高羊茅FaFT基因表達、蛋白互作及生物學(xué)功能分析

羅維 牟瓊 舒健虹 吳佳海，3 王小利

（1. 貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院 高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴陽 550025；2. 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所，貴陽 550006；3. 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹科學(xué)研究所，貴陽 550006）

開花是植物從營養(yǎng)到生殖階段的關(guān)鍵時刻，是一個復(fù)雜的發(fā)育調(diào)控過程，并受內(nèi)外因素的影響。植物需要適當(dāng)?shù)耐饨绛h(huán)境條件，如適宜的光周期和溫度，在一定時間內(nèi)刺激開花［1］。溫度、光照等條件適宜時，植物葉片產(chǎn)生的成花物質(zhì)或信號傳遞到莖尖的生長點，在頂端分生組織內(nèi)（shoot apical meristem，SAM）啟動開花基因的表達，促使植物進入成花決定態(tài)［2］。

基于對模式植物擬南芥的研究表明，在植物的成花轉(zhuǎn)變中有多種途徑，包括赤霉素途徑、自發(fā)途徑、春化途徑及光周期途徑［3］。不同途徑能感受不同的外界信號刺激，共同調(diào)控植物開花過程。FLOWERING LOCUS T（FT）是重要的開花促進因子，研究證明 FT基因編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物是長距離轉(zhuǎn)運的成花素，屬于磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白基因（phosphatidylethanolamine binding protein，PEBP）家族，該家族成員在植物中是高度保守的調(diào)控因子，在被子植物和裸子植物中發(fā)現(xiàn)PEBP家族進化出開花抑制子和活化子。在適宜的光照下，F(xiàn)T基因受光周期誘導(dǎo)在葉片中表達，其表達產(chǎn)物經(jīng)維管束轉(zhuǎn)移到莖頂端分生組織調(diào)控下游基因表達促進開花。FT蛋白到達SAM后，與bZIP轉(zhuǎn)錄因子FLOWERING LOCUS D（FD）相互作用，F(xiàn)T /FD復(fù)合系統(tǒng)激活了許多MADS盒基因，包括APETALA1（AP1），F(xiàn)RUITFULL（FUL） 和 SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1（SOC1）過度表達CONSTANS（CO）刺激花器官的啟動［4］。FT基因位于開花促進基因CO基因的下游，在光周期途徑中，CO基因受到光周期節(jié)律GIGANTEA（GI）基因的誘導(dǎo)，CO基因表現(xiàn)出節(jié)律變化，從而激活 FT基因的轉(zhuǎn)錄和表達［5］。春化途徑中，F(xiàn)LOWERING LOCUS C（FLC）基因是春化途徑的關(guān)鍵基因，它是一個開花抑制子，既能在葉片中抑制 FT 基因的表達，也在莖頂端生長點抑制 FD 和 SOC1基因的表達，能影響莖頂端分生組織對來自葉片 FT蛋白信號的應(yīng)答能力。但春化后，F(xiàn)LC基因的表達被抑制，這時在長日照條件下，CO基因通過上調(diào) FT基因表達，進而促進SOC1和AP1基因 mRNA的積累而啟動開花［5-6］。在甜菜（Beta vulgaris）中，春化涉及到兩個相互拮抗作用的FT基因，BvFT1抑制BvFT2基因的表達，BvFT2 基因促進植物開花。春化后，BvFT1 基因的表達被抑制，BvFT2 基因表達促進植物開花［7］。在小麥（Triticum aestivum）和大麥（Hordeum vulgare）中，春化作用調(diào)控開花抑制子［8］，使得 VERNALIZATION1（VRN1）基因表達上調(diào)，VERNALIZATION2（VRN2）基因表達下調(diào)，進而使得 FT基因表達促進植物開花［9-10］。FD基因同樣參與調(diào)控植物開花進程，研究發(fā)現(xiàn)喪失功能的擬南芥fd突變體表現(xiàn)出晚花，當(dāng)FD過量表達時可以幫助植物正常開花。FD基因能促進FT發(fā)揮作用，表現(xiàn)為fd突變體過量表達FT基因并沒有早花表型［11］。

目前FT基因已經(jīng)在多種植物中被分離出來，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）［12］、水稻（Oryza sativa）［13］、洋蔥（Allium cepa）［14］、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）［1］、 陸 地 棉（Gossypium hirsutum）［15］等，而在高羊茅的成花機制研究甚少。高羊茅由于耐熱性好、抗逆性強，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于草坪種植和牧草栽培，對草坪業(yè)和畜牧業(yè)有重要意義。本研究從前期高羊茅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中克隆出FaFT基因并對其進行生物信息學(xué)和亞細(xì)胞定位分析；運用qRT-PCR分析該基因在不同光照處理下及不同發(fā)育時期下的表達情況；應(yīng)用酵母雙雜交方法對互作蛋白FD進行探究，為進一步探討高羊茅的成花機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗選用的“黔草1號”高羊茅為貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所2005年培育品種（國審：299）。TRIzol購自美國Invitrogen公司，cDNA合成試劑盒購自TaKaRa公司，所用相關(guān)載體由實驗室保存，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 FaFT基因在高羊茅基因組中擴增與序列分析 所取樣品參照TRIzol說明書提取總RNA，cDNA第一鏈合成參照TaKaRa試劑盒。根據(jù)“黔草1號”基因組，用Primer 5.0設(shè)計擴增引物FaFT-F1/FaFT-R1進行目的序列擴增（表1），PCR反應(yīng)程序：4 μL dNTP Mixture（0.0025 mol/L）、5 μL 10×PCR Buffer（Mg2+）、2 μLcDNA、3 μL MgCl2（0.025 mol/L）3 μL、0.25 μL TaKaRa Taq 酶、上下游引物FaFT-F/FaFT-R 各 2 μL， 補 ddH2O 至 50 μL。 反 應(yīng)條件為預(yù)變性94℃ 2 min，35個循環(huán)（94℃ 10 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s），72℃ 延伸 10 min。待反應(yīng)結(jié)束后用1%的瓊脂糖凝膠檢測PCR擴增產(chǎn)物，并膠回收試劑盒收回目的片段，篩選純化后送寶生物工程（大連）有限公司測序，測序結(jié)果用Blast數(shù)據(jù)庫分析。

表1 引物信息Table 1 Primer sequence

1.2.2 FaFT基因表達分析 篩選大小相近的高羊茅種子經(jīng)消毒后平鋪在1/2MS固體培養(yǎng)基上，待長出子葉后移栽至裝有蛭石和土壤的小花盆中（蛭石和土壤比例為1∶1），將小花盆放入不同光照培養(yǎng)箱。長日照（22℃，16 h/8 h）、短日照（22℃，8 h/16 h），最后分別在長日照和短日照基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)入光照/黑暗與黑暗/光照循環(huán)模式轉(zhuǎn)入黑暗/光照循環(huán)模式。以GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）為內(nèi)參基因，將保存好的cDNA稀釋20倍用于qRT-PCR分別檢測高羊茅葉片中FaFT基因在長日照和短日照、長日照轉(zhuǎn)、短日照轉(zhuǎn)連續(xù)黑暗和連續(xù)光照、晝夜顛倒處理下以及長日照下不同生長發(fā)育階段的表達量。每個樣品3個技術(shù)重復(fù)，3個生物學(xué)重復(fù)，采用2-ΔΔCt方法分析數(shù)據(jù)。

1.2.3 亞細(xì)胞定位分析 利用雙酶切將FaFT的編碼區(qū)克隆到1300-GFP表達載體上，構(gòu)建FaFT-1300-GFP重組質(zhì)粒。將FaFT-1300-GFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞GV3101，篩選陽性菌落接種于LB（含 100 μg/mL Rif）28℃培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng) 24 h，離心后收集菌體。再加入0.1 mol/L的乙酰丁香酮2 μL和 0.5 mol/L MES 100 μL，28℃搖床培養(yǎng)OD值約1.0左右。4 000 r/min常溫離心10 min，15 min收集菌體，用含0.01 mol/L MgCl2重懸菌體至OD值為1.0，以每毫升菌液加入2 μL 0.1 mol/L AS，靜置3 h以上。將侵染液裝入5 mL注射器內(nèi)，用拇指按壓注射器反板將液體從葉片下表皮注射到煙草葉片內(nèi)，72 h后，取樣通過激光共聚交熒光顯微鏡檢測熒光信號。GFP激發(fā)光為488 nm，DAPI激發(fā)光為405 nm。

1.2.4 酵母雙雜交 構(gòu)建FaFD-pGADT7和FaFTPGBKT7載體，利用PEG/LiAc介導(dǎo)法將陰性對照pGBKT7和pGADT7、陽性對照pGADT7和pGBKT7-53和實驗組FaFD-AD和FaFT-BD同時轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109。將轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞加入0.9%NaCl溶液懸浮后的菌液涂布于SD/-Leu/-Trp（缺陷型-亮氨酸-色氨酸）培養(yǎng)基，待SD/-Leu/-Trp培養(yǎng)基上長出克隆后，挑取克隆至SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp（缺陷型腺嘌呤-組氨酸-亮氨酸-色氨酸）上。30℃恒溫箱培養(yǎng)3-5 d后進行X-α-Gal檢測。

1.2.5 雙分子熒光互補驗證（bimolecular fluorescence complementation，BiFC） 將 FaFT基因的編碼區(qū)構(gòu)建至pSPYCE-35S載體，所用引物為FaFTC-F ：5′-GCCTGGCGCGCCACTAGTGGATCCA-3′，F(xiàn)aFT-C-R：5′-CATCCCGGGAGCGGTACCCTCGAG-3′；同樣將FD基因編碼區(qū)構(gòu)建至pSPYNE-35S載體。將FaFT-pSPYCE-35S和FD-pSPYNE-35S轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，將攜帶表達載體的農(nóng)桿菌菌株注入煙草葉片，培養(yǎng)72 h后激光共聚焦顯微鏡下觀察黃色熒光蛋白（YFP）信號。

1.2.6 FaFT基因生物學(xué)功能驗證 FaFT基因表達載體構(gòu)建：構(gòu)建pCAMBIA1300-35S-FaFT 過量表達載體：根據(jù)終載體pCAMBIA1300-35S的圖譜設(shè)計Kpn I-XbaI為插入位點并合成引物并擴增，操作步驟按試劑盒說明書進行。PCR反應(yīng)體系及條件：2×PCR Buffer for KOD FX Neo 25 μL，0.01 mol/L dNTP Mix 1 μL，KOD FX Neo（1U/μL）1 μL，cDNA 第 一鏈 5 μL，primer F（10×）1.5 μL，primer R（10×）1.5 μL，PCR-Grade Water 15 μL ；預(yù)變性 98℃ 5 min，35個循環(huán)（98℃ 10 s，55℃ 30 s，68℃ 30 s），68℃ 延伸10 min。經(jīng)檢測合格后與pCAMBIA1300-35S載體進行體外連接轉(zhuǎn)化，再將轉(zhuǎn)化出來的單菌落通過搖菌后用空載體的通用引物進行菌液PCR鑒定，最后將經(jīng)過菌液PCR鑒定的陽性菌液進行測序。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化：常規(guī)方法種植野生型擬南芥Ler和突變體ft擬南芥：選取飽滿的野生型擬南芥種子，先用70%的無水乙醇消毒，震蕩離心后用無菌水沖洗，重復(fù)5次。再用0.7%的次氯酸鈉溶液震蕩混勻后靜置15 min，離心吸除上清液，繼續(xù)用無菌水沖洗3次。消毒完畢后將種子晾干，均勻點播在MS培養(yǎng)基上，封口。將MS培養(yǎng)基置于光照培養(yǎng)箱中（光照16 h/d，黑暗8 h/d，溫度22℃）。待生長一周后，擬南芥幼苗轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)土與蛭石比為1∶1的花盆中。定期澆水。將農(nóng)桿菌菌液擴大培養(yǎng)60 mL。4 500 r/min，10 min離心菌體，用侵染液重懸菌體并使得菌體的OD600到達0.8左右。將pCAMBIA1300-35S-FaFT過量表達載體轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Ler和突變體ft獲得FaFT基因過量表達植株和FT基因功能補償轉(zhuǎn)基因植株。取生長狀況良好的野生型擬南芥（花序較多的植株，未結(jié)莢）的花序浸入到菌體侵染液中3 min。結(jié)束后讓侵染株系在暗環(huán)境下處理1 d。次日轉(zhuǎn)移到正常生長條件下。相隔一周后侵染第2次。正常生長澆水等待收獲T0代種子。每個處理及對照各9株，記錄轉(zhuǎn)基因株和對照株開花時間，蓮座葉數(shù)量。

教師在寫英語作文評價時要有針對性，應(yīng)該因人而異，因材施教。學(xué)生的英語基礎(chǔ)不一樣,衡量的標(biāo)準(zhǔn)也應(yīng)不同,教師一定要把握好評價的尺度。做到既要糾正學(xué)生的錯誤，也要鼓勵學(xué)生繼續(xù)寫作。不同水平的學(xué)生也應(yīng)該采取不同的評價標(biāo)準(zhǔn)，對于英文寫作水平較高的學(xué)生，要表揚中有指正，對于中等水平的學(xué)生，教師要以鼓勵為主，對于那些不擅長寫英語作文的學(xué)生，要盡量從內(nèi)容或者形式上，找出其閃光點，比如對幾個準(zhǔn)確的詞語，幾句符合語法規(guī)則的句型做出標(biāo)識，并加以贊揚，激起學(xué)生寫作的興趣。

轉(zhuǎn)基因植株的陽性初步篩選：收獲的T0代種子經(jīng)過烘干無菌消毒洗滌后均勻鋪具有潮霉素抗性（40 mg/L）的MS培養(yǎng)基上，春化3 d后轉(zhuǎn)移到正常條件下生長。觀察根的生長。一般陽性株會正常發(fā)芽、生根、葉片舒展，而非轉(zhuǎn)基因株系只有發(fā)芽，無根、無葉片。挑取選擇培養(yǎng)基上的正常生長的幼苗轉(zhuǎn)移到不加抗性的MS培養(yǎng)基上，待植株生長3-5 d左右可移栽到小花盆土中篩選T1代植株種子，常規(guī)種植T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子，繼續(xù)篩選獲得T2代植株。每個處理及對照各9株都置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（光照16 h/d，黑暗8 h/d，22℃），記錄轉(zhuǎn)基因株和對照開花時間和蓮座葉數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 FaFT基因的序列

測序結(jié)果（圖1）顯示，高羊茅FaFT基因有完整的cDNA序列，全長1 073 bp，有長度為537 bp的開放閱讀框，編碼178個氨基酸殘基。

圖1 FaFT基因的核苷酸序列及氨基酸序列Fig. 1 Nucleotide sequence and amino acid sequence of FaFT

2.2 高羊茅開花FaFT基因的表達分析

2.2.1 FaFT基因在長日照和短日照條件下晝夜表達節(jié)律分析 從圖2-A可知，F(xiàn)aFT基因在長日照（Long-day，LD）條件下具有規(guī)律的晝夜震蕩且周期約為24 h。2個光周期內(nèi)，在開燈后ZT4-ZT8這一階段表達量上升，到ZT8達最大值隨后逐漸下降。FaFT基因在短日照（short-day，SD）下的表達與LD下表達模式基本相似，表達高峰出現(xiàn)的時間都在ZT8，但表達量較LD低（圖2-B）。

圖2 長日照（A）、短日照（B）下高羊茅FaFT基因的表達水平Fig. 2 Expression level of FaFT gene in tall fescue under long day (A) and short day (B)

2.2.2 長日照和短日照條件下轉(zhuǎn)入連續(xù)光照和連續(xù)黑暗條件下FaFT基因的晝夜表達分析 與LD相比，把高羊茅從長日照轉(zhuǎn)入連續(xù)光照后（LD-LL），F(xiàn)aFT基因的表達量急劇下降，在第1個光周期內(nèi)ZT4-ZT12表達量很低，幾乎檢測不到，但仍維持一定的晝夜節(jié)律。不同的是表達峰值出現(xiàn)在ZT0，2個光周期內(nèi)的表達模式基本維持一致（圖3-A）。轉(zhuǎn)入連續(xù)黑暗（LD-DD），與（LD-LL）的表達模式基本相近，F(xiàn)aFT基因表達量下調(diào)，表達節(jié)律減弱，2個光周期內(nèi)表達峰值同樣出現(xiàn)在ZT0（圖3-B）。短日照轉(zhuǎn)入連續(xù)光照SD-LL下（圖3-C），F(xiàn)aFT基因表達的晝夜節(jié)律不明顯。第1個光周期的表達量高于第2個光周期且有2個表達峰值，分別是ZT4和ZT20。第2個光周期的表達峰值出現(xiàn)在ZT12，時間晚了4 h。SD-DD（圖3-D）下，F(xiàn)aFT基因表達模式與SD相似，但表達峰值出現(xiàn)時間較之晚了4 h，出現(xiàn)在ZT12，且表達量也基本相近。

2.2.3 光照/黑暗與黑暗/光照循環(huán)模式轉(zhuǎn)入黑暗/光照循環(huán)模式FaFT基因的晝夜表達分析 由圖可知，光照/黑暗處理（圖4-A），高羊茅FaFT基因在第一個光周期有2個表達高峰，分別是ZT8和ZT20，第2天的表達量有所上調(diào)，但在兩個光周期的變化趨勢相似。由光照/黑暗處理轉(zhuǎn)入黑暗/光照后（圖4-B），其表達量急劇降低，兩個光周期的表達高峰出現(xiàn)的時間分別在ZT16和ZT20。D/L下（圖4-C），F(xiàn)aFT在兩個周期的表達形式相似，第1個光周期ZT0-ZT8表達量很小，幾乎檢測不到，但都在ZT20達到表達高峰。由D/L轉(zhuǎn)入L/D后（圖4-D），F(xiàn)aFT的表達高峰在ZT4，較其他3種情況早。

2.2.4 不同生長發(fā)育階段FaFT基因的晝夜表達節(jié)律分析 長日照條件下，F(xiàn)aFT基因在不同發(fā)育時期葉片中的表達模式基本相同，在各個發(fā)育時期葉片中都有表達。苗期（圖5-A）、分蘗期（圖5-B）、孕穗期（圖5-D）3個時期的表達規(guī)律基本一致，表達量相近，并且2個光周期內(nèi)表達高峰出現(xiàn)的時間都出現(xiàn)在ZT4。抽穗期（圖5-C）FaFT基因在孕穗期葉片中的表達量高于其他3個時期，2個光周期內(nèi)表達高峰出現(xiàn)在ZT12、ZT16，比其他3個時期的表達高峰出現(xiàn)的時間晚。總的來說，F(xiàn)aFT基因在長日照條件下4個不同時期的表達模式基本相同，呈現(xiàn)一定的晝夜節(jié)律性。

2.3 FaFT的亞細(xì)胞定位分析

圖3 長日照轉(zhuǎn)連續(xù)光照（A）和連續(xù)黑暗（B）、短日照轉(zhuǎn)連續(xù)光照（C）和連續(xù)黑暗（D）高羊茅FaFT基因的表達水平Fig.3 Expression level of FaFT gene of tall fescue from sunlight to continuous light (A) and continuous darkness (B) based on long day, continuous light (C) and continuous darkness (D) based on short day

圖4 高羊茅在光照/黑暗（A）、光照/黑暗-黑暗/光照（B）、黑暗/光照（C）、黑暗/光照-光照/黑暗（D）下FaFT基因的表達水平Fig.4 Expression level of FaFT gene in tall fescue under light/dark (A), light/dark-dark/light (B),dark/light (C), dark/light-light/dark (D)

圖5 高羊茅FaFT基因在苗期（A）、分蘗期（B）、孕穗期（C）、抽穗期（D）的表達分析Fig. 5 Expression analysis of the FaFT gene of tall fescue at the seedling stage (A), tillering stage(B), booting stage (C) and heading stage (D)

圖6 FaFT在煙草表皮細(xì)胞中的表達Fig.6 FaFT expression in tobacco epidermal cells

2.4 FaFT互作蛋白FD的初步驗證

FT一般與FD形成復(fù)合物發(fā)揮作用，利用酵母雙雜交技術(shù)探索FT與FD之間的相互作用，并用相應(yīng)的培養(yǎng)基來檢測是否轉(zhuǎn)化成功。如圖7所示，酵母雙雜交結(jié)果顯示所有共轉(zhuǎn)BD和AD載體的AH109菌株在二缺培養(yǎng)基上都長出了克隆，說明共轉(zhuǎn)化成功；將SD/-Leu/-Trp培養(yǎng)基上的克隆挑取至SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平皿中培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，除了共轉(zhuǎn)化陽性對照質(zhì)粒的AH109長出克隆外，而FaFD/FaFT實驗組也長出克隆；將SD/-Leu/-Trp上的克隆挑取至含有 X-α-Gal的 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 上培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)除了共轉(zhuǎn)化陽性對照質(zhì)粒變藍(lán)，F(xiàn)aFD/FaFT實驗組也變藍(lán)，此實驗結(jié)果說明FaFD蛋白和FaFT蛋白有潛在互作。

圖7 FaFT與FD相互作用的篩選Fig.7 Screening of interaction between FaFT and FD

2.5 BiFC驗證

利用BiFC技術(shù)進一步驗證FaFT與FD互作的真實性。將FaFT-pSPYCE-35S與YFP的N-端片段（1-155aa）融合，將FD-pSPYNE-35S與YFP的C-端片段（156-239aa）融合，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化在煙草表皮細(xì)胞表達。結(jié)果如圖8所示，當(dāng)FaFT與FD共表達時，在表皮細(xì)胞中可觀察到黃色熒光信號，僅有FaFT或FD時并未檢測到黃色熒光信號，說明FaFT蛋白和FD蛋白能發(fā)生相互作用。該結(jié)果與酵母雙雜交結(jié)果一致。

圖8 FaFT與FD的BiFC實驗驗證Fig. 8 BiFC experimental verification of FaFT and FD

2.6 高羊茅FaFT基因促進擬南芥開花

構(gòu)建pCAMBIA1300-35S-FaFT過量表達載體，轉(zhuǎn)化擬南芥野生型Ler和突變體ft，長日照條件下，F(xiàn)aFT基因過量表達擬南芥植株表現(xiàn)出早花，功能補償后的突變體ft則恢復(fù)了野生型的開花表型，突變體ft本身沒有開花現(xiàn)象，一直停留在營養(yǎng)生長期，這表明FaFT基因促進擬南芥提前開花，恢復(fù)了ft突變體的晚花表型。

將擬南芥野生型和轉(zhuǎn)基因植株種植在長日照條件下，結(jié)果（圖9）顯示：在長日照條件下，轉(zhuǎn)FaFT基因擬南芥比野生型Ler開花提前約4 d，比ft突變體功能補償植株早3 d左右；與野生型蓮座葉9.89±1.7相比，過表達FaFT基因擬南芥蓮座葉數(shù)量為11.2±1.41，轉(zhuǎn)基因突變體ft蓮座葉數(shù)達到9.1±0.73植株開花。這也表明FaFT基因能促進擬南芥開花。

3 討論

FT蛋白是促進植物由營養(yǎng)生長到生殖生長轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵因子，能夠整合多條開花途徑。學(xué)者對擬南芥［16］、水稻［17］、二穗短柄草［18］和小麥［2］開花基因FT的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)T蛋白的基本功能非常保守，主要參與植物開花的誘導(dǎo)。高羊茅FT基因cDNA全長1 073 bp，開放閱讀框537 bp，編碼178個氨基酸殘基，其與黑麥草、節(jié)節(jié)麥等禾本科牧草的氨基酸序列相似性較高，有很近的親緣關(guān)系［19］。通過亞細(xì)胞定位得出高羊茅FT基因編碼的蛋白定位在細(xì)胞核，在細(xì)胞核中發(fā)揮生理作用，也說明FaFT基因進化保守，與黑麥草、節(jié)節(jié)麥等禾本科牧草FT基因同源，可能有相似的功能。

圖9 轉(zhuǎn)基因擬南芥的開花時間、蓮座葉數(shù)量及表型Fig.9 Flowering time, rosette leaf number and phenotype of transgenic Arabidopsis

光照是影響植物開花轉(zhuǎn)變的重要因素，在合適的光照下FT基因受CO基因的誘導(dǎo)在葉片中表達。擬南芥在LD下能啟動開花機制，長日照下FT基因的mRNA的表達量隨著發(fā)育時間而逐漸增加，Kong等［20］在大豆中克隆了10個FT同源基因，其中GmFT2a和GmFT5a的表達量最高且受生物鐘調(diào)控，表現(xiàn)出一定的晝夜節(jié)律。這兩個基因在短日照條件下光照后ZT4時表達量最大，長日照開花時間晚于短日照，但二者都能促進開花。在小麥中，存在3個春化基因，VNR1、VRN2和VRN3，VRN3是與擬南芥FT基因同源，受春化和長日照的誘導(dǎo)從而促進開花；水稻Hd3a是擬南芥FT的同源基因，在LD下的表達量隨著春化時間逐漸上升［2］。本研究對高羊茅不同光照處理下的轉(zhuǎn)錄水平分析得出，F(xiàn)aFT基因在長日照、短日照下的表達量不同，長日照下表達量高于短日照，但表達高峰都出現(xiàn)在有光照時期；在LD-LL和LD-DD兩種條件下，F(xiàn)aFT基因的表達量相比LD、SD下有所降低，但表達高峰出現(xiàn)的時間一致（ZT0）；SD-LL下，F(xiàn)aFT基因的表達出現(xiàn)2個表達高峰（ZT4和ZT0），SD-DD下的表達高峰延遲在ZT12；L/D、L/D-D/L、D/L、D/L-L/D晝夜顛倒后，雖然FaFT基因的表達高峰出現(xiàn)的時間不一致，但都能維持一定的規(guī)律，表現(xiàn)為“雙峰型”。這也說明高羊茅FaFT基因受光周期的調(diào)控。同樣，LD下，F(xiàn)aFT基因在不同發(fā)育時期的葉片中都有表達，在孕穗期葉片中的表達量最高。如果改變光照時間，F(xiàn)aFT基因葉片中的表達情況是否一致，這有待于進一步研究。

FT蛋白在葉片合成后經(jīng)葉脈到達頂端分生組織（SAM）與bZIP轉(zhuǎn)錄因子FD相互作用，F(xiàn)T/FD復(fù)合物激活許多MADS盒基因啟動開花。14-3-3蛋白是動植物中保守的一個調(diào)節(jié)分子家族，可以與水稻頂端芽中的FT同源Hd3a直接相互作用，形成功能性復(fù)合物，轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核［21］。因此，14-3-3蛋白可以充當(dāng)支架蛋白，從而將FT與FD結(jié)合以觸發(fā)開花。本研究為驗證FT蛋白FD的作用，用酵母雙雜交和BiFC驗證了高羊茅FaFT蛋白和FD蛋白發(fā)生相互作用的真實性。

蔡宇鵬［22］在大豆中發(fā)現(xiàn)ft2a突變體無論是長日照還是短日照均表現(xiàn)為晚花，過表達GmFT2a植株開花時間都比野生型和突變體植株早，ft2a突變體的表達模式與野生型相似呈“雙峰型”，只是表達量很低。當(dāng)把野生型植株先置于短日照13 d后轉(zhuǎn)入長日照，野生型植 株開花時間比LD下早，晚于SD，即短日照誘導(dǎo)產(chǎn)生的開花促進物質(zhì)能在長日照下促進開花。同樣光照處理的突變體植株并未恢復(fù)晚花表型。為驗證FT基因的功能，本文成功構(gòu)建FaFT基因過表達載體并轉(zhuǎn)入野生擬南芥Ler和突變體ft，均成功獲得轉(zhuǎn)基因植株。LD下，F(xiàn)aFT基因過量表達擬南芥植株表現(xiàn)出早花，突變體ft恢復(fù)了野生型的開花表型，這表明FaFT基因促進擬南芥提前開花，恢復(fù)了ft突變體的晚花表型，成功驗證了該基因的功能。

4 結(jié)論

從高羊茅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中成功克隆得到FaFT基因，該基因在不同光照處理下的表達能維持一定的晝夜節(jié)律，受光周期的調(diào)控。亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)FaFT基因編碼的蛋白定位在細(xì)胞核；通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補實驗得出高羊茅FaFT蛋白能和FD蛋白發(fā)生相互作用；FaFT基因過表達在長日照下能促進擬南芥提前開花，且恢復(fù)突變體擬南芥開花。