石灰對(duì)靈芝覆土連作障礙的防控作用及其微生物群落分析

袁源 黃海辰 李琳 劉國(guó)輝 傅俊生 吳小平

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心，福州 350002；3. 仙芝科技（福建）股份有限公司，福州 353400）

靈芝（Ganoderma lingzhi）又名靈芝草，是一種珍貴的食藥用菌，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，素有“仙草”的美譽(yù)［1-2］。其子實(shí)體富含靈芝多糖、麥角甾醇和靈芝酸等有效成分，具有良好的保肝、抗腫瘤、降血糖以及免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)功效，在醫(yī)療保健市場(chǎng)深受廣大消費(fèi)者的認(rèn)可［3］。然而，野生靈芝資源十分有限，難以滿足市場(chǎng)日益增長(zhǎng)的供應(yīng)需求，人工栽培靈芝就顯得尤為重要。迄今為止，靈芝在國(guó)內(nèi)的人工栽培歷史已有60余年，主要的栽培方式包括袋料栽培和段木栽培［4］。其中，靈芝段木覆土栽培是一種常見的段木栽培模式，覆土能有效的維持靈芝菌棒的溫度和濕度，并且子實(shí)體肥大，營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)較佳［5］。然而，該模式下靈芝連續(xù)栽培2-3年后容易發(fā)生連作障礙現(xiàn)象，呈現(xiàn)出子實(shí)體畸形、病蟲害多和產(chǎn)量急劇下降等問題，不利于靈芝產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展［6］。研究表明，靈芝連作障礙與覆土中微生物群落及其數(shù)量的變化具有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性［2，5，7］。在靈芝連作期間，覆土理化性質(zhì)改變、土壤反應(yīng)異常以及靈芝自毒作用等均會(huì)引起覆土中微生物群落發(fā)生變化，往往表現(xiàn)為覆土中病原真菌逐年增加，而部分有益菌逐漸減少，進(jìn)而導(dǎo)致大面積的靈芝基地不得不停用［7］。前期實(shí)驗(yàn)室對(duì)靈芝連作覆土中的真菌群落進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)青霉屬真菌的相對(duì)豐度在連作4年的靈芝覆土中比鄰近沙壤土約增加了57.92%［8］。因此，如何對(duì)靈芝連作覆土進(jìn)行科學(xué)有效的治理就顯得尤為重要。

石灰消毒法是一種常見的土壤消毒方法，在改善土壤的酸堿度、重金屬沉積以及微生物的組成結(jié)構(gòu)等方面發(fā)揮著重要的作用［9-11］。其中，唐明等［12］發(fā)現(xiàn)石灰能顯著降低煙草酸性土壤中真菌數(shù)量，增加土壤中細(xì)菌和放線菌的數(shù)量，從而有效促進(jìn)植株的生長(zhǎng)。類似地，Shen等［13］采用Illumina測(cè)序發(fā)現(xiàn)石灰能有效增加煙草根際土壤細(xì)菌群落的豐富度和多樣性，其可能通過抑制糖化菌、氣微菌屬和假黃單胞菌屬等微生物來緩解煙草的連作障礙問題。王一鳴等［14］發(fā)現(xiàn)石灰聯(lián)合碳銨處理香蕉連作土壤顯著降低土壤中變形菌門和子囊菌門相對(duì)豐度，且顯著提高放線菌門相對(duì)豐度，能有效改善香蕉的連作障礙現(xiàn)象。同時(shí)，ITS1和16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)分別是研究土壤真菌和細(xì)菌群落多樣性的基本手段之一，常用于反映不同樣本中微生物群落的組成結(jié)構(gòu)和種間差異，具有高通量、準(zhǔn)確靈敏以及高效快捷等特點(diǎn)［15］。故而本研究將石灰應(yīng)用于探索靈芝連作障礙，加之?dāng)U增子測(cè)序技術(shù)，將靈芝的產(chǎn)量和覆土中微生物群落的變化有機(jī)聯(lián)系起來，旨在為靈芝連作障礙的生物防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)菌株為赤芝119（滬農(nóng)靈芝1號(hào)），由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所認(rèn)定。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)基地位于仙芝科技（福建）股份有限公司有機(jī)靈芝博覽園（福建省南平市浦城縣，28°01-N，118°32-E），土壤類型為沙壤土，pH呈弱酸性（5-6）。試驗(yàn)于2019年2月27日實(shí)施石灰治理連作4年覆土試驗(yàn)，設(shè)定4個(gè)分組，分別記為CK、LI45、LI90和LS90組，詳見表1。每個(gè)分組150 m2大棚分別栽培100棒靈芝，將同一批生長(zhǎng)狀態(tài)良好的靈芝脫袋處理后，待菌絲長(zhǎng)滿段木埋入不同處理的連作4年覆土中，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行出芝管理。在此期間，大棚內(nèi)的光照、溫度和濕度等均保持一致。

1.2.2 土壤采集 靈芝連作覆土于2019年10月9日取自有機(jī)靈芝博覽園。采用S形取樣法，按照半徑15-20 cm、深度0-5 cm的范圍對(duì)其進(jìn)行取樣，每個(gè)分組取5個(gè)點(diǎn)的混合土樣。每個(gè)分組土樣大約重100 g，采集后立即將土樣標(biāo)記并置于冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，于-20℃低溫保存待測(cè)。

表1 不同石灰處理方式Table 1 Different lime treatment methods

1.2.3 土壤總DNA的提取 參照土壤DNA提取試劑盒說明書，對(duì)覆土樣品的進(jìn)行DNA提取，采用核酸微量測(cè)定儀和2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)所獲得的總DNA進(jìn)行定量和質(zhì)檢［16］。

1.2.4 PCR擴(kuò)增及測(cè)序 真菌采用的引物ITS-1FI2 GAACCWGCGGARGGATCA和ITS2 GCTGCGTTCTTCATCGATGC對(duì)ITS1區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增［17］。相應(yīng)的，細(xì)菌以16S rDNA可變區(qū)（V3+V4）為目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′） 和 806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）［18］。PCR 擴(kuò)增體 系為 ：12.5 μL 2×Master Mix、2.5 μL 正向引物、2.5 μL 反向引物、50 ng DNA模板、25 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件為：98℃ 30 s；98℃ 10 s、54℃ 30 s、72℃ 45 s（35 個(gè)循環(huán)）；72℃ 10 min、4℃保存。擴(kuò)增完成后，對(duì)PCR產(chǎn)物通過進(jìn)行回收和純化。采用Picogreen dsDNA Assay Kit 雙鏈DNA定量檢測(cè)試劑盒在Qbit熒光定量系統(tǒng)上對(duì)上述純化后的PCR產(chǎn)物文庫(kù)進(jìn)行定量。將濃度＞2 nmol/L的文庫(kù)進(jìn)行梯度稀釋、混合和變性處理。在MiSeq測(cè)序儀上，將變性獲得的單鏈?zhǔn)褂肕iSeq Reagent Kit試劑盒進(jìn)行長(zhǎng)度為2×300 bp的雙端測(cè)序。

1.2.5 生物信息學(xué)分析流程 樣品由杭州聯(lián)川生物技術(shù)股份有限公司（LC-Bio）在Illumina NovaSeq平臺(tái)上按照制造商的建議進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)雙端序列的重疊區(qū)，采用Pear將R1和R2序列拼接成長(zhǎng)的tag序列，并使用cutadapter去除barcode以及引物序列。然后采用Fqtrim（v0.94）過濾低質(zhì)量序列，采用Vsearch（v2.3.4）軟件過濾嵌合體。使用QIIME2軟件的DADA（2Divisive Amplicon Denoising Algorithm 2）進(jìn)行降噪后，得到特征表和特征序列feature。Alpha多樣性和Beta多樣性通過抽平（將所有樣本的序列數(shù)抽取至最少序列樣本的序列數(shù)）的方式來進(jìn)行歸一化，物種注釋使用相對(duì)豐度來進(jìn)行歸一化處理（X菌群count/總count）。Alpha多樣性以及Beta多樣性均由QIIME2進(jìn)行流程分析，圖片由R（v3.5.2）包繪制。物種注釋采用QIIME2的插件feature-classifier進(jìn)行序列比對(duì)，真菌比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)為SILVA和unite數(shù)據(jù)庫(kù)，細(xì)菌為SILVA和NT-16S數(shù)據(jù)庫(kù)。其他的圖是使用R包實(shí)現(xiàn)的（v3.5.2）。

1.2.6 指標(biāo)測(cè)定方法 在靈芝出芝期，同時(shí)對(duì)各分組靈芝的生長(zhǎng)狀態(tài)和出芝率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。在靈芝成熟期，相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)靈芝的生長(zhǎng)狀態(tài)和病害發(fā)生情況，具體測(cè)定方式如下：

出芝率=（出芝袋數(shù)/菌袋總數(shù)）×100%

病害率=（存在病害的子實(shí)體袋數(shù)/菌袋總數(shù)）×100%

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 基于feature豐度表，Alpha多樣性采用SPSS17.0軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01差異極顯著。其中，Observed_species指數(shù)常用來反映樣本的物種豐富度，Simpson指數(shù)體現(xiàn)樣本中不同物種的多樣性。Beta多樣性采用R軟件vegan包進(jìn)行PCA（principal component analysis）分析，通過PCA圖可直觀反映組內(nèi)生物學(xué)重復(fù)的相似性及組間差異性，樣本的物種組成越相似，則在PCA圖中的距離越近。LEfSe差異分析首先采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)檢測(cè)所有的特征物種，通過檢測(cè)不同組間的物種豐度差異，獲得顯著性差異物種。其次，利用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)檢測(cè)獲得的顯著性差異物種的所有亞種是否都趨同于同一分類水平。最后，使用線性判別分析（LDA），得到最終的差異物種biomarker。網(wǎng)絡(luò)互作圖和Sparcc熱圖采用SPSS17.0軟件對(duì)相對(duì)豐度top20的微生物菌群進(jìn)行相關(guān)性性和顯著性分析，并使用相關(guān)性繪制出網(wǎng)絡(luò)圖以及熱圖。

2 結(jié)果

2.1 石灰處理對(duì)出芝生長(zhǎng)的影響

為了探究不同石灰處理方式對(duì)靈芝出芝和生長(zhǎng)的影響，分別對(duì)4組靈芝的出芝率和長(zhǎng)勢(shì)進(jìn)行比較。如圖1-A和1-B所示，相比對(duì)照組而言，LI90組靈芝長(zhǎng)勢(shì)明顯較好且出芝率顯著性提高，高達(dá)76.00%，相比對(duì)照組大約提高了68.89%，而LI45組和LS90組靈芝出芝率有所提高，但不具備顯著差異性，表明LI90組石灰浸泡處理靈芝連作覆土對(duì)靈芝出芝率具有顯著的促進(jìn)作用。

圖1 靈芝初期生長(zhǎng)情況分析Fig.1 Analysis of initial growth of G. lingzhi

2.2 石灰處理對(duì)靈芝產(chǎn)量的影響

相應(yīng)的，通過比較靈芝子實(shí)體干品質(zhì)量和生長(zhǎng)情況以探究不同石灰處理方式對(duì)靈芝產(chǎn)量的影響。如圖2-A和2-B所示，不同石灰處理方式下靈芝產(chǎn)量與出芝率變化趨勢(shì)一致。LI90組靈芝產(chǎn)量比對(duì)照組提高了135.87%，具有極顯著的差異性，且靈芝生長(zhǎng)狀況較好，而LI45組和LS90組靈芝產(chǎn)量無顯著性提高。其中，LI45組產(chǎn)量略高于LS90組，且靈芝長(zhǎng)勢(shì)較LS90組好。表明LI90組石灰浸泡靈芝覆土能有效提高靈芝的產(chǎn)量，且作用效果最佳。

圖2 靈芝后期生長(zhǎng)情況分析Fig.2 Analysis of later growth of G. lingzhi

2.3 石灰處理對(duì)靈芝病害的影響

如圖3所示，通過比較不同分組靈芝的病害發(fā)生情況，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組靈芝病害率最高，達(dá)到51.51%。LI45、LI90和LS90組靈芝病害率與對(duì)照組相比均有所下降，分別為26.26%、23.23%和34.34%。其中，LI90組靈芝病害率比對(duì)照組大約降低了54.90%，具有顯著性差異。綜上，石灰浸泡處理整體上比石灰勻撒處理靈芝連作覆土對(duì)靈芝連作障礙的改善效果更好，并且LI90組石灰浸泡處理靈芝連作覆土在改善靈芝出芝率、產(chǎn)量、病害率和長(zhǎng)勢(shì)方面作用效果顯著。因此，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)石灰浸泡處理的靈芝覆土微生物群落進(jìn)行分析，以期為石灰浸泡處理連作覆土在防控靈芝連作障礙方面奠定基礎(chǔ)。

圖3 靈芝病害率統(tǒng)計(jì)與分析Fig.3 Statistics and analysis of G. lingzhi disease rate

2.4 覆土中真菌多樣性分析

為了深入探究石灰浸泡處理對(duì)連作覆土中真菌群落的影響，采用ITS1測(cè)序?qū)K、LI45和LI90組覆土真菌群落進(jìn)行測(cè)序。如圖4-A所示的feature分布維恩圖，3個(gè)分組一共獲得310個(gè)feature。其中，3個(gè)分組中共有的feature為76個(gè)，特有的feature依次為59、45和80。發(fā)現(xiàn)LI45組特有的feature數(shù)目最少，LI90組特有的feature數(shù)目最多，表明LI45組特有真菌較少，LI90組特有真菌較多。如圖4-B所示，通過對(duì)覆土中真菌群落進(jìn)行PCA分析，發(fā)現(xiàn)CK組和LI45組樣品距離較近，而與LI90組距離相對(duì)較遠(yuǎn)，表明對(duì)照組與LI45組覆土中真菌群落組成較為相似，而與LI90組間差異較大。如圖4-C所示，覆土中真菌群落的Observed_species指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)LI90組真菌物種的豐富度相比對(duì)照組顯著提高，LI45組無明顯變化。如圖4-D所示，覆土中真菌群落的Simpson指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)LI90組真菌物種多樣性顯著降低，表明LI90組與對(duì)照組中真菌物種的豐富度和多樣性差異較大。

圖4 真菌feature分布維恩圖與α和β多樣性分析Fig.4 Venn diagram of fungal feature distribution and analysis of α and β diversity of fungi

2.5 真菌組成結(jié)構(gòu)分析

從CK、LI45和LI90組9個(gè)樣品中一共獲得48種真菌，分別隸屬于3門、11綱、27目、35科和42屬。其相對(duì)豐度位列前20的真菌屬如圖5-A所示。其中，擔(dān)子菌門Basidiomycota_unclassified和子囊菌門Ascomycota_unclassified是覆土中的優(yōu)勢(shì)菌屬，在3個(gè)分組中平均約占真菌總序列的99.24%。如圖5-B所示，相對(duì)對(duì)照組組而言，擔(dān)子菌門Basidiomycota_unclassified相對(duì)豐度在LI45和LI90組中明顯增加，子囊菌門Ascomycota_unclassified相對(duì)豐度明顯降低，并且二者在LI45組中變化更為顯著。另外，Agaricomycetes_unclassified的相對(duì)豐度在LI45和LI90組明顯提高，并且其相對(duì)豐度的增加呈濃度依賴性，而Wallemia節(jié)擔(dān)菌屬、Trichosporon絲孢酵母屬、Hyphodontia中國(guó)產(chǎn)絲齒菌屬等擔(dān)子菌門真菌屬的相對(duì)豐度反而下降。Microascaceae_unclassified、Mycosphaerella球腔菌屬、Glomerella小叢殼屬、Eurotium散囊菌屬、Devriesia德福里斯孢屬、Gibellulopsis的相對(duì)豐度在LI45組和LI90組中較對(duì)照組降低，并且球腔菌屬和小叢殼屬相對(duì)豐度的降低呈劑量依賴性。子囊菌門Aspergillus曲霉屬相對(duì)豐度在LI45組較對(duì)照組明顯提高，在LI90組略有下降。表明石灰浸泡處理靈芝連作覆土能改變覆土中真菌物種組成結(jié)構(gòu)，主要表現(xiàn)為子囊菌門相對(duì)豐度的降低和擔(dān)子菌門相對(duì)豐度的增加。

圖5 屬水平真菌群落的相對(duì)豐富度Fig.5 Relative abundance of fungal communities at genus level

2.6 真菌多水平LEfSe物種差異分析

覆土中真菌LEfSe物種差異分析發(fā)現(xiàn)（圖6），CK和LI45組土壤樣品中一共有23個(gè)分類水平的真菌物種存在顯著的差異。CK組中子囊菌未知綱g__Ascomycota_unclassified、子囊菌未知目f__Ascomycota_unclassified、子囊菌未知科o__Ascomycota_unclassified、子囊菌未知屬c__Ascomycota_unclassified、子囊菌p__Ascomycota；LI45組中傘菌綱c__Agaricomycetes、傘菌未知目g__Agaricomycetes_unclassified、傘菌未知科f__Agaricomycetes_unclassified、傘菌未知屬o__Agaricomycetes_unclassified、擔(dān)子菌未知綱g__Basidiomycota_unclassified、擔(dān)子菌未知目f__Basidiomycota_unclassified、擔(dān)子菌未知科o__Basidiomycota_unclassified、擔(dān)子菌未知屬c__Basidiomycota_unclassified、擔(dān)子菌p__Basidiomycota、真菌未知綱g__Fungi_unclassified、真菌未知目f__Fungi_unclassified、真菌未知科o__Fungi_unclassified、真菌未知屬c__Fungi_unclassified和p__Fungi_unclassified等是靈芝連作4年覆土與22.5 kg石灰處理覆土真菌群落差異的主要類群。同時(shí)，CK與LI90組土壤樣品真菌物種無顯著性差異。

2.7 真菌相關(guān)性分析

在CK、LI45和LI90組中，屬水平上真菌物種網(wǎng)絡(luò)互作圖如7-A所示。子囊菌門未知屬Ascomycota_unclassified與擔(dān)子菌門未知屬Basidiomycota_unclassified以及中國(guó)產(chǎn)絲齒菌屬Hyphodontia與德福里斯孢屬Delvriesia之間均呈顯著的負(fù)相關(guān)。同時(shí)，如相關(guān)性熱圖7-B所示，藍(lán)色表示正相關(guān)，紅色表示負(fù)相關(guān)。子囊菌門未知屬與擔(dān)子菌門未知屬間具有較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)，表明靈芝連作覆土中子囊菌門未知屬越多，擔(dān)子菌門未知屬的相對(duì)豐度就越低。

2.8 覆土中細(xì)菌多樣性分析

采用16S rDNA測(cè)序?qū)K、LI45和LI90組覆土細(xì)菌群落進(jìn)行測(cè)序，以分析石灰浸泡處理對(duì)連作覆土中細(xì)菌群落的影響。如圖8-A所示，3個(gè)分組一共獲得532個(gè)feature。其中，3個(gè)分組中共有的feature為160個(gè)，特有的feature為97、82和101。發(fā)現(xiàn)LI45組特有的feature數(shù)目最少，LI90組特有的feature數(shù)目最多，表明LI45組中特有的細(xì)菌較少，而LI90組中較多。類似的，如圖8-B所示的PCA分析圖，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組與LI45組細(xì)菌物種組成較為相似，而與LI90組差異較大。此外，如圖8-C所示，對(duì)Observed_species指數(shù)分析表明覆土中細(xì)菌物種豐富度在3個(gè)分組之間無顯著變化，Simpson指數(shù)發(fā)現(xiàn)3個(gè)分組的細(xì)菌物種多樣性無顯著差異性，表明石灰浸泡處理對(duì)連作覆土中細(xì)菌物種豐富度和多樣性無顯著影響。

2.9 細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)分析

從9個(gè)樣品中一共獲得216種細(xì)菌，分別隸屬于6門、11綱、31目、51科和101屬。如圖9-A所示，變形菌門是覆土中的優(yōu)勢(shì)菌門，約占細(xì)菌總序列的96.70%，并且相對(duì)豐度前20的細(xì)菌屬均隸屬于變形菌門。如圖9-B所示，LI45和LI90組Azospirillum固氮螺菌屬、Zoogloea動(dòng)膠菌屬、Methylobacillus甲基菌屬、Methylophilus嗜甲基菌屬、Cupriavidus貪銅菌屬、Diaphorobacter、Acidovorax嗜酸菌屬、Burkholderiaceae_unclassified的相對(duì)豐度均有所提高。其中，LI45和LI90組較對(duì)照組，動(dòng)膠菌屬、甲基菌屬和嗜甲基菌屬的相對(duì)豐度極顯著提高。并且甲基菌屬、嗜甲基菌屬、貪銅菌屬、Diaphorobacter、嗜酸菌屬、Burkholderiaceae_unclassified相對(duì)豐度的提高呈劑量依賴性。同時(shí)，Rhodobacter紅細(xì)菌屬、Acinetobacter不動(dòng)桿菌屬、Pseudomonas假單胞菌屬、Flavobacterium黃桿菌屬、Shinella申氏桿菌屬、Comamonas叢毛單胞菌屬、Sphingomonas鞘氨醇單胞菌屬和Sphingobium鞘脂菌屬相對(duì)豐度在LI45和LI90組有所下降。其中，鞘氨醇單胞菌屬和鞘脂菌屬在LI45和LI90組極顯著下降。并且鞘氨醇單胞菌屬、鞘脂菌屬、紅細(xì)菌屬、假單胞菌屬、黃桿菌屬、申氏桿菌屬的相對(duì)豐度的下降呈劑量依賴性。此外，在LI90組中Alicycliphilus相對(duì)豐度較對(duì)照組明顯提高，而在LI45組中反而下降。表明石灰浸泡處理不僅有效降低靈芝連作覆土中子囊菌門真菌屬的相對(duì)豐度，同時(shí)顯著提高了連作覆土中多種變形菌門細(xì)菌群落的相對(duì)豐度。

圖6 覆土中真菌LEfSe物種差異分析Fig.6 Analysis of the difference of the fungal LEfSe species in the covering soil

2.10 細(xì)菌多水平LEfSe多級(jí)物種差異分析

圖7 覆土中真菌相關(guān)性分析Fig.7 Correlation analysis of fungi in the covering soil

覆土中細(xì)菌LEfSe物種差異分析發(fā)現(xiàn)（圖10），CK、LI45和LI90組土壤樣品中一共有22個(gè)分類水平的細(xì)菌存在顯著的物種差異。其中，CK組中鞘脂菌屬g__Sphingobium、鞘氨醇單胞菌科f__Sphingomonadaceae、鞘氨醇單胞菌目o__Sphingomonadales、叢毛單胞菌屬g__Comamonas等；LI45組中動(dòng)膠菌屬g__Zoogloea和紅環(huán)菌科f__Rhodocyclaceae等 ；LI90組 中 g__Pseudopedobacter、嗜酸菌屬g__Acidovorax、伯克氏菌目o__Burkholderiales、β-變形菌綱c__Betaproteobacteria等是靈芝連作4年覆土、22.5 kg石灰處理覆土和45 kg石灰處理覆土細(xì)菌群落差異的主要類群。

圖8 細(xì)菌feature分布維恩圖與α和β多樣性分析Fig.8 Venn diagram of bacterial feature distribution and analysis of α and β diversity of bacteria

2.11 細(xì)菌相關(guān)性分析

如圖11-A所示，由屬水平上細(xì)菌物種網(wǎng)絡(luò)互作圖可發(fā)現(xiàn)，在CK、LI45和LI90組中甲基菌屬和貪銅菌屬、貪銅菌屬和嗜酸菌屬、不動(dòng)桿菌屬和甲基菌屬、鞘脂菌屬和叢毛單胞菌屬、鞘脂菌屬和假單胞菌屬、假單胞菌屬和黃桿菌屬之間呈顯著的正相關(guān)；鞘脂菌屬和動(dòng)膠菌屬、鞘脂菌屬和貪銅菌屬、貪銅菌屬和叢毛單胞菌屬、Pandoraea和Aquamicrobium、假單胞菌屬和貪銅菌屬、固氮螺菌屬和Comamonadaceae_unclassified之間呈顯著的負(fù)相關(guān)。同時(shí)，貪銅菌屬、鞘脂菌屬、假單胞菌屬菌群的豐富度較其他優(yōu)勢(shì)菌群高。如11-B所示，Pandoraea和Aquamicrobium、鞘脂菌屬和貪銅菌屬之間負(fù)相關(guān)性較強(qiáng)。不動(dòng)桿菌屬和甲基菌屬、甲基菌屬和貪銅菌屬、貪銅菌屬和嗜酸菌屬、假單胞菌屬和黃桿菌屬、鞘脂菌屬和假單胞菌屬之間正相關(guān)性較強(qiáng)。其中，不動(dòng)桿菌屬和甲基菌屬、甲基菌屬和貪銅菌屬、貪銅菌屬和嗜酸菌屬相對(duì)豐度顯著增加，假單胞菌屬和黃桿菌屬、鞘脂菌屬和假單胞菌屬相對(duì)豐度顯著下降。

3 討論

圖9 屬水平細(xì)菌群落的相對(duì)豐富度Fig.9 Relative abundance of bacterial communities at genus level

近年來，靈芝在健康產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域展現(xiàn)出得天獨(dú)厚的藥用優(yōu)勢(shì)，深受大眾的喜愛，但是嚴(yán)峻的連作障礙問題長(zhǎng)期影響著段木覆土栽培靈芝的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。為了緩解靈芝連作障礙問題，目前生產(chǎn)上主要采用輪作對(duì)靈芝覆土進(jìn)行修復(fù)。如祝寧等［19］采用大棚草莓基質(zhì)育苗和靈芝栽培進(jìn)行輪作，能有效減少土壤病害的發(fā)生。然而，靈芝栽培與其他作物輪作周期較長(zhǎng)，導(dǎo)致大量靈芝基地?zé)o法正常使用，不利于靈芝產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展。因而，眾多學(xué)者致力于靈芝連作障礙的生物防控研究。如馬紅梅等［20］提出采用生物防治和和林間仿野生栽培等防治措施。吳曉明等［5］采用高溫液氨熏蒸對(duì)靈芝連作覆土消毒，該方法能有效提高靈芝的生長(zhǎng)速度和產(chǎn)量，并消滅覆土中雜草和綠色木霉等真菌。研究發(fā)現(xiàn)靈芝的甲醇提取物在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)黑曲霉、黃曲霉和青霉菌等病原真菌也有良好的抑菌活性［21］。文冬華等［22］使用1%生石灰水預(yù)防木霉等病害，經(jīng)過觀察和統(tǒng)計(jì)作用效果明顯。相應(yīng)地，本研究采用石灰消毒法對(duì)靈芝連作覆土進(jìn)行處理，其成本低、周期短、效果顯著并且操作簡(jiǎn)單，有助于緩解靈芝連作障礙引發(fā)的農(nóng)業(yè)問題。

圖10 覆土中細(xì)菌LEfSe物種差異分析Fig.10 Analysis of the difference of the bacterial LEfSe species in the covering soil

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，石灰浸泡處理組靈芝長(zhǎng)勢(shì)較好，不僅提高了靈芝出芝率和子實(shí)體干品產(chǎn)量，而且顯著降低靈芝病害率，有效改善了靈芝連作障礙現(xiàn)象。其中，LI90組作用效果更為顯著。微生物在連作覆土中呈現(xiàn)出現(xiàn)由“細(xì)菌型”轉(zhuǎn)向“真菌型”的趨勢(shì)，即細(xì)菌數(shù)量大幅減少，真菌數(shù)量急劇增加［7］。靈芝覆土中真菌測(cè)序結(jié)果表明，子囊菌門相對(duì)豐度在LI45和LI90組中明顯降低，擔(dān)子菌門相對(duì)豐度明顯增加，并且子囊菌門未知屬和擔(dān)子菌門未知屬的相對(duì)豐度呈負(fù)相關(guān)。馬紅梅等［7］基于靈芝覆土中優(yōu)勢(shì)菌群對(duì)靈芝菌絲體的化感效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)曲霉屬、木霉屬、青霉屬和鏈孢霉屬等子囊菌門真菌是靈芝連作覆土中主要的病原菌。本研究結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)子囊菌門Aspergillus曲霉屬相對(duì)豐度在LI90組略有下降，在LI45組較對(duì)照組明顯提高，推測(cè)LI90組石灰浸泡處理能有效降低覆土中子囊菌門曲霉屬等病原真菌，從而有效降低靈芝的病害率。細(xì)菌作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在促進(jìn)土壤物質(zhì)循環(huán)利用和生物修復(fù)方面發(fā)揮著重要的作用［23］。覆土中細(xì)菌相關(guān)性分析結(jié)果表明，在CK、LI45和LI90組覆土中，貪銅菌屬、鞘脂菌屬和假單胞菌屬菌群的豐富度高于其他具有物種差異的菌群。其中，貪銅菌屬的相對(duì)豐度呈劑量依賴性提高，鞘脂菌屬和假單胞菌屬的相對(duì)豐度呈劑量依賴性降低。并且貪銅菌屬和甲基菌屬、嗜酸菌屬的相對(duì)豐度呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)貪銅菌屬和嗜酸菌屬可以降解環(huán)境中芳香類和酚類等多種有機(jī)物，對(duì)環(huán)境修復(fù)具有重要意義，這些細(xì)菌類群在連作障礙方面的生態(tài)作用有待進(jìn)一步研究［24-26］。因此，以上數(shù)據(jù)表明LI90組顯著提高靈芝的出芝率、產(chǎn)量，降低靈芝的病害率可能與靈芝覆土中子囊菌門曲霉屬等病原真菌相對(duì)豐度的減少，以及變形菌門貪銅菌屬和嗜酸菌屬等多種有益細(xì)菌的相對(duì)豐度的增加有關(guān)，以期為靈芝的連作障礙的防控提供依據(jù)。

圖11 覆土中細(xì)菌相關(guān)性分析Fig.11 Correlation analysis of bacteria in the covering soil

4 結(jié)論

LI90組石灰浸泡處理連作覆土能有效改善靈芝連作障礙現(xiàn)象，可作為防控靈芝連作障礙的一個(gè)有效措施，其作用機(jī)理可能與靈芝覆土中子囊菌門曲霉屬等相對(duì)豐度的下降，以及變形菌門貪銅菌屬等相對(duì)豐度的增加有關(guān)。