• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    胃癌免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)預(yù)后基因的共表達網(wǎng)絡(luò)分析鑒定

    2021-05-14 03:04:20李夢瑩王耀群孫夢雨邱潔萍陳博
    中國普通外科雜志 2021年4期
    關(guān)鍵詞:記憶性共表達樣本

    李夢瑩,王耀群,孫夢雨,邱潔萍,陳博

    (1.安徽醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,安徽 合肥 230012;2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 普通外科,安徽 合肥 230000)

    胃癌(gastric cancer,GC)是人類消化道中最常見的惡性腫瘤之一[1],根據(jù)全球癌癥統(tǒng)計分析數(shù)據(jù),GC已成為第五大最常被診斷出的癌癥和 第三大癌癥致死的原因,是全球性的重要健康危 機[2]。臨床上以手術(shù)切除、化療、放療或聯(lián)合靶向為主的GC治療方法難以徹底清除腫瘤病灶,腫瘤易進展或復(fù)發(fā)且毒副作用大,患者的5年生存率低至10%~15%[3-4],因此探索新的更有效的治療方法成為亟待解決的重大課題。

    近年來腫瘤免疫治療作為一種新型的治療方法,基于人體的免疫系統(tǒng),利用免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮抗腫瘤作用,已經(jīng)表現(xiàn)出顯著的臨床效果瘤生長、發(fā)展和患者預(yù)后結(jié)局均與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤情況相關(guān)[5-7]。2018年,James P.Allison和Tasuku Honjo 等就因在“抑制免疫檢查點(CTLA-4、PD-1)抗腫瘤研究”中作出卓越貢獻而獲得諾貝爾生理學(xué)獎。此外,已有研究表明,M2巨噬細(xì)胞在膀胱癌組織中富集,促進血管生成,可作為膀胱癌潛在的免疫治療靶點[8],有關(guān)自然殺傷細(xì)胞的多種腫瘤免疫治療也已進入臨床試驗階段[9]。由此可見,挖掘免疫細(xì)胞相關(guān)靶標(biāo)是優(yōu)化腫瘤免疫治療的有效路徑[10-11]。

    過去這方面的研究多通過流式細(xì)胞術(shù)或免疫組織化學(xué)來評估腫瘤中浸潤的免疫細(xì)胞的組成,但這些方法都存在不足,并有可能導(dǎo)致細(xì)胞丟失或結(jié)果失真。Newman等[12]于2015年設(shè)計出了新的生物信息學(xué)算法—CIBERSORT,通過估計RNA轉(zhuǎn)錄本的相對子集和復(fù)雜組織標(biāo)準(zhǔn)化基因表達數(shù)據(jù)來鑒定細(xì)胞類型和被測樣本的免疫細(xì)胞組成。該法已經(jīng)在多種惡性腫瘤中進行了很好的驗證[13],可以廣泛地應(yīng)用于惡性腫瘤發(fā)病機制、腫瘤免疫等過程的生物信息學(xué)挖掘。另有研究表明,免疫治療與化療聯(lián)合在多種腫瘤治療中效果顯著,尋找腫瘤免疫的基因標(biāo)志物已經(jīng)成為當(dāng)下腫瘤治療的研究熱點[14-15]。而作為鑒定與疾病相關(guān)的基因模塊和關(guān)鍵基因的理想方法,加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)基于大樣本基因表達數(shù)據(jù)尋找潛在生物標(biāo)志物,已經(jīng)在眾多研究中被用來對宮頸癌、甲狀腺乳頭狀癌等惡性腫瘤進行分析,并成功篩選出了有效的基因靶點[16-17]。

    綜上,為尋找可靠的GC相關(guān)免疫細(xì)胞相關(guān)基因靶標(biāo),從而優(yōu)化GC患者的預(yù)后,本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫下載GC的mRNA表達數(shù)據(jù),并使用CIBERSORT算法逐一測算樣品的免疫細(xì)胞組成,構(gòu)建WGCNA,結(jié)合生存分析獲取其與GC預(yù)后的相關(guān)性并用外部數(shù)據(jù)庫加以驗證,鑒定出GC免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)預(yù)后基因,為進一步明確潛在的GC免疫治療靶點提供理論依據(jù)。

    1 資料與方法

    1.1 數(shù)據(jù)的采集

    本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載了共407例基因轉(zhuǎn)錄表達譜數(shù)據(jù),其中包括癌組織樣本375例,癌旁組織樣本32例。GC樣本臨床信息包含性別、生存時間、生存狀態(tài)、臨床分期、腫瘤分級等。人類癌癥標(biāo)本核心資源庫的科研人員在采集、處理和分派癌組織標(biāo)本和癌旁組織標(biāo)本時,去除了患者的身份信息,因此不存在倫理問題。

    1.2 腫瘤浸潤免疫細(xì)胞評估

    利用R語言的limma包,對GC組織及正常組織轉(zhuǎn)錄本的mRNA表達譜數(shù)據(jù)進行校正。腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的評估采用CIBERSORT算法,反卷積法處理標(biāo)記基因表達值,估算腫瘤組織中免疫細(xì)胞占比。這些免疫細(xì)胞包括M0 巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞、靜止記憶性CD4 T細(xì)胞、CD8 T細(xì)胞、活化記憶性CD4 T細(xì)胞、調(diào)節(jié)型T細(xì)胞、記憶性B細(xì)胞等 22種。為提高準(zhǔn)確度,以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)對樣本進行篩選,繪制所有符合條件的樣本中每種免疫細(xì)胞占比柱狀圖,免疫細(xì)胞間的相關(guān)性熱圖和GC組織與正常組織樣本免疫細(xì)胞占比的小提琴圖。

    1.3 腫瘤組織中高含量免疫細(xì)胞的生存分析

    結(jié)合從TCGA下載的患者臨床信息,合并免疫細(xì)胞矩陣和生存時間,對在腫瘤組織中含量顯著偏高的11種免疫細(xì)胞進行批量化生存分析。根據(jù)免疫細(xì)胞水平中位值將患者分為高、低浸潤組,采用Kaplan-Meier法計算其與生存的相關(guān)性,使用R語言的survival包繪制生存曲線。

    1.4 WGCNA 模塊構(gòu)建及可視化

    WGCNA技術(shù)是一種為分析基因表達數(shù)據(jù)而建立的高通量數(shù)據(jù)挖掘算法。相較于一維分子生物學(xué)的研究方法,其構(gòu)建的基因模塊幾乎覆蓋了人類的所有基因,對生物系統(tǒng)的展示更加精準(zhǔn)。本研究利用R語言中WGCNA包進行了基因共表達網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與模塊鑒定。首先將數(shù)據(jù)導(dǎo)入R語言進行初步篩選,去除離群值以保證可信度,然后繪制樣本層次聚類樹,并依據(jù)差異基因表達譜定義相似度表達矩陣,對基因進行相似性度量。

    具體而言,用Sij表示基因i和基因j的表達相似度,通過皮爾森相關(guān)系數(shù)(Pearson correlation coefficient,Pcc)計算獲得相關(guān)系數(shù)Sij=|cor(i,j)|。由此構(gòu)成相似度矩陣S=[Sij]。對任意的兩個基因i、j之間的關(guān)聯(lián),它們的臨接系數(shù)aij為aij= power(Xij,β)≡|Xij|β,即對相關(guān)系數(shù)進行次方的冪指數(shù)加權(quán),得到軟閾值β。對最佳β值的選擇,應(yīng)當(dāng)使得R2值趨向于穩(wěn)定且R2>0.8[18]。既遵循無尺度網(wǎng)絡(luò)原則,又確保不同模塊中基因間鏈接程度較高,以包含足夠的生物信息。采用拓?fù)渲丿B技術(shù)(Topological Overlap Measure, TOM)對衡量基因間的關(guān)聯(lián)性,將鄰接矩陣|Xij|轉(zhuǎn)換為拓?fù)渚仃嚘?|ωij|[19]?;騣和基因j之間若無直接相關(guān)關(guān)系,且又無第三方基因?qū)⑦@兩個基因間接連接起來,即視為兩個基因之間相關(guān)性為0(TOM=0),兩基因之間的差異度為(1-TOM)?;蛑g的相關(guān)性不僅包括兩個相關(guān)系數(shù),還包括第三方基因建立的相關(guān)性,所得結(jié)果與實際情況更加吻合,為共表達網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

    基于蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的算法來完成共表達網(wǎng)絡(luò)中模塊的識別。將每個模塊中基因最小數(shù)目定義為5 0,應(yīng)用基于層次的模塊識別,以差異度值(1-TOM)為基礎(chǔ),使用動態(tài)剪接法和聚類分析探測基因的功能模塊。基因由樹中的葉節(jié)點代表,密集連接的分支代表了接近的基因,函數(shù)“moduleEigengenes”計算得到的模塊特征基因(module eigengene,ME)為模塊的第一主成分,即該模塊基因表達譜代表。若模塊間的ME相關(guān)性>0.75,則表示它們有類似的表達譜,應(yīng)將該模塊合并。將合并后的模塊與免疫細(xì)胞建立關(guān)聯(lián)分析,繪制模塊—免疫細(xì)胞相關(guān)熱圖,根據(jù)模塊中每個基因的基因與模塊之間相關(guān)性值(module membership,MM)和基因與免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性絕對值(gene significance,GS)得到與預(yù)后免疫細(xì)胞相關(guān)性最顯著的核心模塊。

    1.5 核心模塊中差異基因的生存分析

    利用R語言survival包,分別對與靜止記憶性CD4 T細(xì)胞和調(diào)節(jié)型T細(xì)胞相關(guān)的核心模塊中的差異基因進行生存分析。依據(jù)GC組織中差異基因表達量中位數(shù)作為分界,根據(jù)基因表達量將患者分為高低表達組,采用Kaplan-Meier、Log-rank法計算基因與患者總生存期的相關(guān)性,并使用R語言的survival包進行生存曲線繪制,根據(jù)計算出的P<0.05篩選差異生存基因。

    1.6 基于外部數(shù)據(jù)庫驗證差異生存基因的預(yù)后意義

    Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫是進行生存分析最權(quán)威的網(wǎng)站之一,包含了多個平臺的GC 數(shù)據(jù),基于在線Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫,驗證數(shù)據(jù)庫中包含的關(guān)鍵基因的預(yù)后效能。通過NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載了GSE84437,GSE57303,GSE62254等多組GEO數(shù)據(jù)庫中獨立數(shù)據(jù)集來驗證關(guān)鍵基因的預(yù)后 意義。

    1.7 差異生存基因的通路富集分析

    為了注釋和分析生存差異基因的生物學(xué)功能,應(yīng)用基因本體論富集分析(geneontology enrichment analysis,GO)、京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)進行途徑注釋和可視化,對P<0.05的富集結(jié)果予以保留。其中GO分析分別選取生物過程(biological process,BP),細(xì)胞成分(cell component,CC)和分子功能(molecular function,MF)3大類展示富集結(jié)果;KEGG利用其全面的數(shù)據(jù)庫資源,對基因信息對更高層次和更復(fù)雜細(xì)胞活動以及生物體行為做出量化推測。

    2 結(jié) 果

    2.1 GC 中浸潤免疫細(xì)胞情況

    在獲得的所有樣本中,有258例GC樣本和18例正常樣本符合CIBERSORT標(biāo)準(zhǔn),即P<0.05。在應(yīng)用CIBERSORT算法分析數(shù)據(jù)后,利用R語言作圖。首先,用一種顏色代表一種免疫細(xì)胞類型,用柱形的長度代表一種類型免疫細(xì)胞的相對含量,各樣本不同類型免疫細(xì)胞的相對含量之和為1,繪制出了22種免疫細(xì)胞在每個樣本中的柱狀占比圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn),巨噬細(xì)胞(M0)、中性粒細(xì)胞、活化的CD4+記憶性T細(xì)胞、靜止記憶性CD4 T細(xì)胞、調(diào)節(jié)型T細(xì)胞等11種免疫細(xì)胞在腫瘤組織中明顯高于正常組織(圖1)。使用Pearson相關(guān)分析計算258例GC樣本中22種免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)度,繪制出每對免疫細(xì)胞間的相關(guān)性熱圖,紅色代表協(xié)同,藍色代表拮抗,相關(guān)性隨著顏色的加深而變高。在GC組織中,構(gòu)成比相關(guān)系數(shù)較大的免疫細(xì)胞包括:呈高負(fù)相關(guān)性的靜止記憶性CD4 T細(xì)胞與CD8 T細(xì)胞(r=-0.51),呈高正相關(guān)性的活化記憶性CD4 T細(xì)胞與CD8 T細(xì)胞(r=0.42)等(圖2)。用紅色和藍色代表GC組織和正常組織,橫坐標(biāo)表示免疫細(xì)胞,縱坐標(biāo)表示免疫細(xì)胞浸潤的百分比,繪制GC及正常組織中免疫細(xì)胞浸潤占比小提琴圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn),258例GC樣本和18例正常樣本的漿細(xì)胞、靜息狀態(tài)記憶性CD4 T細(xì)胞、活化狀態(tài)記憶性CD4 T細(xì)胞及輔助性T細(xì)胞等浸潤程度差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001、P=0.013、P=0.001、P=0.012),其中漿細(xì)胞在正常樣本組中的浸潤程度較GC樣本組高,而靜息狀態(tài)記憶性CD4 T細(xì)胞、活化記憶性CD4 T細(xì)胞及輔助性T細(xì)胞正常樣本組中的浸潤程度低于GC樣本組(圖3)。

    2.2 GC 免疫細(xì)胞浸潤與預(yù)后的關(guān)系

    對于上述在腫瘤組織中含量顯著高于正常組織的11種免疫細(xì)胞,根據(jù)免疫細(xì)胞浸潤值將患者分為高、低浸潤組。采用Kaplan-Meier與Log-rank法進行生存分析。最后發(fā)現(xiàn)靜止記憶性CD4 T細(xì)胞和調(diào)節(jié)型T細(xì)胞的浸潤情況與GC患者生存率呈明顯相關(guān)(P=0.021、P=0.013)。其中靜止記憶性CD4 T細(xì)胞構(gòu)成比例高者生存期短,而調(diào)節(jié)型T細(xì)胞構(gòu)成比例高者生存期長(圖4)。

    圖1 所有標(biāo)本中22 種免疫細(xì)胞占比的柱狀圖Figure 1 Histogram of the proportions of 22 immune cells in all specimens

    圖2 GC 組織樣本中每種免疫細(xì)胞占比相關(guān)圖Figure 2 Correlation diagram of the proportion of each immune cell in GC tissue samples

    圖3 GC 及正常組織中免疫細(xì)胞占比小提琴圖Figure 3 Violin diagram of the proportion of immune cells in GC and normal tissues

    圖4 免疫細(xì)胞構(gòu)成水平的Kaplan-Meier 生存曲線 A:靜止記憶性CD4 T 細(xì);B:調(diào)節(jié)型T 細(xì)胞Figure 4 Kaplan-Meier curves of different levels of immune cell composition A: T cells CD4 memory resting; B: T cells regulatory

    2.3 共表達網(wǎng)絡(luò)分析及可視化

    在R語言中利用WGCNA包進行共表達網(wǎng)絡(luò)分析及可視化。首先對從樣本進行去除離群值的層次聚類繪制,并匹配相應(yīng)的免疫細(xì)胞信息,從而將免疫浸潤和共表達網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系起來。結(jié)果顯示,已鑒定出的兩類預(yù)后相關(guān)免疫細(xì)胞,即靜止記憶性CD4 T細(xì)胞和調(diào)節(jié)型T細(xì)胞與基因模塊的匹配度均較好(圖5)。以0.9為cutoff值,選取β軟閾值為5 構(gòu)建共表達網(wǎng)絡(luò),既保證網(wǎng)絡(luò)接近于無尺度網(wǎng)絡(luò),又使其包含足夠的生物信息(圖6)。利用不同基因的相關(guān)性構(gòu)建分層聚類樹,通過動態(tài)剪接法和聚類分析,將相似的基因歸類到同一模塊中,最終得到5個基因模塊,其中綠松石基因模塊的范圍最廣泛(圖7)。繪制熱圖對這5個基因模塊和不同類型的免疫細(xì)胞進行相關(guān)性分析,每一行對應(yīng)一個模塊,每一列對應(yīng)一種免疫細(xì)胞,其中每一個單元對應(yīng)相關(guān)值??梢园l(fā)現(xiàn),綠松石模塊中的基因與已鑒定出的兩類預(yù)后相關(guān)免疫細(xì)胞即靜止記憶性CD4 T細(xì)胞(r=0.27,P<0.001)和調(diào)節(jié)型T細(xì)胞(r=0.19,P=0.003)相關(guān)性最為顯著(圖8),因此將從綠松石模塊中篩選這兩類免疫細(xì)胞的浸潤調(diào)控基因。

    圖5 樣本層次聚類樹結(jié)合免疫細(xì)胞表達量分析圖Figure 5 Analysis of sample level clustering combined with expression level of the immune cells

    圖6 WGCNA 分析軟閾值(β)的確定Figure 6 Determination of soft threshold (β) for WGCNA analysis

    圖7 GC 的共表達基因模塊聚類樹圖Figure 7 A cluster tree diagram of co-expressed gene modules for GC

    圖8 熱圖分析模塊基因與免疫細(xì)胞相關(guān)性Figure 8 Heat map analysis of the correlation between module genes and immune cells

    2.4 GC 免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)預(yù)后基因的鑒定

    對與記憶性CD4 T細(xì)胞和調(diào)節(jié)型T細(xì)胞相關(guān)的綠松石模塊基因進行生存分析。為了縮小與疾病無關(guān)的死亡因素的干擾,本數(shù)據(jù)集將長于10年的生存期默認(rèn)為10年,并將患者的生存狀態(tài)設(shè)為存活。最后共分析了355例GC患者的總生存期,共鑒定得到了3個與記憶性CD4 T細(xì)胞相關(guān)(CGB5、LINC00106、LINC00392)和一個與調(diào)節(jié)型T細(xì)胞相關(guān)(UPK1B)的生存基因(均P<0.05),其中CGB5、LINC00392、UPK1B的高表達與不良預(yù)后相關(guān),而LINC00106的高表達則有益于患者預(yù)后(圖9)。

    2.5 差異生存基因的預(yù)后驗證

    基于在線Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)CGB5、UPK1B的高表達均與GC的不良預(yù)后明顯相關(guān)(P<0.05)。通過NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)下載GSE84437,GSE57303,GSE62254等多組GEO數(shù)據(jù)庫中獨立數(shù)據(jù)集,驗證篩選出的關(guān)鍵基因的預(yù)后意義,生存分析發(fā)現(xiàn)CGB5和UPK1B的表達與G C 患者的預(yù)后均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05),證明了其具有可靠的預(yù)后相關(guān)性。然而,由于包含LINC00106和LINC00392的數(shù)據(jù)集在現(xiàn)行數(shù)據(jù)庫中收錄過少且樣本數(shù)目明顯不足,我們僅發(fā)現(xiàn)LINC00106的高表達與GC的不良預(yù)后呈負(fù)相關(guān),但尚無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.251)。利用lnCAR(https://lncar.renlab.org),基于多組GEO數(shù)據(jù)集,發(fā)現(xiàn)相比于正常組織,LINC00106在GC等消化道腫瘤中均呈低表達,而LINC00392在GC等消化道腫瘤中均呈高表達,這與先前的發(fā)現(xiàn)一致,并在一定程度上反映了兩者在GC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用(圖10)。

    2.6 基因的功能富集分析

    對得到的4 個預(yù)后差異基因執(zhí)行包括G O 和KEGG途徑在內(nèi)的功能分析。GO富集分析通過對差異基因進行GO terms富集度統(tǒng)計學(xué)的分析,計算出差異基因FDR值(q-value),最后按照BP,MF和CC 3個層面對基因進行注釋和排序。GO分析表明:這些基因主要參與的生物過程包括:肌肉系統(tǒng)過程、細(xì)胞器裂變、DNA?結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性,RNA聚合酶II?特異性和糖胺聚糖結(jié)合,主要的CC有:細(xì)胞外基質(zhì)和膠原蛋白細(xì)胞外基質(zhì)。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn),這些基因主要富集于細(xì)胞周期和血管平滑肌收縮過程(圖11)。

    圖9 Kaplan-Meier 法分析4 個關(guān)鍵基因?qū)C 患者預(yù)后的影響Figure 9 Kaplan-Meier analysis of the impact of the 4 key genes on the prognosis of GC patients

    圖10 4 個關(guān)鍵基因在外部數(shù)據(jù)庫的預(yù)后效能驗證Figure10 Prognostic efficacy verification of 4 key genes in external databases

    圖11 預(yù)后相關(guān)基因的GO 和KEGG 功能富集分析 A:GO 途徑;B:KEGG 途徑Figure 11 Functional enrichment analysis of GO and KEGG based on prognostic related genes A: GO pathway; B: KEGG pathway

    3 討 論

    GC是全球范圍內(nèi)人類最高發(fā)的惡性腫瘤之一,但由于前期癥狀不明顯,大部分患者確診時腫瘤已經(jīng)發(fā)展到中晚期[1],且治療后后期復(fù)發(fā)率較高,預(yù)后效果較差,致死率居高不下[20]。近年來,腫瘤的免疫學(xué)治療受到極大的關(guān)注[21]。GC腫瘤微環(huán)境高度復(fù)雜且異質(zhì),腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用[22],其浸潤的類型和比例與患者臨床結(jié)局密切相關(guān)[23]。因此探究免疫細(xì)胞相關(guān)的生物標(biāo)志物對改善GC患者的預(yù)后具有重要意義[24]。

    本研究首先通過CIBERSORT算法,結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫中患者的詳細(xì)臨床信息,篩選出了浸潤情況與GC患者生存率呈顯著相關(guān)的兩類免疫細(xì)胞,即靜止記憶性CD4 T細(xì)胞和調(diào)節(jié)型T細(xì)胞。靜止記憶性CD4 T細(xì)胞在細(xì)胞免疫中有重要作用[25],但在腫瘤進展中的意義尚不明確,本研究發(fā)現(xiàn)其浸潤程度與生存呈負(fù)相關(guān),可為后續(xù)研究提供參考。對于調(diào)節(jié)型T細(xì)胞,Li等[26]研究發(fā)現(xiàn)其特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子FOXP3的高表達顯示了GC良好的預(yù)后,這與本研究發(fā)現(xiàn)的高調(diào)節(jié)型T細(xì)胞浸潤預(yù)示著GC更有利的預(yù)后一致。WGCNA作為一種高可信度的高通量數(shù)據(jù)挖掘算法,已成為鑒定疾病相關(guān)基因最可靠的方法之一。Huang等[27]基于WGCNA發(fā)現(xiàn)了3個與GC患者的預(yù)后相關(guān)的基因,有望將其作為GC治療靶標(biāo)。Jiang等[28]利用WGCNA構(gòu)建了1個ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作為膀胱癌預(yù)后標(biāo)志物。然而根據(jù)對既往文獻的檢索發(fā)現(xiàn)尚未有GC方面的研究將WGCNA用于浸潤免疫細(xì)胞相關(guān)預(yù)后基因的鑒定。本研究創(chuàng)新性地將CIBERSORT算法與WGCNA結(jié)合,基于高通量表達芯片數(shù)據(jù),探索基因網(wǎng)絡(luò)和免疫細(xì)胞浸潤之間的關(guān)聯(lián),挖掘出了與預(yù)后免疫細(xì)胞相關(guān)性最顯著的核心模塊。并通過生存分析鑒定出4個GC預(yù)后相關(guān)的免疫細(xì)胞浸潤調(diào)控基因(CGB5、LINC00106、LINC00392、UPK1B)。

    在這些被篩選出的差異預(yù)后基因中,已有研究表明CGB5和UPK1B在腫瘤進展中發(fā)揮作用。CGB5 在滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤和某些非滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤中異常表達,可以獨立預(yù)測晚期GC患者的總生存率和無復(fù)發(fā)生存率不良;并能促進卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞血管生成擬態(tài)的形成,有望為卵巢癌的治療提供新的靶標(biāo)和思路[29-30]。UPK1B 在膀胱癌中上調(diào),與膀胱癌的腫瘤分期,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。它通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)途徑,促進膀胱癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移,然而目前UPK1B在GC機制中的作用尚不明確[31]。而基因LINC00106、LINC00392尚無研究顯示與腫瘤相關(guān)。因此,這些基因在消化道腫瘤中的潛在作用以及它們參與的生物學(xué)功能與腫瘤之間的聯(lián)系需要全面研究。

    本研究回顧性地基于已經(jīng)完成的國外公共數(shù)據(jù)庫進行了分析,但由于患者信息獲取不全,一些患有感染、免疫系統(tǒng)疾病或服用抗炎藥的患者也有可能被納入了這項研究,從而干擾了免疫浸潤分析。此外,WGCNA算法本身在獲取基因間相互作用信息時對蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和甲基化存在依賴,也使本研究仍有一定的局限性。由于現(xiàn)行數(shù)據(jù)庫中收錄過少,本研究尚未完整地驗證LINC00106和LINC00392表達與GC患者預(yù)后的關(guān)系,其作用還有待后續(xù)進一步分析鑒定。

    總之,本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫,運用合理的生物信息方法,在兩類與GC生存率密切相關(guān)的免疫細(xì)胞中鑒定出了4個與GC免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)預(yù)后基因,揭示了腫瘤浸潤的免疫細(xì)胞是GC預(yù)后的重要因素,為GC的早期診斷和治療以及免疫療法研究和新靶向藥的開發(fā)提供了分子依據(jù)。

    猜你喜歡
    記憶性共表達樣本
    用樣本估計總體復(fù)習(xí)點撥
    侵襲性垂體腺瘤中l(wèi)ncRNA-mRNA的共表達網(wǎng)絡(luò)
    器官移植中記憶性T細(xì)胞的研究進展
    推動醫(yī)改的“直銷樣本”
    黏膜記憶性T 細(xì)胞功能
    膀胱癌相關(guān)lncRNA及其共表達mRNA的初步篩選與功能預(yù)測
    隨機微分方程的樣本Lyapunov二次型估計
    記憶性B細(xì)胞體外擴增影響因素的研究進展①
    村企共贏的樣本
    中國流行株HIV-1gag-gp120與IL-2/IL-6共表達核酸疫苗質(zhì)粒的構(gòu)建和實驗免疫研究
    老司机影院毛片| 中文字幕色久视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 热re99久久精品国产66热6| 秋霞伦理黄片| 日韩人妻精品一区2区三区| 少妇的丰满在线观看| 午夜日韩欧美国产| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 欧美黄色片欧美黄色片| 只有这里有精品99| 夫妻午夜视频| 不卡av一区二区三区| 亚洲国产成人一精品久久久| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲av欧美aⅴ国产| 一级毛片 在线播放| 亚洲成人手机| 国产深夜福利视频在线观看| 黄色一级大片看看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 日日爽夜夜爽网站| 乱人伦中国视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 久久精品国产综合久久久| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲男人天堂网一区| 精品福利永久在线观看| 精品一区在线观看国产| 久久久精品区二区三区| 国产在线免费精品| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 一区二区三区四区激情视频| 国产深夜福利视频在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 美女国产视频在线观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产日韩欧美亚洲二区| 永久网站在线| 国产激情久久老熟女| 老司机影院成人| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲成人av在线免费| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲 欧美一区二区三区| 老汉色∧v一级毛片| 人妻一区二区av| 久久99精品国语久久久| 激情五月婷婷亚洲| 婷婷色av中文字幕| 午夜福利在线免费观看网站| 中国三级夫妇交换| 亚洲av免费高清在线观看| 久久久国产欧美日韩av| 成年美女黄网站色视频大全免费| 国产精品免费大片| 国产成人aa在线观看| 伊人久久国产一区二区| www.精华液| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 久久综合国产亚洲精品| 国产成人免费无遮挡视频| 黄色 视频免费看| 欧美黄色片欧美黄色片| 成人国产麻豆网| 久久国产亚洲av麻豆专区| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 岛国毛片在线播放| 成人国语在线视频| 五月天丁香电影| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 国产又色又爽无遮挡免| 观看av在线不卡| 国精品久久久久久国模美| 欧美 日韩 精品 国产| 日本黄色日本黄色录像| 99热网站在线观看| 曰老女人黄片| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 黄片无遮挡物在线观看| 丝袜美足系列| 波多野结衣av一区二区av| 日本免费在线观看一区| 丰满乱子伦码专区| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 免费高清在线观看日韩| 日日撸夜夜添| 久久精品夜色国产| 99re6热这里在线精品视频| 制服诱惑二区| 久久国产亚洲av麻豆专区| 老熟女久久久| 满18在线观看网站| 黑人欧美特级aaaaaa片| 久久久久久人妻| 亚洲精品美女久久av网站| 欧美激情极品国产一区二区三区| 亚洲成人一二三区av| 丝袜在线中文字幕| 99国产精品免费福利视频| 亚洲天堂av无毛| 黄色毛片三级朝国网站| 美女午夜性视频免费| 美女大奶头黄色视频| www.熟女人妻精品国产| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产片内射在线| 性色av一级| 久久鲁丝午夜福利片| 26uuu在线亚洲综合色| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 男女无遮挡免费网站观看| 丝袜人妻中文字幕| 91在线精品国自产拍蜜月| 自线自在国产av| 老汉色av国产亚洲站长工具| 成人毛片60女人毛片免费| 国产精品人妻久久久影院| www日本在线高清视频| 一二三四在线观看免费中文在| www.精华液| 毛片一级片免费看久久久久| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 人体艺术视频欧美日本| 最近中文字幕2019免费版| 国产精品偷伦视频观看了| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 中文精品一卡2卡3卡4更新| 黑人猛操日本美女一级片| 好男人视频免费观看在线| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 一级黄片播放器| 一级爰片在线观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 九草在线视频观看| 男女免费视频国产| 老鸭窝网址在线观看| 成人黄色视频免费在线看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 免费黄频网站在线观看国产| 两性夫妻黄色片| 午夜日韩欧美国产| 国产不卡av网站在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 高清黄色对白视频在线免费看| 精品久久久久久电影网| 看免费av毛片| 亚洲精品国产av成人精品| 午夜福利视频精品| 曰老女人黄片| 国产精品熟女久久久久浪| 老汉色∧v一级毛片| 欧美最新免费一区二区三区| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 久久久久久久久久久免费av| 伦理电影免费视频| 久久久久久人人人人人| 男女免费视频国产| 久久久国产一区二区| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 免费看av在线观看网站| 亚洲国产精品999| 永久免费av网站大全| 国产国语露脸激情在线看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲三级黄色毛片| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 成人二区视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 有码 亚洲区| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲av欧美aⅴ国产| 我的亚洲天堂| 精品视频人人做人人爽| 亚洲国产av影院在线观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 99国产精品免费福利视频| 日日撸夜夜添| 丝袜在线中文字幕| 黑丝袜美女国产一区| 又大又黄又爽视频免费| av网站在线播放免费| 日韩欧美精品免费久久| 青春草国产在线视频| 久久婷婷青草| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲三区欧美一区| 久久久久久久久久人人人人人人| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 九九爱精品视频在线观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 一级片免费观看大全| av网站在线播放免费| 亚洲国产欧美网| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产av码专区亚洲av| 看非洲黑人一级黄片| 国产精品欧美亚洲77777| 91在线精品国自产拍蜜月| 五月天丁香电影| 高清在线视频一区二区三区| 久久精品国产亚洲av涩爱| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲综合色网址| 99九九在线精品视频| 久久精品国产亚洲av天美| 欧美激情极品国产一区二区三区| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲欧美色中文字幕在线| 日本av免费视频播放| 超碰成人久久| 日韩,欧美,国产一区二区三区| av免费观看日本| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 午夜福利视频在线观看免费| 国产av码专区亚洲av| 亚洲av.av天堂| 免费观看性生交大片5| 天天影视国产精品| 中文字幕人妻熟女乱码| 丝袜脚勾引网站| 性高湖久久久久久久久免费观看| 青青草视频在线视频观看| 在线观看一区二区三区激情| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 少妇人妻久久综合中文| 国产精品久久久久久精品古装| 制服丝袜香蕉在线| 亚洲欧美一区二区三区久久| 熟女av电影| 国产一区亚洲一区在线观看| 欧美成人午夜精品| 熟女av电影| 午夜av观看不卡| www.熟女人妻精品国产| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 精品人妻偷拍中文字幕| 欧美另类一区| 一二三四在线观看免费中文在| 欧美变态另类bdsm刘玥| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产亚洲最大av| 麻豆乱淫一区二区| 伦精品一区二区三区| 国产男人的电影天堂91| 久热久热在线精品观看| 一区二区三区精品91| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲人成77777在线视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲国产看品久久| 国产国语露脸激情在线看| 久久人人爽人人片av| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产色婷婷99| 少妇人妻久久综合中文| 九九爱精品视频在线观看| 只有这里有精品99| 亚洲精品成人av观看孕妇| 久久精品人人爽人人爽视色| 亚洲,一卡二卡三卡| 热99久久久久精品小说推荐| 国产精品欧美亚洲77777| 丝袜喷水一区| 性少妇av在线| 美女视频免费永久观看网站| 两性夫妻黄色片| a 毛片基地| 精品国产乱码久久久久久男人| 久久97久久精品| 18禁国产床啪视频网站| 男女高潮啪啪啪动态图| 久久这里有精品视频免费| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 韩国高清视频一区二区三区| 国产黄色免费在线视频| 午夜91福利影院| 欧美+日韩+精品| 夫妻午夜视频| 成年动漫av网址| 最近最新中文字幕免费大全7| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 日本午夜av视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 亚洲三级黄色毛片| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产精品熟女久久久久浪| 另类亚洲欧美激情| 日本av免费视频播放| 免费观看性生交大片5| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 日本免费在线观看一区| 有码 亚洲区| 久久久国产欧美日韩av| 日韩大片免费观看网站| 丝袜喷水一区| 各种免费的搞黄视频| 亚洲美女搞黄在线观看| 久久久久精品久久久久真实原创| 18禁动态无遮挡网站| 免费人妻精品一区二区三区视频| 麻豆乱淫一区二区| 只有这里有精品99| 亚洲精品在线美女| 青草久久国产| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 欧美精品一区二区大全| www日本在线高清视频| 国产av码专区亚洲av| 嫩草影院入口| 国产男女超爽视频在线观看| 黄色怎么调成土黄色| 18禁国产床啪视频网站| 久久ye,这里只有精品| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 久久久久国产一级毛片高清牌| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 一区二区av电影网| 韩国精品一区二区三区| 久久这里只有精品19| 国产精品久久久久久久久免| 日本av免费视频播放| 麻豆乱淫一区二区| 91国产中文字幕| 麻豆乱淫一区二区| 国产精品成人在线| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 午夜日本视频在线| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 久久久亚洲精品成人影院| 亚洲国产精品成人久久小说| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲五月色婷婷综合| 日韩一本色道免费dvd| 在线 av 中文字幕| 母亲3免费完整高清在线观看 | 在线精品无人区一区二区三| 国产成人免费观看mmmm| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久这里有精品视频免费| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产精品久久久久久久久免| 26uuu在线亚洲综合色| 婷婷成人精品国产| 99香蕉大伊视频| 999精品在线视频| 青草久久国产| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲精品国产av蜜桃| 少妇被粗大猛烈的视频| 久久精品国产亚洲av天美| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲精品国产av蜜桃| 少妇被粗大猛烈的视频| 韩国精品一区二区三区| 十分钟在线观看高清视频www| videos熟女内射| 少妇人妻久久综合中文| 欧美精品高潮呻吟av久久| 日韩三级伦理在线观看| 欧美97在线视频| 777米奇影视久久| 国产色婷婷99| 欧美少妇被猛烈插入视频| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲,欧美精品.| 国产一区二区 视频在线| 日韩在线高清观看一区二区三区| 欧美中文综合在线视频| 乱人伦中国视频| 电影成人av| 一区二区三区四区激情视频| 天天影视国产精品| 中文字幕色久视频| 久久这里有精品视频免费| 国产精品三级大全| 日日啪夜夜爽| 亚洲av国产av综合av卡| 卡戴珊不雅视频在线播放| 男人添女人高潮全过程视频| 五月伊人婷婷丁香| 曰老女人黄片| 久久国产精品大桥未久av| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 日日摸夜夜添夜夜爱| 看十八女毛片水多多多| 咕卡用的链子| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 人妻少妇偷人精品九色| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产成人欧美| 色婷婷av一区二区三区视频| av在线老鸭窝| 97在线视频观看| 国产成人午夜福利电影在线观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 女人久久www免费人成看片| 亚洲国产精品一区三区| 秋霞伦理黄片| √禁漫天堂资源中文www| 国产精品国产av在线观看| 亚洲成国产人片在线观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲av成人精品一二三区| 久久精品国产a三级三级三级| 色吧在线观看| 秋霞伦理黄片| 观看美女的网站| 国产在线免费精品| 久久午夜福利片| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 水蜜桃什么品种好| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 三上悠亚av全集在线观看| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 久久久a久久爽久久v久久| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 中文字幕最新亚洲高清| 黄色一级大片看看| 久久国内精品自在自线图片| 午夜日本视频在线| 久久久久久人人人人人| 日韩大片免费观看网站| 日韩一区二区视频免费看| 激情五月婷婷亚洲| 免费大片黄手机在线观看| 午夜91福利影院| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 色婷婷久久久亚洲欧美| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 三上悠亚av全集在线观看| 一级毛片 在线播放| 男女无遮挡免费网站观看| 搡老乐熟女国产| 久久鲁丝午夜福利片| 好男人视频免费观看在线| 大话2 男鬼变身卡| 天堂俺去俺来也www色官网| 观看av在线不卡| 极品少妇高潮喷水抽搐| 男女边吃奶边做爰视频| 99国产精品免费福利视频| 午夜日韩欧美国产| 精品福利永久在线观看| 黄片无遮挡物在线观看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 极品人妻少妇av视频| 亚洲三级黄色毛片| 在线观看美女被高潮喷水网站| 成人免费观看视频高清| 久久久久网色| 午夜av观看不卡| 日日啪夜夜爽| 欧美国产精品一级二级三级| 久久鲁丝午夜福利片| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 在线观看美女被高潮喷水网站| 色94色欧美一区二区| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产精品国产三级专区第一集| 久久久久久久国产电影| 亚洲av福利一区| 蜜桃在线观看..| 国产免费视频播放在线视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产成人精品一,二区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 91精品国产国语对白视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 欧美精品人与动牲交sv欧美| 丰满饥渴人妻一区二区三| 搡女人真爽免费视频火全软件| 欧美97在线视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产av码专区亚洲av| 亚洲精品第二区| 成人国产麻豆网| 国产淫语在线视频| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 欧美激情高清一区二区三区 | 熟女av电影| 国产成人av激情在线播放| 欧美+日韩+精品| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲视频免费观看视频| av一本久久久久| 久久久欧美国产精品| 欧美少妇被猛烈插入视频| 日韩欧美一区视频在线观看| xxx大片免费视频| 国产日韩欧美在线精品| 国产精品女同一区二区软件| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产精品免费视频内射| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 国产激情久久老熟女| 成年人免费黄色播放视频| 最近手机中文字幕大全| 国产精品成人在线| 波多野结衣av一区二区av| 久久热在线av| 日本免费在线观看一区| 妹子高潮喷水视频| 成年女人毛片免费观看观看9 | av国产久精品久网站免费入址| 亚洲经典国产精华液单| 美女福利国产在线| 看免费成人av毛片| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 丝袜美足系列| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 超碰成人久久| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 不卡av一区二区三区| 伦理电影大哥的女人| 男男h啪啪无遮挡| 色94色欧美一区二区| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 丝袜美腿诱惑在线| 婷婷色综合www| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲精品日本国产第一区| 亚洲av日韩在线播放| 最近的中文字幕免费完整| 超色免费av| 久久精品久久久久久久性| 观看av在线不卡| 韩国精品一区二区三区| 少妇人妻久久综合中文| 久久久a久久爽久久v久久| 国产激情久久老熟女| 国产不卡av网站在线观看| 国产综合精华液| 精品酒店卫生间| 午夜日韩欧美国产| 国产有黄有色有爽视频| 一本大道久久a久久精品| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 夜夜骑夜夜射夜夜干| av网站免费在线观看视频| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲精品自拍成人| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 日韩中字成人| 男女午夜视频在线观看| 国产97色在线日韩免费| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲内射少妇av| 亚洲视频免费观看视频| 久久青草综合色| 看十八女毛片水多多多| 中文字幕精品免费在线观看视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 在线观看www视频免费| 最黄视频免费看| 久久久久久人妻| 少妇人妻久久综合中文| 波多野结衣av一区二区av| 久久久国产一区二区| 一区福利在线观看| 国产综合精华液| 满18在线观看网站| 免费黄网站久久成人精品| 中文字幕最新亚洲高清| 久久人妻熟女aⅴ| 国产欧美日韩一区二区三区在线| www.熟女人妻精品国产| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产一级毛片在线| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 黑丝袜美女国产一区| 妹子高潮喷水视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 免费高清在线观看日韩| 热re99久久精品国产66热6| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 天堂8中文在线网| 亚洲av欧美aⅴ国产| av在线app专区| 青青草视频在线视频观看| 边亲边吃奶的免费视频| 十八禁高潮呻吟视频| 观看美女的网站| 久久免费观看电影| 老女人水多毛片| 看免费av毛片| 亚洲av中文av极速乱| 在线观看一区二区三区激情| 久久国产亚洲av麻豆专区| 久久99精品国语久久久| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲欧美一区二区三区久久| 欧美日韩视频精品一区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 一本大道久久a久久精品| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 久久亚洲国产成人精品v| 美女国产高潮福利片在线看|