丹皮酚對馬鈴薯塊莖蛾雌蟲產(chǎn)卵選擇及幼蟲的忌避作用研究

吳 梅，韓 瑞，周 典，劉 燕，肖 春*

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，昆明 650201；2. 云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，昆明 650500)

馬鈴薯塊莖蛾P(guān)hthorimaeaoperculella(Zeller)為鱗翅目Lepidoptera麥蛾科Gelechiidae昆蟲，寡食性，主要為害馬鈴薯、煙草等茄科植物。該蟲害在世界各地蔓延迅速，在我國已由云南、貴州等西南地區(qū)向西北、華南擴(kuò)散，且有為害蔓延加重之勢，已成為馬鈴薯主要害蟲之一(陸慶光和曹驥, 1983; Trivedi and Rajagopal, 1992; 朱國慶等, 2003; Kwonetal., 2017;徐進(jìn)等, 2019)。馬鈴薯塊莖蛾的幼蟲在田間蛀食馬鈴薯新鮮植株而導(dǎo)致減產(chǎn)，或是在倉貯期蛀食馬鈴薯塊莖，導(dǎo)致馬鈴薯不能食用或無法銷售而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。馬鈴薯是主糧亦是蔬菜，在貯藏期間，安全、有效防治馬鈴薯塊莖蛾蟲害對保障馬鈴薯倉貯安全及食用安全十分重要(Upamanyaetal., 2014; Ibrahim, 2015)。

對蛾類害蟲綜合防治中的“Push-Pull”和“Attract-Kill”策略，是通過行為調(diào)控方式控制害蟲種群密度，以減輕害蟲的發(fā)生和為害，這是一種綠色、有效的害蟲防治方法(Cooketal., 2007; 陸宴輝等, 2008; Kroschel and Zegarra, 2013)。研究人員通過馬鈴薯塊莖蛾信息素，如性信息素、幼蟲蟲糞揮發(fā)物，或是從其寄主或非寄主揮發(fā)物中尋找具有顯著引誘或忌避作用的化學(xué)物質(zhì)，闡釋調(diào)節(jié)其行為的化學(xué)機(jī)制，以期運用于馬鈴薯塊莖蛾蟲害綜合防治中(Maetal., 2013, 2016; 王春婭等, 2018; Zhangetal., 2019; Lietal., 2020)。

牡丹皮是一味具有芳香氣味的常用中藥，來源于毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的干燥根皮(國家藥典委員會，2015)。牡丹皮在貯存過程中不會發(fā)生蟲蛀，人們還利用它來保護(hù)其它藥材，如與澤瀉分層存放，可使?jié)蔀a免受蟲害(王疏梅, 1998)。根據(jù)上述現(xiàn)象，推斷其揮發(fā)物中含有防蟲的活性成分，而丹皮酚是牡丹皮揮發(fā)物中的主要成分(武子敬和蘭蘭, 2011)。有關(guān)丹皮酚在害蟲防治領(lǐng)域的研究報道還很少，夏傳國等(1999, 2000)報道了丹皮酚對倉貯害蟲藥材甲StegobiumpaniceumL.具有熏蒸、觸殺及忌避作用；Xuetal. (2003)測試了丹皮酚對家蠅Muscadomestica的胃毒作用；Taketal. (2006)報道了丹皮酚有顯著的殺螨蟲作用。目前尚無丹皮酚對馬鈴薯塊莖蛾防治作用的相關(guān)報道。

本試驗通過研究丹皮酚對馬鈴薯塊莖蛾雌蟲產(chǎn)卵選擇及初孵幼蟲、老熟幼蟲的忌避作用，為其作為一種有潛力的植物源忌避劑用于馬鈴薯倉貯期馬鈴薯塊莖蛾蟲害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

馬鈴薯塊莖蛾室內(nèi)飼養(yǎng)方法參考劉燕等(2016)。成蟲放入養(yǎng)蟲盒中，喂以10%蜂蜜水，盒子頂端開口封24目紗網(wǎng)，上置濾紙，作為產(chǎn)卵場所并便于蟲卵的收集。待卵孵化后，將初孵幼蟲接種在新鮮馬鈴薯上(品種為“合作88”)，飼養(yǎng)密度為20頭/馬鈴薯(130±2 g)，將感染幼蟲的馬鈴薯放入事先鋪有細(xì)沙的養(yǎng)蟲籠中，老熟幼蟲會從馬鈴薯中爬出，鉆入沙中化蛹，直至成蟲羽化。養(yǎng)蟲室條件為：27±2℃，RH 50%～70%，L ∶D=14 ∶10。

1.2 實驗方法

1.2.1丹皮酚對馬鈴薯塊莖蛾雌蟲產(chǎn)卵選擇的影響

選擇性產(chǎn)卵實驗：參考Anforaetal. (2014)、馬艷粉等(2016)的方法，并作一些調(diào)整。取大小相近的馬鈴薯(90±10 g/個)備用。將丹皮酚(paeonol，>99%，武漢遠(yuǎn)程共創(chuàng)科技有限公司)溶解于丙酮中，稀釋成系列濃度(5、1、0.2、0.04或0.008 mg/mL)。吸取200 μL丹皮酚溶液滴于濾紙上，室溫?fù)]發(fā)5 min后，將濾紙放入裝有一個馬鈴薯的玻璃瓶(6 cm×10 cm)中；另一個裝有馬鈴薯的玻璃瓶中則放入只滴加溶劑的濾紙作為對照。玻璃瓶口覆上雙層紗布，作為馬鈴薯塊莖蛾的產(chǎn)卵場所，用塑料蓋蓋上并擰緊(蓋子事先沿邊緣0.5 cm處去掉頂面)，既可露出紗布，滿足瓶內(nèi)物質(zhì)的氣味通過紗布向外揮發(fā)，又可固定紗布。將瓶蓋外多余的紗布剪掉，用Parafilm封口。將兩個玻璃瓶沿對角線放入長方形容器(36 cm×28 cm×14 cm)中，接入8對已交配成蟲(1日齡)，喂以10%蜂蜜水，容器用紗網(wǎng)(24目)覆蓋。將容器放入暗室中(26±1℃，RH 50%～70%)，第3天在顯微鏡下統(tǒng)計紗布上的落卵量，計算選擇性產(chǎn)卵忌避指數(shù)。每個處理重復(fù)5次。

非選擇性產(chǎn)卵實驗：基本方法同上，在容器中放入2個裝有馬鈴薯以及滴有丹皮酚溶液濾紙的玻璃瓶，另一個容器中則放入2個裝有馬鈴薯以及僅滴有溶劑濾紙的玻璃瓶，作為對照。第 3天在顯微鏡下統(tǒng)計紗布上的落卵量，同時統(tǒng)計容器壁上的落卵量(吳梅等, 2017)，計算總落卵量及非選擇性產(chǎn)卵忌避率。每個處理重復(fù)5次。

1.2.2丹皮酚對馬鈴薯塊莖蛾初孵幼蟲的忌避作用

參考Wangetal. (2006)的方法，并有一些調(diào)整。將丹皮酚溶解于丙酮中，稀釋成系列濃度(5、1、0.2、0.04或0.008 mg/mL)。取一張濾紙(φ 7 cm)，用皮帶沖在其中心打下圓形濾紙片(φ 1 cm)，再將濾紙裁成兩半。將一半濾紙浸入丹皮酚溶液中，另一半則浸入丙酮溶液中作為對照，5 s后取出，室溫?fù)]發(fā)5 min后，將兩半濾紙用雙面膠帶重新粘合在一起，再將事先打下的圓形濾紙片(φ 1 cm)放回原位。將整張濾紙放在玻璃培養(yǎng)皿(φ 7 cm)中，用一圓環(huán)壓在濾紙邊緣，圓環(huán)底邊涂抹凡士林以防幼蟲爬出。將10頭初孵幼蟲(<6 h)接在中心圓形濾紙片上，放入暗室中(26±1℃，RH 50%～70%)，10 min后取出，記錄處理與對照濾紙上的幼蟲數(shù)。每個處理重復(fù)5次。

為測試丹皮酚對馬鈴薯塊莖蛾初孵幼蟲忌避作用的持續(xù)時間，根據(jù)上述實驗結(jié)果，選取5 mg/mL丹皮酚溶液作為測試濃度。取一張濾紙(φ 9 cm)，裁去中心直徑為6 cm的圓形，剩下部分浸入丹皮酚溶液中，5 s后取出，室溫?fù)]發(fā)5 min后，放在玻璃培養(yǎng)皿(φ 9 cm)中，再將一張空白濾紙(φ 7 cm)粘在上面。將10頭初孵幼蟲(<6 h)接在空白濾紙上，放入暗室中(26±1℃，RH 50%～70%)，每隔0.5 h記錄仍留在空白濾紙上的幼蟲數(shù),并清除已爬出空白濾紙的幼蟲，計算幼蟲忌避率。每個處理重復(fù)5次。

1.2.3丹皮酚對馬鈴薯塊莖蛾老熟幼蟲的忌避作用

老熟幼蟲從馬鈴薯中爬出后，喜歡鉆入沙中化蛹，篩取當(dāng)天爬出的老熟幼蟲備用。將丹皮酚溶解于丙酮中，稀釋成系列濃度(25、5、1、0.2或0.04 mg/mL)。取10 g細(xì)沙，滴加200 μL丹皮酚溶液，混勻，細(xì)沙中只滴加200 μL丙酮溶液作為對照，室溫?fù)]發(fā)10 min，將處理組和對照組細(xì)沙分別鋪在長方形容器(16 cm×11 cm×5.5 cm)的兩側(cè)，兩側(cè)細(xì)沙相距8 cm。具容器底面高1 cm處放一具網(wǎng)孔的塑料板(2 mm)，塑料板中央放一內(nèi)壁光滑的塑料圓環(huán)(2 cm×2 cm)，將10頭老熟幼蟲接在圓環(huán)中，老熟幼蟲自行從孔中鉆入到容器底部，尋找合適場所化蛹。容器用保鮮膜封口，并用昆蟲針在保鮮膜上均勻戳孔。將容器放入暗室中(26±1℃，RH 50%～70%)，24 h后取出，記錄兩側(cè)沙中幼蟲及蛹的數(shù)量，處于空白地帶的幼蟲或蛹視為無效。每個處理重復(fù)5次。

1.2.4模擬倉貯實驗

模擬倉貯實驗參考Anforaetal. (2014)的方法，并有一些調(diào)整。實驗在體積為7.5 m3的房間(長×寬×高=2.1 m×1.7 m×2.1 m)中進(jìn)行，條件為：26±1℃，RH 50%～70%，L ∶D=14 ∶10。實驗開始前，整個房間經(jīng)過清洗并通風(fēng)1周，將通風(fēng)口及門封以防蟲紗網(wǎng)。房間中放3個木箱(32 cm×32 cm×32 cm)，呈三角形擺放，相距約1 m。在一鐵絲網(wǎng)中央及四角分別懸掛一張濾紙，將1 g丹皮酚溶解在丙酮中，平均滴加在濾紙上，室溫下?lián)]發(fā)5 min后，將鐵絲網(wǎng)架在木箱中，濾紙在鐵絲網(wǎng)下面，距箱底約5 cm。另一個房間同樣擺放3個架有鐵絲網(wǎng)的木箱，濾紙上僅滴加溶劑作為對照。將18 kg健康馬鈴薯(90±10 g/個)平均分成6份，分別放在上述6個木箱中的鐵絲網(wǎng)上，每箱約3 kg馬鈴薯(33個)。往房間中接入25對已交配成蟲(1日齡)，將門關(guān)緊，15 d后檢查馬鈴薯被馬鈴薯塊莖蛾幼蟲侵染情況，計算馬鈴薯受損率。

1.3 統(tǒng)計分析

選擇性產(chǎn)卵忌避指數(shù)(oviposition deterrent index,ODI)按下列公式計算(Sinthusiri and Soonwera, 2014)：

ODI=落卵量(處理-對照)/落卵量(處理+對照)。ODI范圍是-1.0～+1.0，若ODI≤-0.3，表明具有產(chǎn)卵忌避作用，ODI≥+0.3，表明具有產(chǎn)卵引誘作用，ODI=-0.3～+0.3，表明對產(chǎn)卵無影響。

非選擇性產(chǎn)卵實驗及模擬倉貯實驗采用獨立樣本t檢驗分析處理與對照組間的顯著性差異。非選擇性產(chǎn)卵忌避率按下列公式計算(呂朝軍等，2015)：非選擇性產(chǎn)卵忌避率(%)=落卵量(處理-對照)/落卵量(對照)×100。馬鈴薯受損率按下列公式計算(Anforaetal., 2014)：

馬鈴薯受損率(%)=被幼蟲侵染的馬鈴薯個數(shù)/馬鈴薯總個數(shù)×100。

采用χ2檢驗分析丹皮酚對馬鈴薯塊莖蛾初孵幼蟲及老熟幼蟲行為影響實驗中處理與對照組間的顯著性差異(Wangetal., 2006)。幼蟲忌避率按下列公式計算：

幼蟲忌避率(%)=空白濾紙上的幼蟲數(shù)/總蟲量×100。

以上數(shù)據(jù)均使用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 丹皮酚對馬鈴薯塊莖蛾雌蟲產(chǎn)卵選擇的影響

丹皮酚對馬鈴薯塊莖蛾雌蟲有顯著產(chǎn)卵忌避作用。在選擇性產(chǎn)卵實驗中，5 mg/mL丹皮酚溶液對馬鈴薯塊莖蛾的產(chǎn)卵忌避指數(shù)為-0.63，有顯著產(chǎn)卵忌避作用；當(dāng)濃度降低至1 mg/mL以下，對馬鈴薯塊莖蛾的產(chǎn)卵選擇無影響。在非選擇性產(chǎn)卵忌避實驗中，5 mg/mL丹皮酚溶液處理與對照紗布上的落卵量有極顯著差異(t=11.2,P<0.01)；1 mg/mL濃度下，處理與對照紗布上的落卵量仍有極顯著差異(t=4.8,P<0.01)；產(chǎn)卵忌避率分別為-89.0%和-46.6%。5 mg/mL丹皮酚溶液處理與對照間總落卵量有極顯著差異(t=4.7,P<0.01)，表明丹皮酚對馬鈴薯塊莖蛾產(chǎn)卵有抑制作用。(表1、表2)。

表1 選擇性產(chǎn)卵實驗中丹皮酚對馬鈴薯塊莖蛾雌蟲產(chǎn)卵行為的影響Table 1 Dual-choice oviposition deterrent of paeonol on Phthorimaea operculella

表2 非選擇性產(chǎn)卵實驗中丹皮酚對馬鈴薯塊莖蛾雌蟲產(chǎn)卵行為的影響Table 2 No-choice oviposition deterrent of paeonol on Phthorimaea operculella

2.2 丹皮酚對馬鈴薯塊莖蛾初孵幼蟲的忌避作用

丹皮酚對馬鈴薯塊莖蛾初孵幼蟲有顯著忌避作用。5 mg/mL丹皮酚溶液對馬鈴薯塊莖蛾初孵幼蟲有極顯著忌避作用(χ2=45.3，P<0.01)；濃度降低至1 mg/mL時，仍保持極顯著忌避作用(χ2=34.4，P<0.01)；濃度降低至0.2 mg/mL以下，處理與對照之間未顯示出顯著差異。5 mg/mL丹皮酚溶液對馬鈴薯塊莖蛾初孵幼蟲的忌避作用在0.5 h內(nèi)可保持100%的忌避率，至1 h，忌避率降低至85%左右，之后忌避作用快速降低，1.5 h時忌避率已降低至50%以下。

圖1 丹皮酚對馬鈴薯塊莖蛾初孵幼蟲的忌避作用Fig.1 Deterrent effect of paeonol on neogenetic larvae Phthorimaea operculella注：**表示處理與對照之間差異極顯著P<0.01(χ2檢驗)。Note：** indicated significantly different at 0.01 level(P<0.01)between treatment and control(χ2 test).

圖2 丹皮酚對馬鈴薯塊莖蛾初孵幼蟲的忌避時長Fig.2 Deterrent duration of paeonol on neogenetic larvae Phthorimaea operculella

2.3 丹皮酚對馬鈴薯塊莖蛾老熟幼蟲的忌避作用

丹皮酚對馬鈴薯塊莖蛾老熟幼蟲有顯著忌避作用。丹皮酚 ∶沙(1 mg ∶2 g)濃度下，處理與對照之間有顯著差異(χ2=12.8，P<0.05)。濃度降低至丹皮酚 ∶沙(1 mg ∶10 g)以下，處理與對照之間未顯示出顯著差異。(圖3)。

圖3 丹皮酚對馬鈴薯塊莖蛾老熟幼蟲的忌避作用Fig.3 Deterrent effect of paeonol on mature larvae Phthorimaea operculella注：*表示處理與對照之間差異顯著P<0.05(χ2檢驗)。Note：* indicated significantly different at 0.05 level(P<0.05)between treatment and control(χ2 test).

2.4 模擬倉貯實驗

對照組馬鈴薯的受損率為80.8%，而處理組為23.2%，兩者具有極顯著差異(t=12.7; df=4;P<0.01)，丹皮酚可有效保護(hù)馬鈴薯免受馬鈴薯塊莖蛾為害(圖4)。

圖4 模擬倉貯實驗馬鈴薯受損率Fig.4 Percentage of potato tubers damaged by Phthorimaea operculella in the warehouse experiment注：**表示處理與對照之間差異極顯著P<0.01(t檢驗)。Note：** indicated significantly different at 0.01 level(P<0.01)between treatment and control(t test).

3 結(jié)論與討論

植物在與植食性昆蟲長期共同進(jìn)化過程中，形成了以次生代謝產(chǎn)物為主的化學(xué)防御體系，其中植物揮發(fā)性成分是該體系重要的組成之一(Rajendran and Sriranjini, 2008; Campoloetal., 2018)。非寄主植物釋放的揮發(fā)性物質(zhì)往往含有忌避或干擾昆蟲行為的化學(xué)物質(zhì)，即使是能被昆蟲識別并準(zhǔn)確定位的寄主植物揮發(fā)物中也可能含有此類物質(zhì)(Anforaetal., 2014)。馬鈴薯塊莖蛾雌蟲選擇產(chǎn)卵場所時能根據(jù)寄主揮發(fā)物區(qū)分完整馬鈴薯和機(jī)械損傷的馬鈴薯，雌蟲選擇將卵直接產(chǎn)在完整馬鈴薯上，更有利于幼蟲的取食和生存(Arabetal., 2007)。本研究利用紗布作為馬鈴薯塊莖蛾雌蟲產(chǎn)卵的場所，消除了觸覺、視覺等的干擾因素，測試了丹皮酚蒸汽對其產(chǎn)卵選擇的影響，結(jié)果表明，丹皮酚對馬鈴薯塊莖蛾產(chǎn)卵有顯著忌避作用，而且高濃度丹皮酚對雌蟲產(chǎn)卵有抑制作用，這意味著丹皮酚會干擾馬鈴薯塊莖蛾對產(chǎn)卵場所的選擇，減少直接產(chǎn)在寄主馬鈴薯上的卵量，同時減少總產(chǎn)卵量。馬鈴薯塊莖蛾在倉庫環(huán)境下一年可發(fā)生多個世代，存在不同蟲態(tài)交疊的情況，故本研究同時考察了丹皮酚對馬鈴薯塊莖蛾初孵幼蟲及老熟幼蟲的忌避作用，結(jié)果表明丹皮酚對上述兩種蟲態(tài)均有顯著忌避作用。模擬倉貯實驗驗證了丹皮酚對馬鈴薯的保護(hù)作用，結(jié)果表明在丹皮酚蒸汽的保護(hù)下，馬鈴薯的受損率由80.8%降低至23.2%。

應(yīng)用“Push-Pull”策略防治馬鈴薯塊莖蛾蟲害，需要“忌避劑”與“引誘劑”的配合才能更好的發(fā)揮防治作用，丹皮酚與已知“引誘劑”的組合研究尚未開展；此外，丹皮酚的忌避作用與其濃度直接相關(guān)，植物揮發(fā)物具有對哺乳動物毒性低、易降解、殘留低等優(yōu)點，但其應(yīng)用受到沸點高、蒸氣壓低等物理性質(zhì)的限制(Rajendran and Sriranjini, 2008)，如何保持丹皮酚有效的熏蒸濃度及忌避時長？該問題的解決還需今后開展其制劑相關(guān)研究。

丹皮酚對馬鈴薯塊莖蛾雌蟲產(chǎn)卵選擇及幼蟲均具有顯著忌避作用，是馬鈴薯倉貯期馬鈴薯塊莖蛾蟲害防治的又一有潛力的植物源忌避劑，進(jìn)一步拓寬了丹皮酚在蟲害防治領(lǐng)域的應(yīng)用。