烏拉爾甘草CBL基因家族的鑒定與表達(dá)分析

高玲 王斐 謝雙全 陳喜鳳 沈海濤 李鴻彬

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石河子 832003）

烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensis）是一種重要的藥用植物，對干旱、鹽堿等逆境脅迫具有較強(qiáng)的耐受性［1］。

次生代謝物質(zhì)是甘草的主要藥用成分，其含量與甘草的生長環(huán)境緊密相關(guān)。研究表明，適度的干旱脅迫能夠促進(jìn)甘草中甘草苷、甘草酸等有效成分的積累［2］；鹽脅迫能夠通過抑制初生代謝和促進(jìn)次生代謝，使得甘草酸和甘草苷相對含量增加［3］；甘草根中甘草苷、甘草酸銨和甘草次酸的含量在增強(qiáng)UV-B輻射下有顯著升高的趨勢［4］；適當(dāng)濃度的赤霉素GA3和茉莉酸甲酯MeJA處理能夠顯著促進(jìn)甘草有效成分的積累及其生物合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)［5-6］。

植物鈣調(diào)磷酸酶B類蛋白CBL是一類重要的Ca2+傳遞類傳感蛋白。CBL蛋白具有保守的4個(gè)EF結(jié)構(gòu)域，與鈣離子結(jié)合后，通過與下游蛋白CIPK（CBL-interaction protein kinase）相互作用介導(dǎo)鈣信號向下游傳遞，參與植物生長發(fā)育調(diào)控及應(yīng)對外界各種逆境信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)［7-8］。目前已從擬南芥、水稻和楊樹基因組中分別鑒定得到10個(gè)CBL基因［9］，此外，在高粱（6個(gè)）、葡萄（8個(gè)）、苔蘚（4個(gè)）及蕨類（4個(gè)）等不同植物中均有關(guān)于CBL成員的報(bào)道［10］。植物CBL基因在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育中發(fā)揮重要功能。擬南芥AtCBL1在高鹽、干旱、低溫和傷害等非生物脅迫下被誘導(dǎo)表達(dá)［11-13］。AtCBL2和AtCBL3不同程度的受光誘導(dǎo)表達(dá)［14］。低鉀脅迫下，擬南芥CBL1/CBL9通過與CIPK23作用調(diào)控質(zhì)膜上鉀離子通道蛋白AKT1的活性［15］；玉米ZmCBL4顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性［16］；陸地棉GhCBL2和GhCBL3在調(diào)節(jié)棉纖維的伸長方面發(fā)揮重要作用［17］。烏拉爾甘草非生物脅迫細(xì)胞生理學(xué)研究表明適度逆境脅迫一定程度上促進(jìn)了甘草藥用有效成分的累積［18-24］。

目前，關(guān)于烏拉爾甘草CBL基因家族的研究未見報(bào)道。本研究利用生物信息學(xué)方法從烏拉爾甘草全基因組中鑒定得到10個(gè)GuCBL基因，并對這些基因的染色體分布、基因結(jié)構(gòu)和基序、進(jìn)化關(guān)系和順式作用元件進(jìn)行了系統(tǒng)分析，研究GuCBL的組織特異性和響應(yīng)非生物脅迫的表達(dá)特征，為深入研究GuCBL在生長發(fā)育和逆境應(yīng)答中的功能和調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

甘草品種為野生藥用烏拉爾甘草，由石河子大學(xué)甘草研究所保存。甘草種子用98% H2SO4浸泡處理25 min，無菌水沖洗3次，0.1% HgCl2消毒7 min后播種至基質(zhì)盆缽內(nèi)，溫度為28℃白天/25℃黑夜，光照周期為16 h光照/8h/黑暗進(jìn)行蛭石培養(yǎng)45 d。收集同一時(shí)期烏拉爾甘草根、莖和葉片組織，置于-80℃?zhèn)溆谩＿x擇長勢一致的約45 d的烏拉爾甘草幼苗移至300 mL的水培瓶中，用1×Hoagland（去除Na+）營養(yǎng)液水培3 d后進(jìn)行非生物脅迫處理。分別 用 300 mmol/L NaCl、10%（W/V）PEG6000、2%H2O2、4℃和42℃處理模擬鹽、旱、氧化、低溫和高溫脅迫，收集處理后0、6、12和24 h上述處理的根部材料，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 烏拉爾甘草CBL基因家族成員鑒定及生物信息學(xué)分析 利用擬南芥10個(gè)CBL蛋白序列及大豆12個(gè)CBL蛋白序列在烏拉爾甘草基因組中進(jìn)行比對，去除重復(fù)后篩選獲得烏拉爾甘草GuCBL候選基因。利用在線網(wǎng)站http：//www.expasy.org/分析蛋白質(zhì)序列的長度、分子質(zhì)量和等電點(diǎn)等信息。利用Softberry網(wǎng) 站http：//linux1.softberry.com/berry.phtml預(yù)測亞細(xì)胞定位。使用MEGA軟件鄰接法Neighbor-Joining，將烏拉爾甘草、擬南芥、大豆3個(gè)物種的CBL基因構(gòu)建進(jìn)化樹。使用GSDS工具分析基因結(jié)構(gòu)特征，使用MEME軟件分析蛋白質(zhì)的保守基序。使用TBtool https：//github.com/CJ-Chen/TBtools軟件繪制GuCBL家族成員在不同Scaffold中的位置及基因間的復(fù)制關(guān)系。使用ClustalW 2.0對復(fù)制的GuCBL的CDS序列進(jìn)行比對，DnaSP 5.0軟件計(jì)算非同義替換Ka、同義替換Ks以及它們之間的比值（Ka/Ks）以評估進(jìn)化中的選擇壓力；使用Graphics工具分析并繪制烏拉爾甘草與擬南芥、大豆之間CBL基因家族成員的親緣關(guān)系及其同源性。利用UGENE軟件從基因組序列中獲取GuCBL上游1 500 bp的啟動(dòng)子序列，使用PlantCARE軟件http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plancare/html/分析存在的順式作用元件。

1.2.2 基因表達(dá)分析 使用TIANGEN公司的RNAPREP PURE PLANT KIT試劑盒提取不同材料總RNA，使用Takara公司高容量ScriptTM RT試劑盒合成cDNA。使用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物（表1）。選擇甘草肌動(dòng)蛋白基因（GuActin，Genbank：GQ404511）作為內(nèi)參基因進(jìn)行歸一化數(shù)據(jù)［25］。使用實(shí)時(shí)定量PCR檢測GuCBL的表達(dá)情況，引物由生工生物工程上海股份有限公司合成，每個(gè)測試樣品進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。相對表達(dá)值使用2-△△Ct法計(jì)算獲得，熱圖使用MeV軟件進(jìn)行聚類分析作圖。

2 結(jié)果

2.1 烏拉爾甘草CBL家族基因的鑒定

在烏拉爾甘草基因組數(shù)據(jù)庫中共初步鑒定獲得10個(gè)CBL成員GuCBL1-GuCBL10（表2）。在這10個(gè)GuCBL成員中，GuCBL4、GuCBL7和GuCBL10為拼接錯(cuò)誤序列，對這些基因進(jìn)行設(shè)計(jì)全長引物（表1），進(jìn)行PCR擴(kuò)增后獲得了這3個(gè)基因的完整全長序列。最終獲得了10個(gè)完整的GuCBL成員，分別定位在不同的染色體支架上（圖1）。GuCBL開放閱讀框的范圍為642-1 008 bp，GuCBL蛋白的分子量為24.36-41.46 kD，包含氨基酸數(shù)目為213-364aa，具有的等電點(diǎn)范圍為4.57-5.38，亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示GuCBL蛋白均定位在質(zhì)膜上，GuCBL蛋白N-末端均含有棕櫚?；稽c(diǎn)，其中，GuCBL5、GuCBL8和GuCBL9還含有豆蔻酰化位點(diǎn)（表2）。

圖1 烏拉爾甘草GuCBL在染色體支架上的分布Fig. 1 Chromosomal scaffold distribution of GuCBL genes in G. uralensis

2.2 烏拉爾甘草GuCBL系統(tǒng)發(fā)育分析

為了解烏拉爾甘草CBL系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，選擇與擬南芥和大豆的CBL共同構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，烏拉爾甘草GuCBL可分為A、B、C、D 4個(gè)組，分別包括3個(gè)（GuCBL2、GuCBL3、GuCBL6）、1個(gè)（GuCBL5）、2個(gè)（GuCBL1和GuCBL7）和4個(gè)（Gu-CBL4、GuCBL8、GuCBL9、GuCBL10）成員（圖 2）。

表2 烏拉爾甘草CBL基因家族特征分析Table 2 Characteristic analysis of G. uralensis CBL family genes

2.3 烏拉爾甘草GuCBL結(jié)構(gòu)及保守基序分析

通過對內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)和保守基序的分析，進(jìn)一步研究烏拉爾甘草CBL的結(jié)構(gòu)特征。結(jié)果顯示，不同組GuCBL成員顯示出不同的基因結(jié)構(gòu)，總體上分為與系統(tǒng)進(jìn)化分析一致的4個(gè)組A-D（圖3-a）。GuCBL包含12個(gè)保守基序（圖3-b）。所有的烏拉爾甘草GuCBL都含有motif 1-motif 5，分別是4個(gè)EF-hand結(jié)構(gòu)域和PFPF結(jié)構(gòu)域。

為了更直觀地體現(xiàn)GuCBL結(jié)構(gòu)域的位置，對其進(jìn)行了氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)它們除了在N端變化較大外，其他區(qū)域都相對比較保守。烏拉爾甘草GuCBL的氨基酸序列都含有4個(gè)EF手型結(jié)構(gòu)（圖4）；此外，GuCBL5、GuCBL8和GuCBL9的N端都含有一個(gè)非常保守的豆蔻酞化位點(diǎn)。在EF4手型域后相差8個(gè)氨基酸左右的位置還存在PFPF結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域中的絲氨酸殘基可能在提高CBL與CIPK之間互作的穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用。

2.4 烏拉爾甘草CBL基因在染色體上的定位及基因進(jìn)化關(guān)系分析

染色體分布及基因復(fù)制結(jié)果顯示，GuCBL存在2個(gè)片段重復(fù)基因?qū)uCBL1/GuCBL7和GuCBL2/GuCBL3（圖1）。對烏拉爾甘草、擬南芥和大豆的CBL進(jìn)行共線性分析，探究CBL基因家族的擴(kuò)張情況，發(fā)現(xiàn)26對CBL基因間存在共線性關(guān)系（圖5）。為更深入地理解CBL基因在進(jìn)化過程中的復(fù)制和功能分化，計(jì)算了GuCBL家族2個(gè)片段重復(fù)基因?qū)Φ腒a/Ks值，GuCBL1/GuCBL7、GuCBL2/GuCBL3兩 組重復(fù)基因?qū)Φ腒a/Ks＞1，說明它們進(jìn)行了正向選擇（表3）。通過計(jì)算田島相對進(jìn)化速率來評估這些重復(fù)對的進(jìn)化速率，其P值小于0.05，表明GuCBL正在經(jīng)歷加速進(jìn)化（表4）。

圖2 CBL家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析Fig. 2 Phylogenetic relationship analysis of the CBL family

2.5 烏拉爾甘草CBL基因順式作用元件分析

預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)GuCBL上游1 500 bp啟動(dòng)子序列中存多個(gè)逆境和激素應(yīng)答元件（圖6），多個(gè)GuCBL成員啟動(dòng)子具有TC-rich元件，說明這些成員可能與逆境應(yīng)答相關(guān)。GuCBL3、GuCBL6和GuCBL10啟動(dòng)子區(qū)域中有與生長素相關(guān)的響應(yīng)元件TGA-元件、AuxRE ；GuCBL2、GuCBL3、GuCBL5、GuCBL6、GuCBL8和GuCBL10的啟動(dòng)子含有GA響應(yīng)的元件 TATC-box、P-box 和 GARE-motif；GuCBL1、GuCBL2、GuCBL4、GuCBL5、GuCBL6、GuCBL7 和GuCBL10的啟動(dòng)子區(qū)域中檢測到ABA元件ABRE；除GuCBL3、GuCBL5、GuCBL7和GuCBL8外，其他GuCBL啟動(dòng)子區(qū)域中均檢測到乙烯響應(yīng)元件ERE；GuCBL1、GuCBL2、GuCBL4、GuCBL9和 GuCBL10 5個(gè)基因的啟動(dòng)子順式作用元件中存在MeJA響應(yīng)元件；4個(gè) GuCBL的啟動(dòng)子（GuCBL3、GuCBL5、GuCBL6和GuCBL7）還含有SA響應(yīng)元件；表明GuCBL可能受到各種不同激素的調(diào)控。多個(gè)GuCBL啟動(dòng)子中存在一個(gè)或兩個(gè)元件涉及類黃酮生物合成調(diào)控的MBSI元件，暗示這些GuCBL可能參與類黃酮的生物合成。以上結(jié)果表明，GuCBL可能與逆境應(yīng)答、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和生長發(fā)育過程密切相關(guān)。

圖3 烏拉爾甘草CBL家族基因基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析Fig. 3 Conserved motif and gene structure analyses of CBL family genes in G. uralensis

2.6 烏拉爾甘草CBL基因的組織特異性表達(dá)分析

圖4 烏拉爾甘草 CBL的多序列比對和保守結(jié)構(gòu)域分析Fig. 4 Multiple alignment and conserved motif analysis of CBL in G. uralensis

圖5 烏拉爾甘草、大豆和擬南芥CBL基因的共線性分析Fig. 5 Syntenic analysis of CBL genes in G. uralensis, G. max, and A. thaliana

表3 烏拉爾甘草同源CBL基因的Ka/Ks比值Table 3 Ka/Ks ratios for homologous CBL genes in G.uralensis

表4 烏拉爾甘草中同源CBL基因?qū)Φ奶飴u相對進(jìn)化速率分析aTable 4 Tajima relative rate tests of homologous CBL gene pairs in G. uralensisa

提取烏拉爾甘草根、莖、葉的RNA并進(jìn)行qRT-PCR，分析GuCBL的組織特異性表達(dá)特征。根據(jù)其表達(dá)情況經(jīng)MeV聚類分析后可分為4組（圖7），Ⅰ組和Ⅱ組的GuCBL成員在根組織中優(yōu)勢表達(dá)，同時(shí)在莖中有一定的表達(dá)，表明它們在根發(fā)育及相關(guān)生理代謝過程中可能發(fā)揮潛在的重要功能；Ⅲ組僅包含GuCBL6一個(gè)成員并在所有組織中表達(dá)均較低；Ⅳ組的2個(gè)成員GuCBL7和GuCBL10在莖中具有一定的表達(dá)，在根和葉中表達(dá)量都較低。以上結(jié)果表明，I組和II組的GuCBL可能在烏拉爾甘草根組織的發(fā)育及生理代謝過程中發(fā)揮著重要作用。

2.7 GuCBL響應(yīng)非生物脅迫處理的表達(dá)特征分析

收集非生物脅迫處理的烏拉爾甘草根組織的材料并提取RNA進(jìn)行qRT-PCR分析（圖8），GuCBL家族成員在不同的脅迫處理下的轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)不同的表達(dá)特征，通過MeV聚類后，GuCBL的表達(dá)分為不同的4個(gè)亞組。在NaCl刺激下，GuCBL的表達(dá)總體呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，但N4組的3個(gè)成員GuCBL2、GuCBL9、GuCBL10在處理后6和12 h受到誘導(dǎo)表達(dá)。H2O2氧化脅迫處理后，O1組的基因家族成員呈上調(diào)表達(dá)，并在處理24 h后達(dá)到最大值；O2和O3組的成員GuCBL1和GuCBL7均呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)；H4組的3個(gè)成員GuCBL3、GuCBL4和GuCBL10在處理6 h后顯著上調(diào)隨后下降。PEG模擬干旱脅迫時(shí)，P1和P2組的GuCBL成員在處理6-24 h均表現(xiàn)出顯著的誘導(dǎo)表達(dá)。GuCBL基因家族在響應(yīng)低溫、高溫刺激時(shí)，在一段時(shí)間內(nèi)脅迫處理促進(jìn)了基因的表達(dá)，4℃處理誘導(dǎo)了L2組的GuCBL1和GuCBL2、L3組的GuCBL9和GuCBL6的增加表達(dá)；42℃處理促進(jìn)了H1組中4個(gè)成員和H3組中3個(gè)成員的顯著增加表達(dá)。結(jié)果表明，GuCBL可能通過增加表達(dá)在烏拉爾甘草響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。

圖6 GuCBL啟動(dòng)子中的順式作用元件分布Fig. 6 Distribution of cis-elements in GuCBL promoter regions

圖7 烏拉爾甘草GuCBL的組織特異性表達(dá)分析Fig. 7 Tissue-specific expression analysis of G. uralensis GuCBL genes

3 討論

細(xì)胞內(nèi)Ca2+是調(diào)控多種細(xì)胞功能的第二信使［26］，植物受到非生物逆境與其他細(xì)胞外界刺激時(shí)會進(jìn)行胞內(nèi)外信號的轉(zhuǎn)化，鈣信使通過與鈣結(jié)合蛋白相互作用，將外界信息傳遞給不同的信號通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝活動(dòng)，響應(yīng)外界環(huán)境變化［27］。CBL作為一類重要的鈣離子結(jié)合蛋白，家族內(nèi)不同的CBL成員的功能存在特異性，已從大豆、苜蓿、擬南芥等作物中均已克隆到多個(gè)CBL家族基因，為研究烏拉爾甘草CBL家族基因提供了一定基礎(chǔ)。

本研究從烏拉爾甘草基因組中鑒定獲得10個(gè)GuCBL基因。成員均含有能與鈣結(jié)合的EF-hand結(jié)構(gòu)和與CIPK互作的PFPF結(jié)構(gòu)域。烏拉爾甘草GuCBL可分為4個(gè)組，且存在多對垂直同源基因?qū)?。重?fù)基因?qū)Φ腒a / Ks比及田島相對進(jìn)化速率，顯示GuCBL家族基因正處于加速進(jìn)化過程中，其可能在基因家族的擴(kuò)大過程中發(fā)揮著一定作用。啟動(dòng)子順式作用元件分析顯示GuCBL成員不僅含有多個(gè)非生物脅迫響應(yīng)元件，還存在許多激素響應(yīng)、生長發(fā)育調(diào)控等元件，表明GuCBL潛在的重要功能。同一組內(nèi)的GuCBL 基因含有脅迫及激素應(yīng)答元件的類型和數(shù)量也各不相同，說明不同GuCBL的表達(dá)調(diào)控方式具有特異性和復(fù)雜性，其具體功能還需進(jìn)一步研究。

CBL不僅參與種子萌發(fā)和幼苗生長過程，還參與植物自身的防御［28-29］。大多數(shù)烏拉爾甘草GuCBL基因在根組織中優(yōu)勢表達(dá)，暗示這些基因在植物根發(fā)育過程中可能發(fā)揮重要功能。CBL在植物逆境應(yīng)答信號中發(fā)揮極其重要的作用，該蛋白與其下游CIPK靶蛋白組成的CBL-CIPK信號系統(tǒng)參與了植物多種逆境應(yīng)答信號途徑［30］。擬南芥AtCBL10主要受鹽誘導(dǎo)［31］；PbCBL9在鹽脅迫下、PbCBL2在低溫脅迫下持續(xù)高水平表達(dá)［32］；胡楊PeCBL6在干旱脅迫條件下呈震蕩變化的情況［33］。本研究對烏拉爾甘草進(jìn)行了不同的脅迫處理，GuCBL在不同處理下呈現(xiàn)不同的誘導(dǎo)表達(dá)特征，暗示它們與逆境脅迫應(yīng)答之間的密切關(guān)系。鑒于非生物脅迫能夠促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的累積［34］，表明了GuCBL的表達(dá)與逆境脅迫下次生代謝產(chǎn)物合成之間的直接或間接聯(lián)系，具體的功能還需進(jìn)一步的遺傳實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖8 烏拉爾甘 GuCBL響應(yīng)非生物脅迫的表達(dá)分析Fig. 8 Expression analysis of G. uralensis GuCBL genes in response to abiotic stress

4 結(jié)論

從烏拉爾甘草基因組中成功鑒定出10個(gè)GuCBL家族基因，GuCBL在根組織中較高表達(dá)，能夠被鹽、氧化、干旱、低溫和高溫誘導(dǎo)表達(dá)。