核型多角體病毒侵染及其與宿主免疫系統(tǒng)互作的研究進(jìn)展

黃 博，朱夢(mèng)瑤，丘霈珊，張若男，張文慶，余小強(qiáng)，盧玉珍*

(1. 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省昆蟲發(fā)育生物學(xué)與應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510631；2. 中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510275；3. 華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430079)

桿狀病毒(baculovirus)是具有囊膜包裹的雙鏈環(huán)狀DNA病毒，基因組大小為80～180 kb，只專一性感染昆蟲，主要以鱗翅目、雙翅目和膜翅目昆蟲為宿主(Langeetal., 2004；Harrisonetal., 2018)。桿狀病毒包括核型多角體病毒(nucleopolyhedrovirus, NPV)和顆粒體病毒(granulovirus, GV)，其中NPV能在細(xì)胞核內(nèi)形成截面約為0.6～2 μm的多面型包涵體(occlusion body, OB)，又名多角體(polyhedron)。桿狀病毒在感染周期可以產(chǎn)生兩種物理形態(tài)和結(jié)構(gòu)不同的病毒粒子：包埋型病毒粒子(occlusion-derived virus, ODV)和芽生型病毒粒子(budded virus, BV)。環(huán)境中的NPV病毒以包涵體/多角體的形式存在，ODV包埋于包涵體蛋白晶體中。包涵體內(nèi)包埋多個(gè)ODV，一個(gè)ODV囊膜中存在單個(gè)或多個(gè)核衣殼，如家蠶核多角體病毒Bombyxmorinucleopolyhedrovirus(BmNPV)屬于單粒包埋核多角體病毒，苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒Autographacalifornicamultiple nucleopolyhedrovirus(AcMNPV)屬于多粒包埋核多角體病毒。包涵體在自然環(huán)境中非常穩(wěn)定，可以長(zhǎng)期保護(hù)ODV的活性。

目前已有100多種桿狀病毒完成基因組測(cè)序，基于進(jìn)化樹、宿主以及病毒粒子包埋等信息，可將NPV劃分為四個(gè)屬：α-桿狀病毒屬(鱗翅目特異NPVs)、β-桿狀病毒屬(鱗翅目特異GVs)、γ-桿狀病毒屬(膜翅目特異NPVs)和δ-桿狀病毒屬(雙翅目特異NPVs)(Jehleetal., 2006; Williamsetal., 2017)。其中，α-桿狀病毒的研究最為透徹，包括AcMNPV、BmNPV、黃杉毒蛾核多角體病毒Orgyiapseudotsugatamultiple nucleopolyhedrovirus(OpMNPV)、甜菜夜蛾核型多角體病毒Spodopteraexiguamultiple nucleopolyhedrovirus(SeMNPV)和棉鈴蟲核型多角體病毒Helicoverpaarmigerasingle nucleopolyhedrovirus(HaSNPV)等。根據(jù)BV病毒粒子囊膜上的膜融合蛋白差異，α-桿狀病毒可分為兩個(gè)類群：利用glycoprotein 64(GP64)作為BV膜融合蛋白的Group I NPVs，包括AcMNPV、BmNPV等；以F蛋白(fusion protein)為膜融合蛋白的Group II NPVs，包括SeMNPV、HaSNPV等。本文將重點(diǎn)介紹鱗翅目昆蟲與核型多角體病毒的互作研究。

1 核型多角體病毒生活史

當(dāng)昆蟲取食被包涵體污染的食物后，包涵體進(jìn)入中腸并在堿性的腸道中被蛋白酶溶解，釋放出ODV(圖1)。ODV穿過中腸圍食膜，其囊膜與中腸上皮細(xì)胞微絨毛膜融合之后，核衣殼侵入中腸柱狀上皮細(xì)胞，形成初級(jí)感染(primary infection)。隨后，部分病毒核衣殼可以直接從中腸上皮細(xì)胞的基底膜上出芽釋放，快速形成少量的BV；另一部分核衣殼則進(jìn)入細(xì)胞核并解聚釋放病毒基因組，調(diào)控病毒基因的表達(dá)、病毒基因組DNA的復(fù)制和結(jié)構(gòu)蛋白合成。子代核衣殼在病毒發(fā)生基質(zhì)(virogenic stroma, VS)中形成后通過核膜出芽進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，而后脫去從核膜獲得的包膜，并通過被病毒編碼的糖蛋白修飾的質(zhì)膜出芽，獲得囊膜并形成BV(圖2)(Blissard and Theilmann, 2018)。釋放出的BV穿過腸道基膜(basal lamina)進(jìn)入血淋巴系統(tǒng)迅速擴(kuò)散感染全身的組織細(xì)胞，也可以直接感染某些類型的細(xì)胞(如氣管細(xì)胞、血細(xì)胞)，從而引發(fā)次級(jí)感染(secondary infection)(圖1)。BV通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，在晚期內(nèi)吞體的酸性環(huán)境下，BV囊膜蛋白發(fā)揮膜融合作用，釋放核衣殼到細(xì)胞質(zhì)中。肌動(dòng)蛋白多聚體可推進(jìn)核衣殼的運(yùn)輸和穿過核孔，釋放病毒基因組開始新一輪的復(fù)制。次級(jí)感染過程中產(chǎn)生的新的BV能在蟲體內(nèi)部的細(xì)胞和組織間傳播擴(kuò)散。而在病毒感染的晚期，BV的生成減少，大量的病毒核衣殼被包裝成ODV，并被多角體蛋白包埋，多角體蛋白聚合結(jié)晶形成包涵體。隨著感染進(jìn)入到極晚期，被感染的宿主細(xì)胞膜裂解，蟲體液化(Donlyetal., 2014)。桿狀病毒編碼的幾丁質(zhì)酶(v-chiA)和組織蛋白酶(v-cath)能降解昆蟲的外骨骼，使得包涵體釋放到環(huán)境中(Hawtinetal., 1997)。

圖1 核型多角體病毒的侵染周期Fig.1 The infection cycle of nucleopolyhedrovirus

雖然ODV和BV的基因組相同，核衣殼的結(jié)構(gòu)和組成上基本相似，但是囊膜有很大差別，導(dǎo)致其在病毒侵染過程中的功能顯著不同(Blissard and Theilmann, 2018)。BV從宿主細(xì)胞中出芽產(chǎn)生，其單層囊膜來源于被病毒蛋白修飾的細(xì)胞質(zhì)膜；ODV在細(xì)胞核內(nèi)組裝，其多層囊膜來源于被修飾的細(xì)胞核膜(Feietal., 2018)。ODV和BV的核衣殼和囊膜上存在特異性和共有的蛋白，如PTP(protein tyrosine phosphatase)、BRO(baculovirus repeated ORFs)等蛋白是AcMNPV的BV核衣殼特異性蛋白，GP64、v-UBI(viral-ubiquitin)等是BV囊膜特異性蛋白，P33、Ac5等是ODV核衣殼特異性蛋白，PIF、ODV-E66等是ODV囊膜特異性蛋白，P78/83、Ac58、VP39等是ODV和BV共有的核衣殼蛋白，ODV-E25、ODV-E18是共有的囊膜蛋白。

BV和ODV囊膜脂質(zhì)組成也有很大的不同，如AcMNPV感染草地貪夜蛾Sf9細(xì)胞后產(chǎn)生的BV囊膜磷脂約含有50%磷脂酰絲氨酸、13%鞘磷脂、12%磷脂酰肌醇、11%磷脂酰膽堿、8%磷脂酰乙醇胺以及6%溶血卵磷脂(Braunagel and Summers, 1994; Faulkneretal., 1997)，而AcMNPV的ODV囊膜脂質(zhì)大約由39%磷脂酰膽堿、30%磷脂酰乙醇胺、20%磷脂酰絲氨酸以及少量的溶血卵磷脂組成。脂質(zhì)組分的差異可能在ODV和BV侵染宿主細(xì)胞以及組裝和出芽中有著重要作用。

2 核型多角體病毒侵染特征

2.1 包涵體溶解與ODV釋放

包涵體/多角體蛋白(polyhedrin)是包涵體/多角體的主要蛋白，其三聚體通過二硫鍵相連形成結(jié)晶并將ODV包埋(Jietal., 2010)。多角體蛋白的N-末端區(qū)域含有約40個(gè)殘基的無序氨基酸序列，可能參與ODV病毒顆粒與多角體晶體的互作。包涵體表面由糖類和蛋白質(zhì)所組成的光滑無縫的多角體膜(polyhedron envelope, PE)包裹，用于密封表面和提高多角體的穩(wěn)定性。鱗翅目特異性的NPVs都含有PE蛋白(Ac131)，PE蛋白和P10纖維化結(jié)構(gòu)有關(guān)，而P10蛋白參與多角體膜的組裝(Vlaketal., 1988; Whitt and Manning, 1988)。包涵體表面的蛋白酶可能來源于蟲體、細(xì)菌和病毒的混合物，可被熱失活。在昆蟲腸道堿性腸液的刺激下，包涵體迅速被腸道或多角體上的蛋白酶溶解，其中早期被破壞的就是連接三聚體的二硫鍵(Wang and Granados, 2000；Pengetal., 2011)。破壞腸道的圍食膜能降低桿狀病毒的半致死劑量，表明圍食膜是抵御ODV病毒侵染的物理屏障(Wang and Granados, 2000)。一些α-桿狀病毒和β-桿狀病毒的包涵體含有一種叫做增強(qiáng)子素(enhancins)的金屬蛋白酶，enhancins能消化圍食膜組分粘蛋白，破壞圍食膜從而提高病毒感染效率(Topraketal., 2012)。AcMNPV編碼ODV-E66(Ac46)降解圍食膜上的硫酸軟骨素從而增強(qiáng)初級(jí)感染(Sugiuraetal., 2013)。ODV囊膜上ac145和ac150編碼的幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白也可能參與腸道感染(Dalletal., 2001)。

2.2 ODV與中腸細(xì)胞

ODV對(duì)昆蟲上皮細(xì)胞的識(shí)別有很高的特異性，ODV病毒顆粒首先和微絨毛膜直接接觸并融合進(jìn)入中腸上皮細(xì)胞(Granados and Lawler, 1981)。目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ODV囊膜表面的病毒口服感染因子(perosinfectivity factors，PIFs)復(fù)合物介導(dǎo)ODV與微絨毛膜的結(jié)合和融合(Genceretal., 2018; Wangetal., 2018; Wangetal., 2019)。PIF復(fù)合物包括9種組分，P74(Ac138/PIF0)最早被發(fā)現(xiàn)，敲除p74基因不會(huì)影響B(tài)V的產(chǎn)生，卻使ODV口服感染能力喪失(Kuzioetal., 1989；Haas-Stapletonetal., 2004)。之后發(fā)現(xiàn)了9種PIFs，分別命名為PIF1到PIF9，除了PIF5外，其他PIFs都參與PIF復(fù)合物的組裝。其中PIF1、2和3是核心成分，可以形成約230 kDa的核心復(fù)合物。PIF0、4、6、7和9依賴PIF1-3核心復(fù)合物而聚集形成約400 kDa的蛋白復(fù)合物，最終PIF8加入后形成完整的PIF復(fù)合物(Wangetal., 2019)。

AcMNPV的ODV與中腸微絨毛細(xì)胞融合后，釋放出ODV的核衣殼(Granados and Lawler, 1981)。中腸微絨毛細(xì)胞靠近腸腔側(cè)含有很多交聯(lián)的肌動(dòng)蛋白絲，間接的證據(jù)表明肌動(dòng)蛋白絲與ODV核衣殼的入核有關(guān)(Ohkawaetal., 2010)。除了入核，核衣殼也能繞過細(xì)胞核直接穿過腸道表皮細(xì)胞到達(dá)微絨毛細(xì)胞下的基膜，隨后直接進(jìn)入血淋巴(Granados and Lawler, 1981; Hofmannetal., 1995)。BV在病毒感染1～2 h后就會(huì)出現(xiàn)在基膜附近(Granados and Lawler, 1981)，表明同時(shí)入核的基因組編碼了早期基因參與到病毒對(duì)腸道細(xì)胞的快速穿過，從而逃避細(xì)胞和腸道免疫。

2.3 BV感染宿主細(xì)胞

GP64是AcMNPV的BV粒子的主要囊膜蛋白，屬于第三類病毒膜融合蛋白，其同源基因存在于所有的Group I NPVs中。GP64單體通過二硫鍵相互連接形成三聚體融合蛋白復(fù)合物，參與受體結(jié)合(Falangaetal., 2012)。當(dāng)BV感染細(xì)胞時(shí)，病毒通過GP64與細(xì)胞膜表面的潛在受體結(jié)合而吸附在細(xì)胞表面。隨后BV通過網(wǎng)格蛋白(clathrin)介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進(jìn)入中腸上皮細(xì)胞以外的其它組織細(xì)胞或離體培養(yǎng)的細(xì)胞(Longetal., 2006)。F蛋白廣泛分布于桿狀病毒中，是α-桿狀病毒屬Group II NPVs囊膜的主要糖蛋白，β-桿狀病毒屬和δ-桿狀病毒屬的BV囊膜的主要糖蛋白，敲除Group II桿狀病毒的F蛋白導(dǎo)致BV無法產(chǎn)生(Wangetal., 2008)。F蛋白能替代GP64并在GP64缺失的AcMNPV中發(fā)揮功能，但是兩者的三級(jí)結(jié)構(gòu)和構(gòu)象變化存在較大差異(Lungetal., 2002)。雖然Group I NPVs也含有F蛋白(稱為F-like蛋白)，如AcMNPV中的Ac23，但是該蛋白含量低。AcMNPV的Ac23不是BV病毒的復(fù)制和感染所必須的，但會(huì)影響到ODV的囊膜化和致病活力(Lungetal., 2003)。結(jié)合進(jìn)化關(guān)系和功能實(shí)驗(yàn)顯示，Group I桿狀病毒獲得GP64之后，F(xiàn)蛋白的功能可能就被取代。

AcMNPV的BV囊膜上還含有其他低豐度的蛋白，如v-UBI(Ac35)、GP37(Ac64)、ODV-E25(Ac94)、ODV-E18(Ac143)和BV/ODV-E26(Ac16)等(Dengetal., 2007)。ODV-E25(Ac94)和ODV-E18(Ac143)對(duì)于感染性BV的產(chǎn)生非常重要，v-UBI、GP37和BV/ODV-E26蛋白雖然能影響B(tài)V的數(shù)量，但是并非BV的感染和增殖所必須的(Volkmanetal., 1984；Volkman and Goldsmith, 1985; Pearsonetal., 2001)。

BV病毒顆粒內(nèi)吞體的形成和轉(zhuǎn)運(yùn)與宿主細(xì)胞內(nèi)吞分選轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體(the endosomal sorting complex required for transport, ESCRT)及可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors，SNARE)系統(tǒng)有關(guān)(Votteler and Sundquist, 2013)。病毒顆粒被內(nèi)吞之后，在內(nèi)吞體膜上質(zhì)子泵的作用下，內(nèi)吞體酸化，GP64的構(gòu)象發(fā)生改變進(jìn)而誘導(dǎo)病毒囊膜與內(nèi)吞體膜或內(nèi)吞體內(nèi)的囊泡膜融合，從而釋放核衣殼到細(xì)胞質(zhì)中(Backovic and Jardetzky, 2011; Dong and Blissard, 2012)。BV感染后能誘導(dǎo)細(xì)胞核周圍的肌動(dòng)蛋白骨架發(fā)生聚合，病毒非必須基因arif-1參與了肌動(dòng)蛋白的定位。病毒的P78/83(Ac9)定位于核衣殼末端，通過招募成核劑Arp2/3復(fù)合物促進(jìn)肌動(dòng)蛋白聚合，推進(jìn)病毒核衣殼穿過核孔復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核(Muelleretal., 2014)。隨著細(xì)胞核內(nèi)病毒基因的表達(dá)和DNA的復(fù)制，子代核衣殼在病毒發(fā)生基質(zhì)VS中組裝后被運(yùn)輸?shù)江h(huán)帶區(qū)域，該運(yùn)輸過程依賴于核內(nèi)于F-肌動(dòng)蛋白的聚合以及核衣殼蛋白VP80(Ac104)、P78/83(Ac9)、VP1054(Ac54)和BV/ODV-C42(Ac101)的參與(Mareketal., 2011; Guanetal., 2016)。

2.4 BV從宿主細(xì)胞中釋放

AcMNPV在核內(nèi)組裝好的一部分核衣殼會(huì)從核膜出芽用于產(chǎn)生BV，另一部分核衣殼仍然留在細(xì)胞核內(nèi)用于ODV的組裝(圖2)。決定核衣殼從核膜出芽還是留在細(xì)胞核的機(jī)制尚不清楚，可能受BV或ODV的核衣殼特異性蛋白的調(diào)控(Braunageletal., 2003; Xuetal., 2015)。BV核衣殼的泛素化修飾多于ODV核衣殼，泛素化可作為核衣殼出核的標(biāo)記并參與出核過程的調(diào)控(Biswasetal., 2018)。核衣殼通過細(xì)胞核膜上由病毒和宿主蛋白構(gòu)成的蛋白復(fù)合物出核，核衣殼出核后被包裹在核膜形成的運(yùn)輸泡中。微管可能參與運(yùn)輸泡在細(xì)胞質(zhì)中的運(yùn)輸，SNARE蛋白也參與運(yùn)輸泡的產(chǎn)生或核衣殼從運(yùn)輸泡中釋放(Guoetal., 2017)，釋放后的核衣殼借助肌動(dòng)蛋白聚合或微管被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)膜(Ohkawaetal., 2010；Danquahetal., 2012)。ESCRT也介導(dǎo)了核衣殼從核膜或細(xì)胞質(zhì)膜的出芽釋放過程(Yueetal., 2018)。大量的病毒膜融合蛋白(GP64或F蛋白)在細(xì)胞質(zhì)中合成并被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)膜，核衣殼通過病毒膜融合蛋白區(qū)域的細(xì)胞質(zhì)膜包裹而出芽形成子代BV。AcMNPV囊膜GP64融合蛋白極大地決定了BV的組裝效率(Oomens and Blissard, 1999)。

2.5 ODV的組裝

在病毒復(fù)制的晚期，大量組裝的核衣殼滯留于細(xì)胞核內(nèi)并被內(nèi)核膜(inner nuclear membrane, INM)內(nèi)陷產(chǎn)生的核內(nèi)微囊泡包裹形成ODV(圖2)。ODV的組裝是復(fù)雜的，涉及到ODV膜蛋白向宿主細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)、核內(nèi)膜的形成、核衣殼的裝配及其與核內(nèi)膜的結(jié)合、核內(nèi)膜對(duì)核衣殼的包裹，最終包涵體蛋白晶體將單個(gè)或多個(gè)ODV包埋，形成包涵體(Shietal., 2015；Qinetal., 2019)。ODV囊膜蛋白在核內(nèi)表達(dá)后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中加工成熟后入核，定位在細(xì)胞核內(nèi)膜，誘導(dǎo)微囊泡形成。微囊泡在細(xì)胞核膜處形成后脫離，Ac76、Ac75和Ac93參與了該過程，這三個(gè)蛋白也參與了核衣殼出核和BV的形成(Yuanetal., 2011；Weietal., 2014)。隨著核衣殼與核內(nèi)病毒膜的互作，核衣殼聚集，其末端與微囊泡關(guān)聯(lián)，微囊泡變長(zhǎng)，其內(nèi)的核衣殼平行排列(Shietal., 2015)。病毒極晚期基因高表達(dá)，產(chǎn)生大量包涵體蛋白和P10蛋白參與包涵體的形成。

圖2 芽生型病毒粒子侵染非中腸細(xì)胞Fig.2 The infection process of budded virus in nonmidgut host cells

3 NPV與昆蟲免疫

昆蟲雖然缺乏獲得性免疫，但在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中形成了一套較為完善的先天免疫系統(tǒng)，抵御病原物(包括病毒)的入侵。昆蟲的免疫系統(tǒng)可分為體液免疫和細(xì)胞免疫。體液免疫主要通過Toll-Sp?tzle、IMD(immune deficiency)、JAK-STAT(janus kinase/signal transducer and activator of transcription)等信號(hào)通路上調(diào)抗菌肽、活性氧和溶菌酶等效應(yīng)分子(effectors)的表達(dá)，殺滅病原物；而RNAi是昆蟲體內(nèi)重要的抗病毒機(jī)制(Voinnet, 2005)。細(xì)胞免疫主要通過血細(xì)胞參與吞噬、包囊和節(jié)結(jié)形成等過程清除異物(Lemaitre and Hoffmann, 2007)。酚氧化酶(phenoloxidase，PO)屬于體液蛋白，激活后引發(fā)黑化反應(yīng)以殺滅病原物，能同時(shí)激活體液免疫和細(xì)胞免疫(Luetal., 2014; Yietal., 2014)。此外，細(xì)胞凋亡、活性氧(reactive oxygen species, ROS)系統(tǒng)在昆蟲免疫中也發(fā)揮功能。

3.1 NPV侵染與免疫信號(hào)通路

昆蟲識(shí)別病原微生物后能將免疫信號(hào)轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)放大，誘導(dǎo)產(chǎn)生效應(yīng)因子，如抗菌肽(Luetal., 2018)?？剐院鸵赘衅废档募倚Q感染BmNPV后，抗菌肽Gloverin在抗性品系中的表達(dá)顯著高于易感品系，表明被病毒侵染的抗性品系的免疫反應(yīng)被顯著激活(Baoetal., 2010)。在AcMNPV感染的細(xì)胞中添加Gloverin能降低BV的產(chǎn)量(Moreno-Habeletal., 2012)。但是，也有報(bào)道顯示AcMNPV感染的幼蟲中，抗菌肽Gloverin和Attactin的表達(dá)是下調(diào)的(Choietal., 2012)，可能跟侵染的時(shí)期和對(duì)象有關(guān)。JAK/STAT通路調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡和免疫，JAK/STAT通路的關(guān)鍵蛋白STAT被激活后從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控基因表達(dá)。飼喂BmNPV后的家蠶血細(xì)胞中BmSTAT的表達(dá)量上調(diào)，而Toll受體的配體Sp?tzle-1的表達(dá)量并沒有顯著升高(Liuetal., 2015)。降低BmSTAT的表達(dá)量導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)BmNPV的抗性下降，增加BmSTAT的表達(dá)量后細(xì)胞對(duì)NPV的抗性也增加，表明JAK/STAT通路可能參與了抗病毒防御(Zhangetal., 2016)。感染BmNPV后，Toll家族受體在抗性品系的家蠶中腸中表達(dá)高于易感品系(Zhouetal., 2013)。AcMNPV會(huì)通過TLR9(toll-like receptor 9)激活小鼠的先天免疫(Abeetal., 2005)。唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素(sialic acid binding immunoglobulin-like lectin, Siglec)作為Ⅰ型膜蛋白，能參與識(shí)別流感病毒和觸發(fā)病毒的內(nèi)吞(Shinyaetal., 2006；Crockeretal., 2007)，Siglec通過TLR信號(hào)通路來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)(Paulsonetal., 2012)。Siglec在家蠶抗性品系的中腸中被BmNPV上調(diào)，Siglec和Toll在NPV感染過程中的功能有待后續(xù)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

RNAi(RNA interfering)作為一種先天的抵抗病毒感染的防御機(jī)制廣泛存在于植物、線蟲和動(dòng)物中(Ding, 2010)。RNAi是利用非編碼小RNA分子切割靶標(biāo)mRNA抑制基因表達(dá)。果蠅的micro RNA(miRNA)和small interfering RNA(siRNA)分別被Ago1(argonaute proteins 1)和Ago2(argonaute proteins 2)識(shí)別后，被加載到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex, RISC)，剪切或抑制靶標(biāo)基因(Ding, 2010)。此外，Piwi- RNA(piwi-interacting RNA, piRNA)通路可在siRNA途徑缺陷的條件下進(jìn)行抗病毒免疫(Ding, 2010)。這三種RNAi通路中，siRNA通路是果蠅的主要抗病毒通路。感染HaSNPV的棉鈴蟲中能檢測(cè)到大約20 nt的來源于病毒的小核酸片段，沉默Dicer-2后細(xì)胞中對(duì)應(yīng)的病毒轉(zhuǎn)錄本增加，表明病毒的轉(zhuǎn)錄本通過宿主的RNAi途徑被降解(Jayachandranetal., 2012)。雖然RNAi是有效的抗病毒途徑，但是病毒能編碼不同的RNAi抑制蛋白(viral suppressors of RNA silencing, VSRs)以逃避宿主免疫。如DNA病毒IIV6的340R能結(jié)合dsRNA和siRNA抑制其被Ago2剪切，敲除340R的病毒毒力顯著減弱(Bronkhorstetal., 2019)。研究表明感染了BmNPV、家蠶質(zhì)型多角體病毒B.moricytoplasmic polyhedrosis virus(BmCPV)和家蠶二分濃核病毒B.moribidensovirus(BmBDV)的家蠶中，Dicer-2并沒有被激活，表明RNAi通路沒有被激活，具體機(jī)制有待后續(xù)研究(Liuetal., 2015)。

3.2 昆蟲血淋巴與NPV的免疫互作

酚氧化酶是黑色素合成的關(guān)鍵酶，可以響應(yīng)病原的侵染產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的氧自由基和潛在毒性的半醌和三羥酚。當(dāng)模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors, PRRs)識(shí)別病原物后，可觸發(fā)絲氨酸蛋白酶級(jí)聯(lián)途徑，剪切酚氧化酶原(prophenoloxidase, PPO)形成有活性的酚氧化酶。絲氨酸蛋白酶抑制劑Serpins通過反應(yīng)中心環(huán)插入到蛋白酶的活性區(qū)域，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化而失活(Huntington, 2011)。對(duì)AcMNPV有抗性的美洲棉鈴蟲中，血細(xì)胞中的病毒滴度低，黑化和包裹反應(yīng)能抑制病毒的感染(Trudeauetal., 2001)。酚氧化酶原2s(prophenoloxidase 2s)和磷脂酶A2(phospholipase A2)通過釋放溶血磷脂也能激活酚氧化酶原系統(tǒng)，抗病毒的家蠶血淋巴中這兩個(gè)基因在BmNPV感染后顯著上調(diào)表達(dá)(Bao and Lvetal., 2010)，表明酚氧化酶原系統(tǒng)參與宿主對(duì)NPV的抵抗。為了成功侵染宿主，NPV進(jìn)化出不同的策略抑制宿主的黑化反應(yīng)。Hemileucasp. NPV的hesp018基因編碼絲氨酸蛋白酶抑制劑，能抑制酚氧化酶的活性(Ardisson-Araújoetal., 2015)。棉鈴蟲NPV病毒則能上調(diào)宿主的絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin5/9)抑制PPO的激活(Yuanetal., 2017)。AcMNPV的conotoxin-like(ctx)基因能抑制血淋巴的黑化(Caoetal., 2012)。

3.3 NPV和宿主凋亡的發(fā)生

細(xì)胞凋亡是一種由基因控制下的程序性死亡，由多種凋亡因子誘導(dǎo)而發(fā)生，在機(jī)體發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)平衡以及免疫中發(fā)揮著重要作用(Ikedaetal., 2013)。NPV感染昆蟲初期，細(xì)胞凋亡被激活以抑制病毒復(fù)制和擴(kuò)增；而在昆蟲感染后期，病毒則會(huì)抑制宿主的凋亡以促進(jìn)病毒擴(kuò)增(Roulstonetal., 1999；Ikedaetal., 2013)。多種NPV(如BmNPV, SeMNPV, OpMNPV)感染舞毒蛾Ld652Y細(xì)胞均會(huì)誘導(dǎo)凋亡(Ishikawaetal., 2003)，感染AcMNPV會(huì)誘導(dǎo)Sl-zsu-1細(xì)胞凋亡(Zhangetal., 2002)。在沒有病毒DNA復(fù)制時(shí)，受斜紋夜蛾核型多角體病毒Spodopteralituramultiple nucleopolyhedrovirus(SpltMNPV)和大豆夜蛾核型多角體病毒Anticarsiagemmatalismultiple nucleopolyhedrovirus(AgMNPV)感染的家蠶Bm-5細(xì)胞會(huì)引發(fā)凋亡(Ishikawaetal., 2003)，這些結(jié)果表明桿狀病毒通過多種機(jī)制誘導(dǎo)昆蟲細(xì)胞的凋亡。

隨著病毒的進(jìn)化，病毒擁有不同的策略可以抑制宿主細(xì)胞凋亡，促使自身得以繼續(xù)增殖。目前在桿狀病毒基因組已發(fā)現(xiàn)有3種凋亡抑制機(jī)制：p35類凋亡抑制劑、凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis, iap)和凋亡抑制因子(apoptotic suppressor, apsup)(Huangetal., 2019)。Caspase半胱氨酸酶是誘導(dǎo)凋亡發(fā)生的關(guān)鍵組分，其中起始caspase能剪切自激活，引起caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，效應(yīng)caspase可直接降解胞內(nèi)蛋白，引起凋亡(Denton and Kumar, 2015)。AcMNPV的p35蛋白能直接抑制效應(yīng)caspase大亞基的剪切從而避免caspase被激活，阻斷凋亡的發(fā)生(LaCountetal., 2000)。?；页嵋苟旰诵投嘟求w病毒Spodopteralittoralisnucleopolyhedrovirus(SpliNPV)、粘蟲核型多角體病毒Leucaniaseparatamultiple nucleopolyhedrovirus(LsNPV)和SpltMNPV含有p35的同源基因p49，p49蛋白能抑制效應(yīng)caspase和水解起始caspase(Linetal., 2010)。與細(xì)胞編碼的IAPs相比，病毒編碼的IAPs缺少N端不穩(wěn)定基序，OpMNPV的Op-IAP也能抑制caspase的激活。Caspase大小兩個(gè)亞基間的TETE-G位點(diǎn)被剪切后能激活caspase, Op-IAP能阻塞剪切位點(diǎn)從而抑制凋亡(Lamkanfi and Dixit, 2010)。被舞毒蛾核型多角體病毒Lymantriadisparmultiple nucleopolyhedrovirus(LdMNPV)感染的Ld652Y細(xì)胞中病毒基因apsup在早期表達(dá)，能抑制由p35缺失的AcMNPV誘導(dǎo)的凋亡(Yamadaetal., 2011)。Ld652Y細(xì)胞中apsup能阻止Ld-Dronc(caspase)的蛋白酶解過程和失活caspase-3-like蛋白酶，從而抑制凋亡發(fā)生(Yamadaetal., 2013)。

4 NPV與宿主的其他互作過程

桿狀病毒的感染會(huì)改變宿主的細(xì)胞周期，創(chuàng)造適合病毒擴(kuò)散的條件。桿狀病毒在侵染過程中能阻礙宿主的細(xì)胞周期但不影響DNA的復(fù)制，從而促進(jìn)病毒擴(kuò)增。AcMNPV的轉(zhuǎn)錄活化因子ie2在感染草地貪夜蛾SpodopterafrugiperdaSf細(xì)胞早期表達(dá)，參與阻止細(xì)胞有絲分裂的進(jìn)行。AcMNPV病毒對(duì)細(xì)胞周期的阻滯取決于侵染時(shí)細(xì)胞所處的周期狀態(tài)(Prikhod’ko and Miller, 1998; Mainzetal., 2002; Tungetal., 2016)。HaSNPV和BmNPV分別感染棉鈴蟲和家蠶細(xì)胞系后，導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂停留在G2/M期(Zhangetal., 2012; Zhouetal., 2004)。

鱗翅目昆蟲的變態(tài)發(fā)育受保幼激素和蛻皮激素的調(diào)控，蛻皮激素由昆蟲的前胸腺分泌，能促使幼蟲蛻皮。桿狀病毒基因組中的egt基因可以編碼蛻皮甾體尿苷5′-二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(ecdysteroid uridine 5′-diphosphate glucosyltransferase)，可以催化尿苷5′-二磷酸糖基(uridine 5′-diphosphate glucosyl)添加到蛻皮激素上，形成沒有活性的蛻皮激素22-β-D-吡喃葡萄糖苷(ecdysone 22-β-D-glucopyranose)，進(jìn)而延遲蛻皮和化蛹，以利于病毒大量繁殖(Rodriguesetal., 2001)。當(dāng)昆蟲被病毒感染后，桿狀病毒能增加宿主的活動(dòng)能力以及促使其向高處攀爬，蟲體死亡液化破裂時(shí)能促進(jìn)病毒的傳播(Kamitaetal., 2005; Wangetal., 2015)。LdMNPV的egt基因表達(dá)可以增強(qiáng)舞毒蛾L.dispar的攀爬行為，這種行為可能與egt導(dǎo)致的蛻皮激素的失活有關(guān)(Hooveretal., 2011)。蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酯酶(protein tyrosine phosphatase, PTP)能將蛋白或者RNA去磷酸化，ptp基因缺失的BmNPV無法誘導(dǎo)典型的病毒誘導(dǎo)性爬行癥狀(Kamitaetal., 2005; Katsumaetal., 2012)。但是BmPTP的磷酸化活性與病毒對(duì)宿主的行為控制無關(guān)(Katsumaetal., 2012)。此外，NPV感染晚期的幼蟲呈現(xiàn)能量代謝被抑制，食欲減退，體色變黃、發(fā)白的癥狀。

5 總結(jié)與展望

昆蟲和桿狀病毒的相互作用是復(fù)雜而多樣，桿狀病毒感染的過程中涉及病毒形態(tài)轉(zhuǎn)化、宿主的免疫防御與病毒對(duì)免疫的抑制、宿主細(xì)胞的凋亡、病毒對(duì)宿主基因組的整合等過程，病毒和宿主雙方博弈過程中的主導(dǎo)方如何變化仍不清楚。當(dāng)前的研究大多集中在細(xì)胞中，細(xì)胞和蟲體中病毒與宿主的互作關(guān)系存在較大差異，未來需要開展更多的活體研究。盡管當(dāng)前對(duì)桿狀病毒的感染過程研究的比較深入，但是更多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還是集中在桿狀病毒外殼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能的研究上，如GP64蛋白。GP64蛋白從1995年首次被發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在得到了廣泛研究，而對(duì)于病毒入侵細(xì)胞的具體過程還不是很清楚。ODV是NPV啟動(dòng)侵染的重要病毒顆粒形態(tài)，盡管ODV的關(guān)鍵組分已被鑒定，但是ODV結(jié)合與進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制有待深入研究。隨著CRISPR-Cas9等技術(shù)的發(fā)展，開發(fā)特定昆蟲細(xì)胞系(如ODV可侵染的細(xì)胞系)和轉(zhuǎn)基因昆蟲，將會(huì)更有利于研究ODV與宿主中腸細(xì)胞的相互作用。

桿狀病毒的應(yīng)用前景巨大，從農(nóng)業(yè)到醫(yī)學(xué)都具有很好的實(shí)用性。桿狀病毒對(duì)靶標(biāo)害蟲有很強(qiáng)的殺蟲毒力，而且對(duì)環(huán)境友好，已被開發(fā)成農(nóng)業(yè)害蟲殺蟲劑。已發(fā)現(xiàn)的600多種桿狀病毒中只有個(gè)別NPV的寄主范圍是廣譜的，其中甘藍(lán)夜蛾核型多角體病毒Mamestrabrassicaemultiple nucleopolyhedrovirus(MbMNPV)的應(yīng)用最多。針對(duì)目前NPV殺蟲劑價(jià)格偏貴以及作用時(shí)間長(zhǎng)的劣勢(shì)，擴(kuò)展桿狀病毒的寄主范圍，提升NPV的毒力，縮短殺蟲時(shí)間是亟待解決的問題。近年來?xiàng)U狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)被大量應(yīng)用于高質(zhì)量重組蛋白的表達(dá)，已被用于多種疫苗的生產(chǎn)。重組桿狀病毒BacMam作為質(zhì)?？梢詫y帶的基因轉(zhuǎn)移到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，并且因?yàn)椴溉閯?dòng)物細(xì)胞中沒有桿狀病毒的啟動(dòng)子，所以重組病毒并不能在細(xì)胞中復(fù)制，因此BacMam作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因載體，在疾病的基因治療方面也有很好的潛在應(yīng)用。