柑橘木虱對(duì)12種寄主植物嫩梢及其揮發(fā)物成分的趨性反應(yīng)

湯夏安，李賢良，池章辰，韋舒蔚，鄧業(yè)成*，鄧志勇，駱海玉，鄧明學(xué)

(1. 廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541004；>2. 廣西特色作物研究院，廣西 桂林 541004)

柑橘木虱DiaphorinacitriKuwayama屬半翅目扁木虱科，是柑橘黃龍病自然傳播的主要蟲媒。柑橘黃龍病是一種分布廣泛的對(duì)柑橘產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重威脅的病害(王國平等，2007)，其病原為韌皮部桿菌CandidatusLiberibacteria asiaticus。由于該韌皮部桿菌目前尚無法人工培養(yǎng)，所以對(duì)柑橘黃龍病的病理和防治研究進(jìn)展十分緩慢。目前對(duì)柑橘黃龍病的防治研究主要集中在對(duì)柑橘木虱的防控上，而對(duì)柑橘木虱的防治以化學(xué)手段為主。但長期使用化學(xué)藥劑不僅對(duì)果園生態(tài)系統(tǒng)造成嚴(yán)重破壞，而且還會(huì)帶來農(nóng)藥殘留和木虱抗藥性等問題(鄧明學(xué)等，2012；田發(fā)軍等，2018)。面對(duì)不斷肆虐的柑橘黃龍病問題，研究柑橘木虱的綠色防控技術(shù)顯得十分重要和迫切。

現(xiàn)行的柑橘木虱綠色防控措施以物理手段為主，物理防控手段當(dāng)中以黃板誘殺較為流行(鄧明學(xué)等，2010)。在黃板誘集柑橘木虱的過程中也會(huì)帶來一些負(fù)面影響，有研究表明有很大數(shù)量的昆蟲具有趨黃性，在果園中采取黃板誘殺柑橘木虱的過程中會(huì)誘捕到大量的柑橘木虱天敵昆蟲，從而一定程度上損害了果園生態(tài)系統(tǒng)(毛潤乾等，2014)。還有研究表明昆蟲的視覺作用范圍十分有限，因此超過一定距離色板可能無法對(duì)該區(qū)域的木虱起到誘集效果。此外黃板誘集柑橘木虱的效果還受黃板的間距、高度和方向是否合適等因素的影響(趙政等，2018)。因此在田間使用黃板誘集柑橘木虱的效果并不理想。

植食性昆蟲可通過對(duì)植物揮發(fā)性氣體的辨別來對(duì)寄主植物進(jìn)行準(zhǔn)確的定向和定位。柑橘木虱具有發(fā)達(dá)的嗅覺系統(tǒng)，有研究表明柑橘木虱觸角上分布有多種嗅覺受體，可使柑橘木虱觸角嗅覺神經(jīng)元對(duì)月桂烯和丁酸乙酯等多種化合物產(chǎn)生強(qiáng)烈的電生理反應(yīng)(Coutinhoabreuetal.，2014)。通過對(duì)柑橘木虱具有引誘活性的化合物的篩選,從而開發(fā)針對(duì)柑橘木虱的植物源引誘劑已成為柑橘木虱防控的一個(gè)重要研究方向。已有研究結(jié)果顯示寄主植物嫩梢揮發(fā)物中幾種萜類物質(zhì)對(duì)柑橘木虱具有明顯的吸引作用(Pattt&Sétamou，2010)。還有研究者通過對(duì)九里香揮發(fā)物進(jìn)行分析研究，篩選出一種對(duì)柑橘木虱具有較強(qiáng)引誘效果的混劑(宋曉兵等，2019)。由于柑橘木虱專性取食蕓香科植物，又由于同科植物的親緣關(guān)系相近，所以推測蕓香科植物中所含的共同揮發(fā)物成分有可能對(duì)柑桔木虱具有引誘作用。本文對(duì)柑橘木虱寄主植物揮發(fā)物共同成分進(jìn)行分析并從中找出對(duì)柑橘木虱具有引誘活性的共同成分，旨在為柑橘木虱引誘劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試?yán)ハx及植物：柑橘木虱成蟲采自廣西桂林市臨桂區(qū)灌塘村5年生檸檬園，將蟲子從野外帶回在實(shí)驗(yàn)室半年生砂糖橘幼苗上進(jìn)行飼養(yǎng)。2 d后挑選健康的柑橘木虱進(jìn)行試驗(yàn)。供試植物九里香Murrayaexotica、HB柚Citusgrandis‘HB’、紅肉酸柚Citusgrandis‘Hongrousuan You’、沙田柚Citusmaxima‘Shatian You’、高斑柚Citusgrandis‘gaoban You’、紐荷爾臍橙Citussinensis‘Newhall’、香水檸檬Citruslimon‘Xiangshui’、酸橙Citrusaurantium、夏橙Citrussinensis、溫州蜜柑Citrusreticulata‘Unshiu’、貢柑Citrusreticulata‘gonggan’、沃柑Citrusreiculata‘Orah’嫩梢，均采自廣西特色作物研究院柑橘研究所柑橘種質(zhì)園。

標(biāo)準(zhǔn)品：96% α-石竹烯、98% (-)-β-石竹烯、96% 萜品油烯、97% 芳樟醇、99% α蒎烯、96 % 3-蒈烯，美國Sigma-Aldrich公司；99% D-檸檬烯、95% γ-松油烯，TCI公司；90% 液體石蠟油，希恩思公司。

儀器：自制Y型嗅覺儀，Y型管直臂長13 cm，兩側(cè)臂長8 cm,夾角75°，各臂內(nèi)徑均為1.5 cm。兩側(cè)臂末端分別連接一內(nèi)徑5 cm的陷阱球。Y型管兩測臂末端依次用Teflion(聚四氟乙烯)管連接流量計(jì)、500 mL味源瓶、250 mL空氣加濕瓶、1 L活性碳干燥塔以及吹氣泵，Y型嗅覺儀各器皿均由透明玻璃制成；Agilent 7890A-5975C氣-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)，Agilent公司；固相微萃取(SPME)手柄，Supleco公司；DVB/CAR/PDMS，50/30 μm SPME萃取頭，安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；ACO-001型電磁式吹氣泵，饒平縣興成機(jī)電水族用品有限公司。

1.2 方法

1.2.1柑橘木虱對(duì)12種寄主植物嫩梢趨性行為測定

參考吳國強(qiáng)等(2012)和唐良德等(2015)的方法并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)，利用Y型嗅覺儀測定柑橘木虱成蟲對(duì)12種寄主植物嫩梢的趨性。Y型管兩側(cè)臂空氣流速均控制在100 mL/min，試驗(yàn)溫度為25±2℃，試驗(yàn)時(shí)間為8 ∶30-19 ∶30，味源分別為九里香、紅肉酸柚、HB柚、沙田柚、高斑柚、紐荷爾臍橙、香水檸檬、酸橙、夏橙、溫州蜜柑、貢柑和沃柑的嫩梢。取100 g供試植物嫩梢置于味源瓶中，以潔凈的空氣作為對(duì)照。每次試驗(yàn)從Y型管直臂末端接入單頭柑橘木虱成蟲，雌雄隨機(jī)。當(dāng)試蟲接入Y型管后進(jìn)行計(jì)時(shí)，試蟲進(jìn)入陷阱球并在其中持續(xù)時(shí)間超過1 min，記為選擇；5 min內(nèi)未做出選擇的，記為無反應(yīng)。每試驗(yàn)5頭柑橘木虱后調(diào)換兩側(cè)臂的位置。每試驗(yàn)10頭柑橘木虱后用95%乙醇清洗Y型管并吹干待用，更換另一只干凈的Y型管繼續(xù)試驗(yàn)。每種嫩梢試驗(yàn)測試柑橘木虱成蟲20頭，每種處理重復(fù)3次。統(tǒng)計(jì)做出選擇的柑橘木虱成蟲蟲數(shù)計(jì)算選擇率，嫩梢選擇率(%)=對(duì)味源嫩梢做出選擇的柑橘木虱數(shù)量/有反應(yīng)的木虱數(shù)量×100，對(duì)照選擇率(%)=對(duì)對(duì)照做出選擇的柑橘木虱數(shù)量/有反應(yīng)的木虱數(shù)量×100。

1.2.26種柑橘木虱寄主植物嫩梢揮發(fā)物共同組分分析鑒定

選擇九里香、紐荷爾臍橙、HB柚、高斑柚、紅肉酸柚和沙田柚等6種對(duì)柑橘木虱具有較好引誘活性植物的嫩梢，利用SPME與GC-MS法對(duì)嫩梢揮發(fā)物共同組分進(jìn)行分析鑒定。取100 g潔凈的嫩梢于250 mL錐形瓶中并用錫箔紙覆蓋錐形瓶口，再用封口膠封住錫箔紙。將錐形瓶置于25±2℃的采樣室內(nèi)進(jìn)行氣味平衡30 min，然后采用SPME萃取頭頂空萃取2 h。萃取結(jié)束后立刻將萃取頭插入GC-MS進(jìn)樣口進(jìn)樣。GC色譜柱為HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為高純氦氣；載氣流速0.1 mL/min；進(jìn)樣口溫度為250℃；無分流進(jìn)樣；升溫程序?yàn)?0℃保持3 min，以3℃/min升至160℃保持2 min，然后以8℃/min升至220℃保持3 min。MS為EI源電離；電離能為70 eV；離子源溫度為230℃；四級(jí)桿溫度150℃；掃描范圍為50～550 amu。通過GC-MS機(jī)載(NIST08)譜庫檢索匹配分析組分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并參考結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)化合物進(jìn)行鑒定。采用歸一化法計(jì)算各組分相對(duì)含量。

1.2.3柑橘木虱對(duì)寄主植物嫩梢揮發(fā)物成分的趨性測定

利用Y型嗅覺儀測定柑橘木虱對(duì)8種寄主植物嫩梢共同組分的趨性。試驗(yàn)方法同1.2.1所述，不同的是將味源瓶中嫩梢改為由石蠟油稀釋成10、1、0.01、0.001 μL/mL的8種揮發(fā)物成分供試液，將20 μL供試液滴加至2.0 cm×1.5 cm的濾紙上置于味源瓶中作為味源，以20 μL石蠟油作為對(duì)照。每種處理試驗(yàn)測試柑橘木虱成蟲20頭，每種處理重復(fù)3次。統(tǒng)計(jì)做出選擇的柑橘木虱成蟲蟲數(shù)計(jì)算選擇率，選擇率(%)=對(duì)味源做出選擇的柑橘木虱數(shù)量/有反應(yīng)的木虱數(shù)量×100。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 19.0，采用t檢驗(yàn)法對(duì)選擇率進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析對(duì)柑橘木虱對(duì)不同揮發(fā)物標(biāo)準(zhǔn)品在不同濃度下的選擇率進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘木虱對(duì)12種寄主植物嫩梢的趨性反應(yīng)

利用Y型嗅覺儀測定柑橘木虱對(duì)12種植物嫩梢趨性反應(yīng)，結(jié)果如表1所示，柑橘木虱對(duì)九里香、沙田柚、紅肉酸柚、HB柚、高斑柚和紐荷爾臍橙嫩梢的選擇率分別為66.70%、66.04%、63.77%、63.86%、61.67%和60.35%，相對(duì)于對(duì)照選擇率差異極顯著(P<0.01)；對(duì)香水檸檬和沃柑嫩梢的選擇率為57.82%和58.60%，相對(duì)于對(duì)照選擇率差異顯著(P<0.05)；對(duì)酸橙、夏橙、溫州蜜柑和貢柑的選擇率分別為53.51%、55.46%、54.30%和55.37%，相對(duì)于對(duì)照選擇率差異不顯著(P<0.05)。以上結(jié)果顯示九里香、沙田柚、紅肉酸柚、HB柚、高斑柚和紐荷爾臍橙等6種植物嫩梢對(duì)柑橘木虱成蟲擁有較好的引誘活性，這也表明這6種植物嫩梢揮發(fā)物中可能存在對(duì)柑橘木虱具有較好引誘活性的物質(zhì)，所以選擇這6種植物的嫩梢進(jìn)行下一步揮發(fā)物成分分析試驗(yàn)。

表1 柑橘木虱對(duì)12種寄主植物嫩梢的選擇反應(yīng)

2.2 6種寄主植物嫩梢揮發(fā)物的共同組分

利用SPME與GC-MS聯(lián)用法分別對(duì)6種植物嫩梢揮發(fā)物成分進(jìn)行分析鑒定，從6種植物嫩梢揮發(fā)物中鑒定出醇類、脂類、烯烴類、酮類和醛類等5類物質(zhì)。其中共鑒定出8種嫩梢揮發(fā)物共同組分，分別為γ-松油烯、3-蒈烯、萜品油烯、(-)-β-石竹烯、a-石竹烯、(+)-α-蒎烯、D-檸檬烯和芳樟醇，以上8種物質(zhì)及其在6種植物嫩梢揮發(fā)物中的相對(duì)含量見表2。這幾種揮發(fā)物在不同植物嫩梢揮發(fā)物中的相對(duì)含量不盡相同，其中γ-松油烯在6種植物揮發(fā)物中相對(duì)含量為8.23%～35.80%，3-蒈烯的相對(duì)含量為4.13%～10.03%，萜品油烯的相對(duì)含量為1.25%～15.53%，(-)-β-石竹烯的相對(duì)含量為0.03%～5.22%，a-石竹烯的相對(duì)含量為0.60%～1.72%，(+)-α-蒎烯的相對(duì)含量為1.72%～13.89%，芳樟醇的相對(duì)含量為0.29%～2.64%，D-檸檬烯的相對(duì)含量為 2.18%～14.95%。這些揮發(fā)物共同組分在不同植物嫩梢揮發(fā)物中的相對(duì)含量不同可能與不同嫩梢所表現(xiàn)出的不同柑橘木虱引誘活性相聯(lián)系。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)筆者推測在這8種揮發(fā)物共同組分中可能存在對(duì)柑橘木虱成蟲具有引誘活性的物質(zhì)，遂購買這8種揮發(fā)物共同組分的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行柑橘木虱成蟲引誘試驗(yàn)。

表2 8種植物嫩梢揮發(fā)物共同組分相對(duì)含量

2.3 柑橘木虱對(duì)寄主植物嫩梢揮發(fā)物共同組分的趨性反應(yīng)

不同濃度的嫩梢揮發(fā)物標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)柑橘木虱成蟲的引誘活性試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可以看出8種嫩梢揮發(fā)物標(biāo)準(zhǔn)品在0.01、0.1、1和10 μL/mL 4個(gè)濃度下對(duì)柑橘木虱成蟲均有一定的引誘活性。其中柑橘木虱對(duì)(-)-β-石竹烯的選擇率隨人工合成單品濃度的增加而逐漸增大，在10 μL/mL濃度時(shí)對(duì)(-)-β-石竹烯選擇率最大達(dá)73.2%；柑橘木虱對(duì)芳樟醇的選擇率隨其濃度的增加先逐漸增大后降低,在1 μL/mL時(shí)達(dá)到最大值79.19%；柑橘木虱對(duì)γ-松油烯、3-蒈烯、萜品油烯、α-石竹烯、(+)-α-蒎烯以及D-檸檬烯純品的選擇率與純品濃度沒有明顯的相關(guān)性，在試驗(yàn)濃度下選擇率最高分別達(dá)到64.45%、65.64%、69.17%、60.17%、67.91、60.17%和71.88%。

表3 不同濃度揮發(fā)物純品對(duì)柑橘木虱成蟲的引誘活性

3 結(jié)論與討論

植食性昆蟲對(duì)寄主植物的選擇存在較大差異，王少麗等(2011)測定了朱砂葉螨Tetranychuscinnabarinus對(duì)不同蔬菜寄主的取食選擇性，發(fā)現(xiàn)朱砂葉螨最喜食菜豆，其次為茄子、番茄和黃瓜，相對(duì)不喜歡取食辣椒。植食性昆蟲對(duì)同種寄主植物的不同部位的喜愛也存在較大差異，魏智娟(2008)通過觀察對(duì)比假眼小綠葉蟬Empoascavitis對(duì)茶樹不同葉片的取食選擇性，發(fā)現(xiàn)假眼小綠葉蟬成蟲喜歡在茶樹第三葉到第六葉上取食，第三葉到第六葉的落蟲數(shù)與第一、第八葉落蟲數(shù)差異顯著。柑橘木虱對(duì)寄主植物不同部位的取食選擇也具有明顯的差異，相對(duì)于寄主植物的其他部位,其對(duì)寄主植物的嫩梢具有明顯的偏好性(許鑫，2018)。有研究發(fā)現(xiàn)柑橘木虱對(duì)柑橘屬植物以及九里香屬的九里香表現(xiàn)出明顯的偏愛(姚廷山等，2018)。植物釋放出的揮發(fā)性物質(zhì)是昆蟲對(duì)寄主選擇的重要刺激信號(hào)，馬鈴薯揮發(fā)性物質(zhì)中的反式-2-己烯醛和順式-3-乙酸葉醇脂等化合物可吸引馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata(Dickens，2001)。為明確柑橘木虱寄主植物揮發(fā)物對(duì)柑橘木虱的引誘作用，本試驗(yàn)選擇12種柑橘木虱寄主植物的嫩梢作為試驗(yàn)材料，通過生物測定發(fā)現(xiàn)柑橘木虱對(duì)不同寄主植物嫩梢表現(xiàn)出不同強(qiáng)度的趨向性，其對(duì)沙田柚、九里香、紐荷爾臍橙、HB柚、高斑柚、紅肉酸柚等6種植物嫩梢表現(xiàn)出較好的趨性。之后選擇以上6種對(duì)柑橘木虱具有較好引誘活性的寄主植物嫩梢為材料，利用SPME與GC-MS技術(shù)聯(lián)用對(duì)這6種嫩梢揮發(fā)物成分進(jìn)行提取、分離和鑒定以明確柑橘木虱寄主植物揮發(fā)物中共同組分，從中共鑒定出8種揮發(fā)物共同組分分別為γ-松油烯、3-蒈烯、萜品油烯、(-)-β-石竹烯、α-石竹烯、(+)-α-蒎烯、D-檸檬烯以及芳樟醇。有研究者從九里香、砂糖橘、沙田柚、尤力克檸檬、紅肉臍橙、沙田柚以及黃皮嫩梢揮發(fā)物中鑒定出α-石竹烯、(-)-β-石竹烯、β-羅勒烯和β-欖香烯等共4種共同組分(高傳賀，2016)，除α-石竹烯和(-)-β-石竹烯外本研究在九里香、HB柚、沙田柚和紅肉酸柚嫩梢揮發(fā)物中也鑒定出了β-羅勒烯，但未在紐荷爾臍橙和高斑柚嫩梢揮發(fā)物中鑒定出；在九里香、HB柚、高斑柚和沙田柚嫩梢揮發(fā)物中鑒定出β-欖香烯，但未在紐荷爾臍橙和紅肉酸柚嫩梢揮發(fā)物中鑒定出。還有研究結(jié)果顯示九里香和檸檬揮發(fā)物的主要成分是β-羅勒烯、芳樟醇、乙酸芳樟酯和(-)-β-石竹烯(Pattt&Sétamou，2010)，本研究也從九里香揮發(fā)物中鑒定到了以上4種揮發(fā)物成分。植物揮發(fā)物成分組成受生理因素的影響很大，在不同時(shí)間段存在較大差異。薛丹等(2012)對(duì)早、中和晚3個(gè)時(shí)間段的大梔花香氣成分進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)這3個(gè)時(shí)間段內(nèi)大梔花香氣成分的種類以及含量都存在較大差異。馬艷等(2019)對(duì)不同危害條件下山核桃CaryacathayensisSarg.揮發(fā)物進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)在不同星天牛危害下的山核桃揮發(fā)物存在差異，并且星天牛對(duì)不同危害下的山核桃揮發(fā)物的反應(yīng)也存在一定差異，對(duì)蒎烯、羅勒烯、對(duì)二乙苯、萜品烯、壬醛、α-萜品醇、五甲基苯、丙烯酸-2-乙基己酯、2,6-二甲基萘以及正十六烷10種揮發(fā)物產(chǎn)生顯著的觸角電位反應(yīng)，對(duì)其他揮發(fā)物成分無反應(yīng)。本研究對(duì)部分柑橘木虱寄主嫩梢揮發(fā)物的鑒定結(jié)果與前人試驗(yàn)結(jié)果存在一定差異，這些差異可能是由于試驗(yàn)時(shí)間以及試驗(yàn)材料的狀態(tài)差異造成的，但具體原因還需進(jìn)一步研究分析。

昆蟲對(duì)不同信息化合物有著不同的反應(yīng)閾值(Dickens，1984)，不同的揮發(fā)物氣味對(duì)柑橘木虱的影響在特定濃度下才能起到作用。有研究表明α-石竹烯和(-)-β-石竹烯分別在1和0.1、10 μL/mL 對(duì)柑橘木虱具有一定的引誘活性(高傳賀，2016)。本文通過測定柑橘木虱對(duì)8種揮發(fā)物標(biāo)準(zhǔn)品的趨性發(fā)現(xiàn)8種揮發(fā)物標(biāo)準(zhǔn)品在4個(gè)試驗(yàn)濃度下均對(duì)柑橘木虱具有一定的引誘活性，其中(-)-β-石竹烯、D-檸檬烯以及芳樟醇對(duì)柑橘木虱的引誘活性最好，(-)-β-石竹烯、D-檸檬烯在濃度為10 μL/mL時(shí)引誘率達(dá)到最高73.2%和71.88%，芳樟醇在濃度為1 μL/mL時(shí)引誘率引誘率達(dá)到79.19%。昆蟲對(duì)寄主植物的定位受寄主植物揮發(fā)物所調(diào)控，而寄主植物揮發(fā)物是由多個(gè)活性成分以特定比例混合而成的混合物(Nojimaetal.，2003；Bruceetal.，2005；Tasinetal.，2007)。有學(xué)者將萜品油烯、(+)-α-蒎烯和芳樟醇按照2 ∶ 8 ∶3 的比例進(jìn)行混配，得到一種柑橘木虱的引誘劑，其田間引誘木虱數(shù)量比液體石蠟油對(duì)照提高49.3倍(岑伊靜等，2014)。還有學(xué)者利用α-石竹烯、萜品油烯以及石油醚按照體積比3 ∶3 ∶4進(jìn)行混配，研發(fā)出了一種柑橘木虱引誘劑(王永模和劉慧，2013)。本研究結(jié)果表明γ-松油烯、3-蒈烯、萜品油烯、(-)-β-石竹烯、a-石竹烯、(+)-α-蒎烯、D-檸檬烯以及芳樟醇等8種物質(zhì)在不同濃度下對(duì)柑橘木虱均有一定的引誘活性，研究結(jié)果為進(jìn)一步混配篩選柑橘木虱高效引誘劑以及柑橘木虱綠色防控技術(shù)的研究提供了一定參考。