美洲大蠊腸道內(nèi)生放線(xiàn)菌抗金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌活性分析

蔣詩(shī)林，葉宇歆，沈 娟，朱家勇，金小寶

(廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006)

金黃色葡萄球菌危害著人們的生命健康，是一種常見(jiàn)人體致病菌，可導(dǎo)致心內(nèi)膜炎、皮膚以及軟組織感染等諸多疾病。由于抗生素的濫用引起耐藥菌的出現(xiàn)(畢振飛等，2015)，其中就包含有對(duì)甲氧西林產(chǎn)生耐藥的金黃色葡萄球菌，在臨床上的檢出率較高，其引起的嚴(yán)重感染，是臨床治療的難點(diǎn)之一(劉曉瑜等，2015)，這兩種病原菌引起的疾病是人們急需解決的健康問(wèn)題。

美洲大蠊是自然環(huán)境中的一種古老的昆蟲(chóng)，是傳統(tǒng)的昆蟲(chóng)類(lèi)中藥材(高潔等，2018)，其長(zhǎng)期生存在遍布病原微生物的垃圾堆和污水池等惡劣環(huán)境中，有很強(qiáng)的生存和抗疾病能力(徐毅，2015；Adenusietal.，2018)，文獻(xiàn)報(bào)道其腸道內(nèi)生活著大量的共生微生物(陳啟亮等，2015)，其抗病能力可能與腸道內(nèi)的共生菌群相關(guān)聯(lián)。放線(xiàn)菌廣泛存在于自然界中，有研究表明其能產(chǎn)生多種抗菌次級(jí)代謝產(chǎn)物，以往的研究往往針對(duì)土壤環(huán)境中的放線(xiàn)菌，分離得到新型化合物的幾率逐年降低(胡松英等，2011)，因此尋找新的特境放線(xiàn)菌資源更具有研究?jī)r(jià)值。本課題組已從美洲大蠊腸道分離得到159株內(nèi)生放線(xiàn)菌(方霞等，2016)，本文將金黃色葡萄球菌和MRSA等兩種人體常見(jiàn)致病菌作為指示菌，利用瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)這159株腸道內(nèi)生放線(xiàn)菌是否具有體外抗菌活性，隨后用分子生物學(xué)方法對(duì)目標(biāo)放線(xiàn)菌進(jìn)行分類(lèi)鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1放線(xiàn)菌庫(kù)和指示病原菌

本研究159株放線(xiàn)菌從美洲大蠊腸道分離得到(方霞等，2016)，置于-80℃存于無(wú)菌甘油密閉保存。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC25923)和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus，ATCC25213)采購(gòu)自廣東省微生物研究所。

1.1.2培養(yǎng)基

菌株采用高氏合成Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)進(jìn)行劃線(xiàn)分離，分離培養(yǎng)基中加入了65 μg/mL的重鉻酸鉀防止其他細(xì)菌的干擾；將菌株接種到高氏合成Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基進(jìn)行純化，并將純化過(guò)的放線(xiàn)菌置于高氏合成Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基上保存；種子培養(yǎng)基：酵母提取物2 g，胰蛋白胨12 g，葡萄糖10 g，無(wú)菌水1 000 mL，pH 7.2～7.4；采用鏈霉菌培養(yǎng)基2號(hào)(ISP-2)用于發(fā)酵培養(yǎng)，ISP-2：葡萄糖4 g，麥芽提取物10 g，酵母提取物4 g，無(wú)菌水1 000 mL，pH7.2～7.4；LB液體培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，NaCl 10 g，胰蛋白胨10 g，無(wú)菌水1 000 mL；LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加入20 g的瓊脂。

1.1.3主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)；Taq PCR Master mix、DNA Marker(日本TaKaRa公司)。臺(tái)式高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；GelDoc凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1美洲大蠊腸道159株內(nèi)生放線(xiàn)菌的抗金黃色葡萄球菌和MRSA活性的測(cè)定

用接種環(huán)將159株放線(xiàn)菌在高氏一號(hào)平板上劃線(xiàn)，將平板培養(yǎng)7 d，依次挑取各單菌落，將菌落接種到100 mL的種子培養(yǎng)基中，置于28℃恒溫?fù)u床中，以180 r/min搖瓶培養(yǎng)2 d，然后將菌株的種子液以5%的接種量轉(zhuǎn)接到ISP-2中，發(fā)酵培養(yǎng)條件為180 r/min、28℃搖瓶發(fā)酵7 d，待菌株發(fā)酵完成，將菌株發(fā)酵液以4 000 r/min離心30 min，棄菌絲體，收集發(fā)酵液上清液用于后期實(shí)驗(yàn)(陳雨晴等，2014)。運(yùn)用瓊脂擴(kuò)散法中的牛津杯法(佘之蘊(yùn)等，2016)測(cè)定各菌株發(fā)酵液抗金黃色葡萄球菌和MRSA活性：將金黃色葡萄球菌和MRSA分別接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫?fù)u床中，以180 r/min振蕩培養(yǎng)6～8 h，各取150 μL菌液加入100 mL LB培養(yǎng)基，混合均勻后倒板。將培養(yǎng)基置于室溫中冷卻，隨后將牛津杯平穩(wěn)地放置在平板上，各牛津杯孔中依次添加200 μL收集來(lái)的各菌株的發(fā)酵液上清液，吸取等體積的液體空白培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，分別以50 μL 64 μg/mL的氨芐青霉素鈉和50 μL 256 μg/mL的鹽酸萬(wàn)古霉素作為陽(yáng)性對(duì)照。將平板置于37℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)，觀察是否出現(xiàn)抑菌圈(梁大敏等，2019)，并用直尺測(cè)量抑菌圈的直徑。

1.2.2細(xì)菌16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

選擇具有抗金黃色葡萄球菌和MRSA活性的放線(xiàn)菌，依次提取各放線(xiàn)菌的基因組DNA，用通用保守引物27f和1492r對(duì)目標(biāo)菌株的16S rRNA基因擴(kuò)增，通用引物(Passarietal.，2015)(27f為AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492r為T(mén)ACGGC TACCTTGTTACGA CTT)由上海英濰捷基公司設(shè)計(jì)完成。50 μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：Taq PCR Master mix 25 μL，上游、下游引物各2.5 μL，模板DNA 2.0 μL，高壓滅菌ddH2O 18 μL，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組(模板DNA用無(wú)菌ddH2O代替)，上述過(guò)程均確保在無(wú)菌環(huán)境下操作。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃ 4 min；94℃ 30 s，57℃ 70 s，72℃ 30 s，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，將擴(kuò)增產(chǎn)物放置4℃保存。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，委托上海生物工程有限公司進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的基因測(cè)序。

1.2.3菌株16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析以及BLAST同源性比對(duì)

將測(cè)序所得序列輸入NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，將各菌株序列進(jìn)行BLAST同源性對(duì)比，獲得同源性較高的菌株，隨后選用MEGA 5.0(Tamuraetal.，2011)軟件中的Neighbor Joining進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析(Scholz，2016)，自展檢驗(yàn)(bootstrap)重復(fù)抽樣1 000次，以評(píng)估系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，發(fā)育樹(shù)各節(jié)點(diǎn)數(shù)值代表自展的重復(fù)比例。

1.2.4菌株抗生素合成關(guān)鍵酶基因和鹵化酶基因的鑒定

參考Izumikawa等(Izumikawaetal.，2003；Hornungetal.，2007；王海強(qiáng)等，2017)的方法，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索Helogebase、非核糖體多肽合成酶和多聚酮合酶的相關(guān)氨基酸序列，利用Clustal W軟件對(duì)其進(jìn)行對(duì)比后，使用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，隨后用DNAman軟件對(duì)引物進(jìn)行功能評(píng)估，獲得2個(gè)關(guān)鍵次級(jí)代謝生物合成基因NRPS (A3F:GCSTACSYSATSTACACSTCSGG;A7R:SASGTCVCCSGTSCGGTAS)、PKS I(K1F: TSAA GTCSAACATCGGBCA;M6R:CGCAGGTTSCSGTA CCAGTA)和鹵化酶基因FADH2(Halo-B4-FW:TTCCCSCGSTACCASATCGGSGAG; Halo-B4-RV: GS GGGATSWMCCAGWACCAS CC)的PCR擴(kuò)增引物序列。根據(jù)Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)方法，依次提取各放線(xiàn)菌的基因組DNA，并分別對(duì)2個(gè)關(guān)鍵合成酶基因和鹵化酶基因FADH2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)金黃色葡萄球菌和MRSA有拮抗作用的放線(xiàn)菌的篩選結(jié)果

159株放線(xiàn)菌中有49株放線(xiàn)菌能夠抑制金黃色葡萄球菌和MRSA的活性，49株放線(xiàn)菌中鏈霉菌屬有36株，占73.47%，為優(yōu)勢(shì)菌屬；其余13株放線(xiàn)菌隸屬于6個(gè)菌屬，分別為戈登氏菌屬、微桿菌屬、短狀桿菌、分枝桿菌、無(wú)色桿菌屬和小單孢菌屬。其中，能夠抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的內(nèi)生放線(xiàn)菌有44株，能夠抑制MRSA生長(zhǎng)的為16株。有11株內(nèi)生放線(xiàn)菌對(duì)兩種細(xì)菌均有拮抗作用，分別是WA4-31、WA12-1-1、WA5-4-31、WA22-1-2、WA2-34、WA22-2-1、WA23-2-1、WA12-1-21、WA12-1-25、WA20-4-6、WA23-1-4，測(cè)量11株放線(xiàn)菌的抑菌圈直徑，對(duì)金黃色葡萄球菌和MRSA抑制作用最強(qiáng)的分別為WA12-1-1(15.63±0.57 mm)和WA22-1-2(15.23±0.21 mm)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2、表1和表2。

圖1 美洲大蠊部分腸道內(nèi)生放線(xiàn)菌在高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基上的形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 Morphological observation of some endophytic actinomycetes of Periplaneta americana on Gaoshi I Medium注：A～H分別為菌株WA23-2-1、WA22-1-2、WA12-1-21、WA2-7、WA22-2-1、WA5-2-37、WA5-4-31、WA5-1-29。Note:A～H were strains WA23-2-1、WA22-1-2、WA12-1-21、WA2-7、WA22-2-1、WA5-2-37、WA5-4-31、WA5-1-29.

圖2 美洲大蠊部分腸道內(nèi)生放線(xiàn)菌體外抗金黃色葡萄球菌和MRSA活性篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Screening results of in vitro anti-Staphylococcus aureus and MRSA activity of some endophytic actinomyc-tesfrom the guts of Periplaneta americana注：A，1～4分別為5-2-24、22-1-2、5-2-37、23-2-1發(fā)酵液上清液對(duì)金黃色葡萄球菌的作用結(jié)果，空白為空白對(duì)照(等量液體空白發(fā)酵液)，陽(yáng)為陽(yáng)性對(duì)照(50 μL 64 μg/mL的氨芐青霉素鈉); B，1～4分別為5-4-31、5-1-7、10-1-6、5-2-40發(fā)酵液上清液對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的作用結(jié)果，空白為空白對(duì)照(等量液體空白發(fā)酵液)，陽(yáng)為陽(yáng)性對(duì)照(50 μL 256 μg/mL的鹽酸萬(wàn)古霉素)。Note: A，1～4 were the effects of 5-2-24，22-1-2，5-2-37，23-2-1 fermentation broth supernatant on S.aureus，blank is blank Control (equal liquid blank fermentation broth)，positive as positive control (50 μL of 64 μg/mL ampicillin sodium); B，1～4 were the effects of 5-4-31，5-1-7，10-1-6，5-2-40 fermentation broth supernatant on Methicillin-resistant S.aureus(MRSA)，blank is blank Control (equal liquid blank fermentation broth)，positive as positive control(50 μL of 256 μg/mL vancomycin hydrochloride).

表1 具有抗金黃色葡萄球菌和MRSA活性的49株美洲大蠊腸道內(nèi)生放線(xiàn)菌的抗菌情況

表2 11株具有抗金黃色葡萄球菌和MRSA活性放線(xiàn)菌的抑菌圈結(jié)果

2.2 11株放線(xiàn)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建、BLAST同源性對(duì)比和分子生物學(xué)鑒定

將對(duì)金黃色葡萄球菌和MRSA具有抑制作用的菌株16S rRNA基因序列輸入NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，運(yùn)用BLAST程序進(jìn)行同源性對(duì)比，11株菌分別屬于戈登氏菌屬、微桿菌屬、無(wú)色桿菌屬和鏈霉菌屬。選取親緣性最高的菌株序列，利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果見(jiàn)圖3，進(jìn)一步驗(yàn)證WA4-31為戈登氏菌，WA12-1-21、WA12-1-25為微桿菌，WA5-4-31為無(wú)色桿菌，WA22-1-2、WA2-34、WA22-2-1、WA20-4-6、WA12-1-1、WA23-1-4、WA23-2-1為鏈霉菌，且分別與土壤中的戈登氏菌屬、微桿菌屬、無(wú)色桿菌屬和鏈霉菌屬親緣關(guān)系較近。

圖3 抑制兩種細(xì)菌生長(zhǎng)的11株內(nèi)生放線(xiàn)菌的16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 16S rRNA gene sequence phylogenetic tree analysis of the 11 strains of Actinomycetes with anti-Staphylococcus aureus and MRSA activity

2.3 11株放線(xiàn)菌部分抗生素合成關(guān)鍵酶基因的篩選結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示(表3)，有9株放線(xiàn)菌檢測(cè)到鹵化酶基因FADH2(約700 bp)，有7株放線(xiàn)菌檢測(cè)到兩種關(guān)鍵酶基因NRPS(約900 bp)和PKS I(約750 bp)中的一種或兩種。另外WA2-34、WA12-1-1、WA12-1-21、WA20-4-6、WA22-1-2、WA22-2-1均檢測(cè)到兩種關(guān)鍵酶基因和鹵化酶基因FADH2。

表3 11株具有抗金黃色葡萄球菌和MRSA活性菌株部分抗生素合成關(guān)鍵酶基因的篩選結(jié)果

3 結(jié)論與討論

金黃色葡萄球菌可造成普遍的臨床感染，它是感染性心內(nèi)膜炎和菌血癥以及骨關(guān)節(jié)，皮膚和軟組織等相關(guān)感染的主要病因(Tongetal.，2015)。由于臨床上抗生素使用的不合理性，導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性問(wèn)題愈發(fā)緊迫(趙艷坤等，2018)。MRSA引起的健康問(wèn)題愈發(fā)嚴(yán)重，與越來(lái)越多的感染相關(guān)，影響了全球人類(lèi)的健康，且通常具有多重耐藥。在臨床實(shí)踐中，MRSA構(gòu)成了主要威脅，顯著增加了感染發(fā)病率，死亡率和整體醫(yī)療費(fèi)用(Bassettietal.，2019；Emeka-Nwabunniaetal.，2019)，因此迫切需要開(kāi)發(fā)新型廣譜抗生素來(lái)對(duì)抗頻繁出現(xiàn)的多重耐藥病原體(Senguptaetal.，2015)。昆蟲(chóng)與微生物之間的共生相互作用是自然界中廣泛存在的，微生物共生體能夠產(chǎn)生具有抗菌活性的物質(zhì)，為宿主提供化學(xué)防御，用以抵抗病原體(Aileenetal.，2016；Arangoetal.，2016)。美洲大蠊是已知的最古老的有翅昆蟲(chóng)之一，具有很強(qiáng)的適應(yīng)各種復(fù)雜環(huán)境的能力(Zhangetal.，2016)，由于其生長(zhǎng)環(huán)境的特殊性，其腸道內(nèi)共生菌可能產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)幫助其增強(qiáng)對(duì)有害病原菌的抵抗力。

在生物活性物質(zhì)的天然生產(chǎn)者中，放線(xiàn)菌是藥物應(yīng)用中新的抗生素的主要來(lái)源(Jakubiec-Krzesniaketal.，2018)，尤其是放線(xiàn)菌中的鏈霉菌屬，提供了在現(xiàn)在臨床中使用的60%以上的抗生素(Esnaultetal.，2017)。本研究前期從美洲大蠊腸道分離獲得159株內(nèi)生放線(xiàn)菌，本研究在此基礎(chǔ)上對(duì)上述菌株的抗金黃色葡萄球菌和MRSA活性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示30.82%(49株)的內(nèi)生放線(xiàn)菌對(duì)金黃色葡萄球菌和MRSA表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，這49株放線(xiàn)菌包含有鏈霉菌屬、戈登氏菌屬、微桿菌屬、短狀桿菌屬、分枝桿菌屬、無(wú)色桿菌屬和小單孢菌屬，其中 WA4-31、WA22-1-2、WA2-34、WA22-2-1、WA23-2-1、WA12-1-21、WA5-4-31、WA12-1-25、WA20-4-6、WA12-1-1、WA23-1-4等11株美洲大蠊腸道共生放線(xiàn)菌對(duì)兩種細(xì)菌均有抗菌活性。推測(cè)這些放線(xiàn)菌中有可能產(chǎn)生具有抗金黃色葡萄球菌和MRSA活性的新的天然產(chǎn)物，尤其是對(duì)兩株病菌均具有抗性的放線(xiàn)菌。許多具有重要藥用研究?jī)r(jià)值的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成往往需要通過(guò)非核糖體多肽合成酶和聚酮合酶共同參與形成結(jié)構(gòu)模塊，隨后通過(guò)FADH2-依賴(lài)性鹵化酶催化，從而形成具有抑菌活性的代謝產(chǎn)物(Neumannetal.，2008；薛永常等，2014；滕安然等，2019)。具有多種抗菌活性的放線(xiàn)菌具有很高的研究?jī)r(jià)值，值得優(yōu)先研究，因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)11株放線(xiàn)菌的關(guān)鍵酶基因PKS I、NRPS和FADH2-依賴(lài)性鹵化酶基因進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)WA2-34、WA12-1-1、WA12-1-21、WA20-4-6、WA22-1-2、WA22-2-1均檢測(cè)到兩種關(guān)鍵酶基因和鹵化酶基因FADH2，說(shuō)明這6株放線(xiàn)菌有分泌聚酮類(lèi)和非核糖體肽類(lèi)化合物的潛力。現(xiàn)在已知的抗生素大部分產(chǎn)自鏈霉菌，但隨著研究的深入，從鏈霉菌中分出新型抗生素的幾率越來(lái)越少(袁麗杰等，2012)。戈登氏菌屬、微桿菌屬、短狀桿菌屬、分枝桿菌屬、無(wú)色桿菌屬和小單孢菌屬是放線(xiàn)菌中的稀有菌屬，針對(duì)這類(lèi)菌群的抗菌活性的研究較少。例如有關(guān)戈登氏菌屬的研究多與其生物降解能力相關(guān)(Liu Netal.，2020)，鮮有研究其發(fā)酵產(chǎn)物的抗金黃色葡萄球菌和MRSA的作用，而且這4株稀有放線(xiàn)菌中的WA5-4-31和WA12-1-25對(duì)MRSA和金黃色葡萄球菌均有較強(qiáng)的抗菌活性。因此研究11株放線(xiàn)菌中的稀有菌屬，有可能分出具有抗金黃色葡萄球菌和MRSA活性的新穎的化合物。下一步實(shí)驗(yàn)擬重點(diǎn)對(duì)這11株放線(xiàn)菌中的4株稀有菌屬進(jìn)行研究，運(yùn)用硅膠柱層析、半制備高效液相、核磁共振、質(zhì)譜等現(xiàn)代波譜技術(shù)對(duì)這些放線(xiàn)菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析研究，以期獲得具有良好的抗金黃色葡萄球菌和MRSA活性的新天然產(chǎn)物。

本研究在對(duì)159株美洲大蠊腸道內(nèi)生放線(xiàn)菌的研究中發(fā)現(xiàn)30.82%放線(xiàn)菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌和MRSA可產(chǎn)生不同程度的拮抗作用，其中有22.45%(11株)放線(xiàn)菌對(duì)2種指示病原菌均有不同程度的抑制作用，且11株放線(xiàn)菌中有4株放線(xiàn)菌為稀有菌屬，揭示了美洲大蠊腸道內(nèi)生放線(xiàn)菌具有產(chǎn)生活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的潛力。