度稠油的降解效果不是很顯著。例如，宋永亭等［11］從油田采出水篩選得到一株枯草芽孢桿菌屬（Bacillus subtilis sp.）S，在37℃、120 r/min對稠油處理14 d后，該菌株對瀝青質(zhì)降解率達34.87%。賈群超等［12］從石化廠周圍的油泥中分離到兩株不動桿菌屬（Acinetobacter sp.）GS02和 GS07，將 1 g/L的稠油處理5 d后，降解率分別為45.3%和46.1%。任妍君等［13］用從稠油污染土壤中分離得到一株彎曲芽孢桿菌（Bacillus flexus）DL1-G對稠油處理9 d后，該菌株對稠油的降解率39.89%。因此，篩選得到潛在的高效原油菌株對原油污染物的處理是至關(guān)重要的。本實驗以山東原油污染污泥為研究對象，從實驗室自有菌株及從污染源中分離出原油降解菌株，通過原油降解試驗檢測菌株對原油的降解能力，旨在篩選出原油高效降解菌株，并通過正交實驗得到原油降解高效菌群，旨為石油污染物的生物法治理提供優(yōu)秀的的烴降解菌株資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 山東某油田的含油污泥、實驗室自有菌種、山東某油田污染土壤。

1.1.2 試劑 牛肉膏（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；蛋白胨（上海中秦化學(xué)試劑有限公司）；氯化鈉（廣東光華科技股份有限公司）；七水合硫酸鎂（廣東光華科技股份有限公司）；七水合硫酸亞鐵（天津市蘇莊化學(xué)試劑廠）；磷酸二氫鉀（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；硝酸銨（萊陽化工試驗廠）；三氯化鐵（煙臺市雙雙化工有限公司）；硫酸銨（天津市北辰方正試劑廠）；硝酸鈉（天津市百世化工有限公司）；一水合磷酸二氫鈉（天津市北辰方正試劑廠）；硫酸銅（天津市化工三廠有限公司）；氯化鈣（天津市大茂化學(xué)試劑廠）。

1.1.3 儀器 SW-CJ-2G型雙人凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；SPX型智能生化培養(yǎng)箱（寧波東南儀器有限公司）；TGL-16G離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9012）（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；電子天平（FA2004N）（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；雙功能水浴恒溫振蕩器（常州天瑞儀器有限公司）。

1.1.4 培養(yǎng)基 NA液體培養(yǎng)基［14］：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.8-7.2，121℃滅菌20 min。NA固體培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.8-7.2，121℃滅菌 20 min。SY 培養(yǎng)基［15］：初 篩 KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NH4NO31 g，CaCl20.02 g，F(xiàn)eCl3痕量，原油2 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2-7.4，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。GJ培養(yǎng)基［15］：用于石油降解（NH4）2SO40.5g，NaNO30.5 g，KH2PO41 g，NaH2PO4·H2O 1 g，微量元素液 2 mL，pH 7.0，原油2 g，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。微量元素液：ZnSO40.1%，CaCl20.1%，CuSO40.15%，MgSO4·7H2O 0.4%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.15%。

1.2 方法

1.2.1 菌源的制備及富集培養(yǎng) 參考文獻［15］中的方法，取10 g油泥溶于90 mL的無菌水中，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱搖4 h后，靜置沉淀2 h，以上清液作為菌源，取2 mL上清液加入富集培養(yǎng)基中，以轉(zhuǎn)速150 r/min，30℃恒溫培養(yǎng)136 h，再吸取5 mL渾濁培養(yǎng)液加入到新鮮的SY培養(yǎng)基中，按上述條件連續(xù)培養(yǎng)3-4次，實現(xiàn)降解石油烴菌的富集。

1.2.2 高效菌株的分離純化 將上述1.2.1中制得的菌懸液取5 mL接種于GJ培養(yǎng)基中，在30℃，150 r/min的培養(yǎng)條件下，用恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)至GJ培養(yǎng)基渾濁，吸取1 mL做梯度稀釋涂布接種于石油平板上，30℃恒溫培養(yǎng)5-7 d，在NA培養(yǎng)基中反復(fù)劃線純化后得到單一菌落。

1.2.3 高效菌株的定性篩選 用2，6-二氯酚靛酚（2，6-dichlorophenol indophenol，DCPIP）方法［16-17］篩選石油降解菌株，純化后的菌株用初始發(fā)酵培養(yǎng)基（150 r/min、30℃）發(fā)酵培養(yǎng)48 h，10 000 r/min離心15 min，然后用0.85% NaCl 溶液洗滌兩次，調(diào)整其OD600為1。取一離心管并在其中加入200 μL GJ培養(yǎng)基（未添加石油）、30 μL 石油、20 mg/L DCPIP 作為氧化還原指示劑，加30 μL 經(jīng)上述處理的菌液后，在30℃下培養(yǎng)72 h，通過DCPIP顏色的變化作為衡量菌株降解石油的能力標準。每株菌株做3組平行樣。

1.2.4 高效菌株的16S rRNA基因序列的擴增及測定 將分離篩選的菌株分別接種于NA液體培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期后期或穩(wěn)定期，菌液渾濁。每個菌株分別取2 mL 菌液于離心管中，12 000 r/min 離心2 min，棄上清液留菌體，向離心管中加入500 μL無菌雙蒸水，渦旋30 s，置95℃水浴 5 min，12 000 r/min離心2 min。以上清液作為模板［18］。

采用細菌通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和 1492R ：5′-TACGACTTAACCCCAATCGC -3′對分離得到的菌株進行PCR擴增。反應(yīng)體系（25 μL）：PCR MIX 12.5 μL，上下游引物各 0.5 μL，ddH2O 10.5 μL，模板 1 μL，擴增程序為 ：95℃預(yù)變性5 min，進入PCR循環(huán)，94℃變性45 s，54℃退火 1.5 min，72℃延伸 10 min［19］。

1.2.5 高效菌株的定量篩選 將從1.2.4中篩選得到的菌株在NA培養(yǎng)基中進行活化，使菌液的OD600值為1，吸取8 mL菌液接種到含油量為0.25%的GJ培養(yǎng)基中，150 r/min、30℃下培養(yǎng)7 d后用重量法檢測石油的降解率，每組試驗3個平行，取平均值。

1.2.6 重量法檢測原油的降解率 參照 Gao等［20］的方法用重量法測定菌株對石油的降解率，用三氯甲烷萃取1.2.5中培養(yǎng)7 d后的處理液，在每個處理試樣中加入30 mL三氯甲烷，全部移入分液漏斗后充分搖勻，并靜置，待完全分層后，收集下相，再用三氯甲烷萃取3-4次，合并下相，并用無水Na2SO4脫水干燥，放入烘箱中60℃烘干冷卻后稱重，以不加菌株的處理為空白對照，計算降解率，每組試驗3個平行，取平均值。

降解率 =［（m0-m1）÷m0］×100%

m0：對照組的殘油重量（g）；m1：降解后樣品的殘油重量（g）。

1.2.7 高效菌群的構(gòu)建 采用九因素三水平的方式通過正交實驗進行菌群構(gòu)建。將9種菌設(shè)為9種因素，每種菌設(shè)置3個接種量（0、0.5、1）作為三水平。將各個菌株分別接入NA液體培養(yǎng)基，直至OD600為1。稱取0.2 g固體原油，放入裝有80 mL GJ培養(yǎng)基的150 mL三角燒瓶，121℃高溫殺菌20 min。將各個菌體按照構(gòu)建組合和比例分別接入培養(yǎng)基中，各個構(gòu)建和組合均做3組平行。在30℃，150 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中降解7 d，測定原油降解率。選出最佳降解菌群。

2 結(jié)果

2.1 高效菌株的分離純化

對所采集的樣品經(jīng)過富集培養(yǎng)以及初篩，分離純化得到9株微生物，分別編號為SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6、SF7、SF8和 SF9， 且 發(fā) 現(xiàn) 菌 株SF1、SF2、SF7、和SF9的菌株生長較快，菌落形態(tài)較大，如圖1所示。

2.2 DCPIP篩選高效菌株

用DCPIP對上述分離的9株微生物進行顯色篩選。由圖2可知，所有菌株在經(jīng)過不同的時間后，DCPIP由藍色完全轉(zhuǎn)變?yōu)闊o色，說明這9株菌株對石油有較強的降解能力，在圖2-A中，菌株SF3、SF7、SF8在24 h后由藍色變?yōu)闊o色，在圖2-B中菌株SF1、SF2、SF9在48 h后由藍色變?yōu)闊o色，而圖2-C中而菌株SF4、SF5、SF6在72 h后藍色變?yōu)闊o色，在未添加微生物的離心管，DCPIP未變色。Varjani Sunita等用該方法從石油污染的土壤和水中分離出6株石油降解菌株，最短120 h內(nèi)可使DCPIP由藍色變?yōu)闊o色。這是因為石油、多環(huán)芳烴以及烷烴等碳氫化合物的降解氧化情況可用氧化還原指示劑DCPIP 進行評估，其主要功能在于可靈敏地反應(yīng)碳氫化合物初步氧化過程。通常 DCPIP 在氧化態(tài)時呈深藍色，將其添加至微生物降解石油的培養(yǎng)基中，其作為電子受體接受碳氫化合物氧化時所產(chǎn)生的電子從而變?yōu)闊o色。

圖1 原油降解菌株的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of crude oil-degrading strains

圖2 DCPIP定性篩選原油降解菌株Fig.2 Qualitative screening of crude oil-degrading strains by DCPIP

2.3 高效菌株的序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

對分離篩選得到的9株微生物進行DNA的提取，并進行PCR擴增且測序，序列經(jīng)NCBI中的blast比對分析，篩選菌株與相似菌株的同源性都高達95%以上，鑒定 SF1為中間蒼白桿菌（Ochrobactrum intermedium），SF2 為腸桿菌（Enterobacter sp.），SF3為不動桿菌（Acinetobacter sp.），SF4為熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens），SF5為施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri），SF6假單胞菌（Pseudomonas sp.），SF7為 醋 酸 鈣 不 動 桿 菌（Acinetobacter calcoaceticuspartial sequence），SF8為 霍 氏 腸 桿 菌（Enterobacter hormaecheipartial sequence），SF9 為松嫩平原假單胞菌（Pseudomonas songnenensis）。并將這些菌株基于16S rRNA序列的進化樹分析。由圖3所示，系統(tǒng)發(fā)育樹自展值均大于85%，證明該系統(tǒng)發(fā)育樹可信度高。

2.4 原油降解試驗及降解率的測定

將9株微生物的發(fā)酵液，按10%的接種量接入以石油為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中，進行搖瓶降解試驗，7 d后，結(jié)果如圖4所示：與對照相比，添加微生物的油膜消失，并將原油分解成小油滴，且原油的貼壁力有不同程度的下降，說明此微生物能利用原油為碳源作為營養(yǎng)物質(zhì)，將大分子原油降解成小分子，或分解成二氧化碳和水。從圖5可知，菌株中間蒼白桿菌（Ochrobactrum intermedium）SF1降解能力最強，降解率達48.73%，菌株腸桿菌（Enterobacter sp.）SF2、醋酸鈣不動桿菌SF7（Acinetobacter calcoaceticus）、松嫩平原假單胞菌SF9（Pseudomonas songnenensis）的降解能力略低于菌株SF1，降解率分別為41.90%、45.35%、32.25%，其他菌株的降解率也高于20%。

2.5 高效菌群的構(gòu)建

由正交實驗設(shè)計，得到了27種菌群組合。通過不同混合菌群對原油的降解試驗效果可以得出，有的混合菌群的降解效果優(yōu)于單個菌株的降解效果。這可能是因為菌株之間存在一定的協(xié)同作用，促進降解石油烴相關(guān)酶的活性，而也有混合菌群的降解能力低于單個菌株的降解效果，這可能是菌株之間的競爭抑制作用造成的。由表1可以得到菌株間的最佳組合形式以及菌株之間的添加比例，從實驗結(jié)果可以看出組合9的降解效果最好，對原油的降解率高達57.88%，最低的降解效率是組合18也就是空白實驗，原油降解效率為2.50%。組合9是為最佳高效菌群，由菌株SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6、SF7和SF9且添加量為2∶1∶1∶1∶1∶1∶2∶2 組成。

圖3 原油降解菌株16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequence of crude oil-degrading strain

圖4 搖瓶發(fā)酵降解原油試驗Fig.4 Crude oil degradation experiment by shaking flask fermentation

3 討論

圖5 不同菌株對原油的降解率Fig.5 Degradation rate of crude oil by different strains

目前，國內(nèi)外研究學(xué)者已獲得原油降解菌株有100多個屬，200個種［21］。本研究獲得的不動桿菌屬、假單胞菌屬和腸桿菌屬是常見的原油降解菌株［22］，并且大量研究表明不動桿菌屬和假單胞菌屬、腸桿菌屬對輕質(zhì)原油具有很好的降解效果［23-25］。不動桿菌屬細菌對石油烴中烷烴的降解效果最好，降解烷烴一般通過脂肪酸 β氧化［26］；而假單胞菌屬細菌則對芳香烴的降解效率較高［27］，國內(nèi)外對腸桿菌屬在降解原油機理方面的報道相對較少。藍慧等［28］分離的腸桿菌屬在pH 8.91、NaCl 濃度為1.19%、溫度為36.78℃以200 r/min的條件下對含油量為1%的培養(yǎng)基振蕩處理7 d后，對原油的降解率34.60%，而本文篩選的腸桿菌屬對原油的降解率高達41.90%，優(yōu)于藍慧等分離的腸桿菌屬，可能是由于pH和含氧量的不同直接影響到了微生物的生長，從而間接的影響到石油烴的降解；溫度的改變可以使石油污染物的黏度和溶解性發(fā)生變化，也能影響到微生物的生長狀況和其體內(nèi)的酶活性，從而影響石油的整個降解過程。周婷等［29］分離的不動桿菌屬在30℃、150 r/min的條件下對4 g/L的原油培養(yǎng)基培養(yǎng)15 d后，該菌株對原油的降解率達42.15%，與本研究篩選的不動桿菌屬相比，本研究篩選的不動桿菌更有利于原油的降解，因為本研究在30℃、150 r/min的條件下，處理7 d后，對原油的降解率高達45.35%，因此本研究篩選的不動桿菌更有利于原油的降解。中間蒼白桿菌屬對原油的降解報道不是很常見，尤其對相對密度大的原油降解報道罕見。高鵬飛等［30］從煉油廢水中篩選出的一株高效降解石油烴菌株蒼白桿菌（Ochrobactrum ciceri），該菌株對含柴油濃度為4 000 mg/L的無機鹽培養(yǎng)基在120 r/min、30℃下振蕩處理6 d后，結(jié)果顯示，石油烴降解率高達98.98%。本實驗分離的蒼白桿菌屬SF1在2.5 g/L的原油培養(yǎng)基中7 d后，對原油的降解率為48.37%。從降解率看高鵬飛等篩選的蒼白桿菌屬對原油的降解效果優(yōu)于本實驗篩選得到的蒼白桿菌屬，但柴油屬于輕質(zhì)原油，黏度比稠油小，更易于微生物的降解。

表1 高效菌群對原油的降解率Table 1 Degradation rate of high-efficiency bacteria on crude oil

自然環(huán)境中的微生物多種多樣，石油的降解是一個極為復(fù)雜的過程，單個菌株很難實現(xiàn)原油組分的全部降解，構(gòu)建高效菌群可以結(jié)合各單個菌株的降解能力而形成一個較完整的降解體系，發(fā)揮菌株間的協(xié)同作用，實現(xiàn)對原油的高效降解［31-32］。本研究通過正交實驗設(shè)計得到最佳高效菌群的構(gòu)建，結(jié)果 表 明， 菌 株 SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6、SF7和SF9且添加量為2∶1∶1∶1∶1∶1∶2∶2組成的菌群對原油的降解效果優(yōu)于單個菌株，降解率達57.88%。而王海峰等［33］將分離得到的16株稠油降解菌株（紅球菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬等）進行等比列混合，對含油量1 000 mg/L的培養(yǎng)基處理7 d，結(jié)果顯示，該混合菌群對稠油的降解率為68%，該菌群對原油的降解效果優(yōu)于本研究構(gòu)建的高效菌群。可能是因為菌株的種類、比列及含油量的不同導(dǎo)致的，若含油量過高，使C∶N∶P值失衡，造成營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，影響菌株的生長，進而影響對原油的降解；也有可能原油濃度過大時，阻隔了菌體與氧氣的接觸，導(dǎo)致菌體不能良好的生長，從而使降解率下降。

4 結(jié)論

本研究從原油污泥、實驗室自有菌株以及原油污染的土壤中分離篩選出9株微生物，分別為SF1中間蒼白桿菌屬（Ochrobactrum intermedium），SF2、SF8屬于腸桿菌屬（Enterobacter sp.），SF3、SF7為不動桿菌屬（Acinetobacter sp.），SF4、SF5、SF6、SF9屬于假單胞菌菌屬（Pseudomonas sp.）。通過對2.5 g/L的原油進行搖瓶實驗發(fā)現(xiàn)，蒼白桿菌 屬（Ochrobactrum intermedium）SF1降 解 能 力最強，降解率達48.73%，腸桿菌屬（Enterobacter sp.）SF2、 醋 酸 鈣 不 動 桿 菌 SF7（Acinetobacter calcoaceticus）、松嫩平原假單胞菌SF9（Pseudomonas songnenensis）的降解能力略低于菌株SF1，降解率分別為41.90%、45.35%和32.25%，其他菌株的降解率也高于20%。根據(jù)正交實驗設(shè)計得出，菌株SF1、SF2、SF3、SF4、SF5、SF6、SF7和 SF9且 添加量為2∶1∶1∶1∶1∶1∶2∶2組成的高效菌群的降解效果優(yōu)于單個菌株的降解效果，降解效果高達57.88%。