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    胃癌免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)預(yù)后基因的共表達網(wǎng)絡(luò)分析鑒定

    2021-05-14 03:04:20李夢瑩王耀群孫夢雨邱潔萍陳博
    中國普通外科雜志 2021年4期
    關(guān)鍵詞:記憶性共表達樣本

    李夢瑩,王耀群,孫夢雨,邱潔萍,陳博

    (1.安徽醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,安徽 合肥 230012;2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 普通外科,安徽 合肥 230000)

    胃癌(gastric cancer,GC)是人類消化道中最常見的惡性腫瘤之一[1],根據(jù)全球癌癥統(tǒng)計分析數(shù)據(jù),GC已成為第五大最常被診斷出的癌癥和 第三大癌癥致死的原因,是全球性的重要健康危 機[2]。臨床上以手術(shù)切除、化療、放療或聯(lián)合靶向為主的GC治療方法難以徹底清除腫瘤病灶,腫瘤易進展或復(fù)發(fā)且毒副作用大,患者的5年生存率低至10%~15%[3-4],因此探索新的更有效的治療方法成為亟待解決的重大課題。

    近年來腫瘤免疫治療作為一種新型的治療方法,基于人體的免疫系統(tǒng),利用免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮抗腫瘤作用,已經(jīng)表現(xiàn)出顯著的臨床效果瘤生長、發(fā)展和患者預(yù)后結(jié)局均與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤情況相關(guān)[5-7]。2018年,James P.Allison和Tasuku Honjo 等就因在“抑制免疫檢查點(CTLA-4、PD-1)抗腫瘤研究”中作出卓越貢獻而獲得諾貝爾生理學(xué)獎。此外,已有研究表明,M2巨噬細(xì)胞在膀胱癌組織中富集,促進血管生成,可作為膀胱癌潛在的免疫治療靶點[8],有關(guān)自然殺傷細(xì)胞的多種腫瘤免疫治療也已進入臨床試驗階段[9]。由此可見,挖掘免疫細(xì)胞相關(guān)靶標(biāo)是優(yōu)化腫瘤免疫治療的有效路徑[10-11]。

    過去這方面的研究多通過流式細(xì)胞術(shù)或免疫組織化學(xué)來評估腫瘤中浸潤的免疫細(xì)胞的組成,但這些方法都存在不足,并有可能導(dǎo)致細(xì)胞丟失或結(jié)果失真。Newman等[12]于2015年設(shè)計出了新的生物信息學(xué)算法—CIBERSORT,通過估計RNA轉(zhuǎn)錄本的相對子集和復(fù)雜組織標(biāo)準(zhǔn)化基因表達數(shù)據(jù)來鑒定細(xì)胞類型和被測樣本的免疫細(xì)胞組成。該法已經(jīng)在多種惡性腫瘤中進行了很好的驗證[13],可以廣泛地應(yīng)用于惡性腫瘤發(fā)病機制、腫瘤免疫等過程的生物信息學(xué)挖掘。另有研究表明,免疫治療與化療聯(lián)合在多種腫瘤治療中效果顯著,尋找腫瘤免疫的基因標(biāo)志物已經(jīng)成為當(dāng)下腫瘤治療的研究熱點[14-15]。而作為鑒定與疾病相關(guān)的基因模塊和關(guān)鍵基因的理想方法,加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)基于大樣本基因表達數(shù)據(jù)尋找潛在生物標(biāo)志物,已經(jīng)在眾多研究中被用來對宮頸癌、甲狀腺乳頭狀癌等惡性腫瘤進行分析,并成功篩選出了有效的基因靶點[16-17]。

    綜上,為尋找可靠的GC相關(guān)免疫細(xì)胞相關(guān)基因靶標(biāo),從而優(yōu)化GC患者的預(yù)后,本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫下載GC的mRNA表達數(shù)據(jù),并使用CIBERSORT算法逐一測算樣品的免疫細(xì)胞組成,構(gòu)建WGCNA,結(jié)合生存分析獲取其與GC預(yù)后的相關(guān)性并用外部數(shù)據(jù)庫加以驗證,鑒定出GC免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)預(yù)后基因,為進一步明確潛在的GC免疫治療靶點提供理論依據(jù)。

    1 資料與方法

    1.1 數(shù)據(jù)的采集

    本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載了共407例基因轉(zhuǎn)錄表達譜數(shù)據(jù),其中包括癌組織樣本375例,癌旁組織樣本32例。GC樣本臨床信息包含性別、生存時間、生存狀態(tài)、臨床分期、腫瘤分級等。人類癌癥標(biāo)本核心資源庫的科研人員在采集、處理和分派癌組織標(biāo)本和癌旁組織標(biāo)本時,去除了患者的身份信息,因此不存在倫理問題。

    1.2 腫瘤浸潤免疫細(xì)胞評估

    利用R語言的limma包,對GC組織及正常組織轉(zhuǎn)錄本的mRNA表達譜數(shù)據(jù)進行校正。腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的評估采用CIBERSORT算法,反卷積法處理標(biāo)記基因表達值,估算腫瘤組織中免疫細(xì)胞占比。這些免疫細(xì)胞包括M0 巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞、靜止記憶性CD4 T細(xì)胞、CD8 T細(xì)胞、活化記憶性CD4 T細(xì)胞、調(diào)節(jié)型T細(xì)胞、記憶性B細(xì)胞等 22種。為提高準(zhǔn)確度,以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)對樣本進行篩選,繪制所有符合條件的樣本中每種免疫細(xì)胞占比柱狀圖,免疫細(xì)胞間的相關(guān)性熱圖和GC組織與正常組織樣本免疫細(xì)胞占比的小提琴圖。

    1.3 腫瘤組織中高含量免疫細(xì)胞的生存分析

    結(jié)合從TCGA下載的患者臨床信息,合并免疫細(xì)胞矩陣和生存時間,對在腫瘤組織中含量顯著偏高的11種免疫細(xì)胞進行批量化生存分析。根據(jù)免疫細(xì)胞水平中位值將患者分為高、低浸潤組,采用Kaplan-Meier法計算其與生存的相關(guān)性,使用R語言的survival包繪制生存曲線。

    1.4 WGCNA 模塊構(gòu)建及可視化

    WGCNA技術(shù)是一種為分析基因表達數(shù)據(jù)而建立的高通量數(shù)據(jù)挖掘算法。相較于一維分子生物學(xué)的研究方法,其構(gòu)建的基因模塊幾乎覆蓋了人類的所有基因,對生物系統(tǒng)的展示更加精準(zhǔn)。本研究利用R語言中WGCNA包進行了基因共表達網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與模塊鑒定。首先將數(shù)據(jù)導(dǎo)入R語言進行初步篩選,去除離群值以保證可信度,然后繪制樣本層次聚類樹,并依據(jù)差異基因表達譜定義相似度表達矩陣,對基因進行相似性度量。

    具體而言,用Sij表示基因i和基因j的表達相似度,通過皮爾森相關(guān)系數(shù)(Pearson correlation coefficient,Pcc)計算獲得相關(guān)系數(shù)Sij=|cor(i,j)|。由此構(gòu)成相似度矩陣S=[Sij]。對任意的兩個基因i、j之間的關(guān)聯(lián),它們的臨接系數(shù)aij為aij= power(Xij,β)≡|Xij|β,即對相關(guān)系數(shù)進行次方的冪指數(shù)加權(quán),得到軟閾值β。對最佳β值的選擇,應(yīng)當(dāng)使得R2值趨向于穩(wěn)定且R2>0.8[18]。既遵循無尺度網(wǎng)絡(luò)原則,又確保不同模塊中基因間鏈接程度較高,以包含足夠的生物信息。采用拓?fù)渲丿B技術(shù)(Topological Overlap Measure, TOM)對衡量基因間的關(guān)聯(lián)性,將鄰接矩陣|Xij|轉(zhuǎn)換為拓?fù)渚仃嚘?|ωij|[19]?;騣和基因j之間若無直接相關(guān)關(guān)系,且又無第三方基因?qū)⑦@兩個基因間接連接起來,即視為兩個基因之間相關(guān)性為0(TOM=0),兩基因之間的差異度為(1-TOM)?;蛑g的相關(guān)性不僅包括兩個相關(guān)系數(shù),還包括第三方基因建立的相關(guān)性,所得結(jié)果與實際情況更加吻合,為共表達網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

    基于蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的算法來完成共表達網(wǎng)絡(luò)中模塊的識別。將每個模塊中基因最小數(shù)目定義為5 0,應(yīng)用基于層次的模塊識別,以差異度值(1-TOM)為基礎(chǔ),使用動態(tài)剪接法和聚類分析探測基因的功能模塊。基因由樹中的葉節(jié)點代表,密集連接的分支代表了接近的基因,函數(shù)“moduleEigengenes”計算得到的模塊特征基因(module eigengene,ME)為模塊的第一主成分,即該模塊基因表達譜代表。若模塊間的ME相關(guān)性>0.75,則表示它們有類似的表達譜,應(yīng)將該模塊合并。將合并后的模塊與免疫細(xì)胞建立關(guān)聯(lián)分析,繪制模塊—免疫細(xì)胞相關(guān)熱圖,根據(jù)模塊中每個基因的基因與模塊之間相關(guān)性值(module membership,MM)和基因與免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性絕對值(gene significance,GS)得到與預(yù)后免疫細(xì)胞相關(guān)性最顯著的核心模塊。

    1.5 核心模塊中差異基因的生存分析

    利用R語言survival包,分別對與靜止記憶性CD4 T細(xì)胞和調(diào)節(jié)型T細(xì)胞相關(guān)的核心模塊中的差異基因進行生存分析。依據(jù)GC組織中差異基因表達量中位數(shù)作為分界,根據(jù)基因表達量將患者分為高低表達組,采用Kaplan-Meier、Log-rank法計算基因與患者總生存期的相關(guān)性,并使用R語言的survival包進行生存曲線繪制,根據(jù)計算出的P<0.05篩選差異生存基因。

    1.6 基于外部數(shù)據(jù)庫驗證差異生存基因的預(yù)后意義

    Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫是進行生存分析最權(quán)威的網(wǎng)站之一,包含了多個平臺的GC 數(shù)據(jù),基于在線Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫,驗證數(shù)據(jù)庫中包含的關(guān)鍵基因的預(yù)后效能。通過NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載了GSE84437,GSE57303,GSE62254等多組GEO數(shù)據(jù)庫中獨立數(shù)據(jù)集來驗證關(guān)鍵基因的預(yù)后 意義。

    1.7 差異生存基因的通路富集分析

    為了注釋和分析生存差異基因的生物學(xué)功能,應(yīng)用基因本體論富集分析(geneontology enrichment analysis,GO)、京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)進行途徑注釋和可視化,對P<0.05的富集結(jié)果予以保留。其中GO分析分別選取生物過程(biological process,BP),細(xì)胞成分(cell component,CC)和分子功能(molecular function,MF)3大類展示富集結(jié)果;KEGG利用其全面的數(shù)據(jù)庫資源,對基因信息對更高層次和更復(fù)雜細(xì)胞活動以及生物體行為做出量化推測。

    2 結(jié) 果

    2.1 GC 中浸潤免疫細(xì)胞情況

    在獲得的所有樣本中,有258例GC樣本和18例正常樣本符合CIBERSORT標(biāo)準(zhǔn),即P<0.05。在應(yīng)用CIBERSORT算法分析數(shù)據(jù)后,利用R語言作圖。首先,用一種顏色代表一種免疫細(xì)胞類型,用柱形的長度代表一種類型免疫細(xì)胞的相對含量,各樣本不同類型免疫細(xì)胞的相對含量之和為1,繪制出了22種免疫細(xì)胞在每個樣本中的柱狀占比圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn),巨噬細(xì)胞(M0)、中性粒細(xì)胞、活化的CD4+記憶性T細(xì)胞、靜止記憶性CD4 T細(xì)胞、調(diào)節(jié)型T細(xì)胞等11種免疫細(xì)胞在腫瘤組織中明顯高于正常組織(圖1)。使用Pearson相關(guān)分析計算258例GC樣本中22種免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)度,繪制出每對免疫細(xì)胞間的相關(guān)性熱圖,紅色代表協(xié)同,藍色代表拮抗,相關(guān)性隨著顏色的加深而變高。在GC組織中,構(gòu)成比相關(guān)系數(shù)較大的免疫細(xì)胞包括:呈高負(fù)相關(guān)性的靜止記憶性CD4 T細(xì)胞與CD8 T細(xì)胞(r=-0.51),呈高正相關(guān)性的活化記憶性CD4 T細(xì)胞與CD8 T細(xì)胞(r=0.42)等(圖2)。用紅色和藍色代表GC組織和正常組織,橫坐標(biāo)表示免疫細(xì)胞,縱坐標(biāo)表示免疫細(xì)胞浸潤的百分比,繪制GC及正常組織中免疫細(xì)胞浸潤占比小提琴圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn),258例GC樣本和18例正常樣本的漿細(xì)胞、靜息狀態(tài)記憶性CD4 T細(xì)胞、活化狀態(tài)記憶性CD4 T細(xì)胞及輔助性T細(xì)胞等浸潤程度差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001、P=0.013、P=0.001、P=0.012),其中漿細(xì)胞在正常樣本組中的浸潤程度較GC樣本組高,而靜息狀態(tài)記憶性CD4 T細(xì)胞、活化記憶性CD4 T細(xì)胞及輔助性T細(xì)胞正常樣本組中的浸潤程度低于GC樣本組(圖3)。

    2.2 GC 免疫細(xì)胞浸潤與預(yù)后的關(guān)系

    對于上述在腫瘤組織中含量顯著高于正常組織的11種免疫細(xì)胞,根據(jù)免疫細(xì)胞浸潤值將患者分為高、低浸潤組。采用Kaplan-Meier與Log-rank法進行生存分析。最后發(fā)現(xiàn)靜止記憶性CD4 T細(xì)胞和調(diào)節(jié)型T細(xì)胞的浸潤情況與GC患者生存率呈明顯相關(guān)(P=0.021、P=0.013)。其中靜止記憶性CD4 T細(xì)胞構(gòu)成比例高者生存期短,而調(diào)節(jié)型T細(xì)胞構(gòu)成比例高者生存期長(圖4)。

    圖1 所有標(biāo)本中22 種免疫細(xì)胞占比的柱狀圖Figure 1 Histogram of the proportions of 22 immune cells in all specimens

    圖2 GC 組織樣本中每種免疫細(xì)胞占比相關(guān)圖Figure 2 Correlation diagram of the proportion of each immune cell in GC tissue samples

    圖3 GC 及正常組織中免疫細(xì)胞占比小提琴圖Figure 3 Violin diagram of the proportion of immune cells in GC and normal tissues

    圖4 免疫細(xì)胞構(gòu)成水平的Kaplan-Meier 生存曲線 A:靜止記憶性CD4 T 細(xì);B:調(diào)節(jié)型T 細(xì)胞Figure 4 Kaplan-Meier curves of different levels of immune cell composition A: T cells CD4 memory resting; B: T cells regulatory

    2.3 共表達網(wǎng)絡(luò)分析及可視化

    在R語言中利用WGCNA包進行共表達網(wǎng)絡(luò)分析及可視化。首先對從樣本進行去除離群值的層次聚類繪制,并匹配相應(yīng)的免疫細(xì)胞信息,從而將免疫浸潤和共表達網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系起來。結(jié)果顯示,已鑒定出的兩類預(yù)后相關(guān)免疫細(xì)胞,即靜止記憶性CD4 T細(xì)胞和調(diào)節(jié)型T細(xì)胞與基因模塊的匹配度均較好(圖5)。以0.9為cutoff值,選取β軟閾值為5 構(gòu)建共表達網(wǎng)絡(luò),既保證網(wǎng)絡(luò)接近于無尺度網(wǎng)絡(luò),又使其包含足夠的生物信息(圖6)。利用不同基因的相關(guān)性構(gòu)建分層聚類樹,通過動態(tài)剪接法和聚類分析,將相似的基因歸類到同一模塊中,最終得到5個基因模塊,其中綠松石基因模塊的范圍最廣泛(圖7)。繪制熱圖對這5個基因模塊和不同類型的免疫細(xì)胞進行相關(guān)性分析,每一行對應(yīng)一個模塊,每一列對應(yīng)一種免疫細(xì)胞,其中每一個單元對應(yīng)相關(guān)值??梢园l(fā)現(xiàn),綠松石模塊中的基因與已鑒定出的兩類預(yù)后相關(guān)免疫細(xì)胞即靜止記憶性CD4 T細(xì)胞(r=0.27,P<0.001)和調(diào)節(jié)型T細(xì)胞(r=0.19,P=0.003)相關(guān)性最為顯著(圖8),因此將從綠松石模塊中篩選這兩類免疫細(xì)胞的浸潤調(diào)控基因。

    圖5 樣本層次聚類樹結(jié)合免疫細(xì)胞表達量分析圖Figure 5 Analysis of sample level clustering combined with expression level of the immune cells

    圖6 WGCNA 分析軟閾值(β)的確定Figure 6 Determination of soft threshold (β) for WGCNA analysis

    圖7 GC 的共表達基因模塊聚類樹圖Figure 7 A cluster tree diagram of co-expressed gene modules for GC

    圖8 熱圖分析模塊基因與免疫細(xì)胞相關(guān)性Figure 8 Heat map analysis of the correlation between module genes and immune cells

    2.4 GC 免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)預(yù)后基因的鑒定

    對與記憶性CD4 T細(xì)胞和調(diào)節(jié)型T細(xì)胞相關(guān)的綠松石模塊基因進行生存分析。為了縮小與疾病無關(guān)的死亡因素的干擾,本數(shù)據(jù)集將長于10年的生存期默認(rèn)為10年,并將患者的生存狀態(tài)設(shè)為存活。最后共分析了355例GC患者的總生存期,共鑒定得到了3個與記憶性CD4 T細(xì)胞相關(guān)(CGB5、LINC00106、LINC00392)和一個與調(diào)節(jié)型T細(xì)胞相關(guān)(UPK1B)的生存基因(均P<0.05),其中CGB5、LINC00392、UPK1B的高表達與不良預(yù)后相關(guān),而LINC00106的高表達則有益于患者預(yù)后(圖9)。

    2.5 差異生存基因的預(yù)后驗證

    基于在線Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)CGB5、UPK1B的高表達均與GC的不良預(yù)后明顯相關(guān)(P<0.05)。通過NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)下載GSE84437,GSE57303,GSE62254等多組GEO數(shù)據(jù)庫中獨立數(shù)據(jù)集,驗證篩選出的關(guān)鍵基因的預(yù)后意義,生存分析發(fā)現(xiàn)CGB5和UPK1B的表達與G C 患者的預(yù)后均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05),證明了其具有可靠的預(yù)后相關(guān)性。然而,由于包含LINC00106和LINC00392的數(shù)據(jù)集在現(xiàn)行數(shù)據(jù)庫中收錄過少且樣本數(shù)目明顯不足,我們僅發(fā)現(xiàn)LINC00106的高表達與GC的不良預(yù)后呈負(fù)相關(guān),但尚無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.251)。利用lnCAR(https://lncar.renlab.org),基于多組GEO數(shù)據(jù)集,發(fā)現(xiàn)相比于正常組織,LINC00106在GC等消化道腫瘤中均呈低表達,而LINC00392在GC等消化道腫瘤中均呈高表達,這與先前的發(fā)現(xiàn)一致,并在一定程度上反映了兩者在GC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用(圖10)。

    2.6 基因的功能富集分析

    對得到的4 個預(yù)后差異基因執(zhí)行包括G O 和KEGG途徑在內(nèi)的功能分析。GO富集分析通過對差異基因進行GO terms富集度統(tǒng)計學(xué)的分析,計算出差異基因FDR值(q-value),最后按照BP,MF和CC 3個層面對基因進行注釋和排序。GO分析表明:這些基因主要參與的生物過程包括:肌肉系統(tǒng)過程、細(xì)胞器裂變、DNA?結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性,RNA聚合酶II?特異性和糖胺聚糖結(jié)合,主要的CC有:細(xì)胞外基質(zhì)和膠原蛋白細(xì)胞外基質(zhì)。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn),這些基因主要富集于細(xì)胞周期和血管平滑肌收縮過程(圖11)。

    圖9 Kaplan-Meier 法分析4 個關(guān)鍵基因?qū)C 患者預(yù)后的影響Figure 9 Kaplan-Meier analysis of the impact of the 4 key genes on the prognosis of GC patients

    圖10 4 個關(guān)鍵基因在外部數(shù)據(jù)庫的預(yù)后效能驗證Figure10 Prognostic efficacy verification of 4 key genes in external databases

    圖11 預(yù)后相關(guān)基因的GO 和KEGG 功能富集分析 A:GO 途徑;B:KEGG 途徑Figure 11 Functional enrichment analysis of GO and KEGG based on prognostic related genes A: GO pathway; B: KEGG pathway

    3 討 論

    GC是全球范圍內(nèi)人類最高發(fā)的惡性腫瘤之一,但由于前期癥狀不明顯,大部分患者確診時腫瘤已經(jīng)發(fā)展到中晚期[1],且治療后后期復(fù)發(fā)率較高,預(yù)后效果較差,致死率居高不下[20]。近年來,腫瘤的免疫學(xué)治療受到極大的關(guān)注[21]。GC腫瘤微環(huán)境高度復(fù)雜且異質(zhì),腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用[22],其浸潤的類型和比例與患者臨床結(jié)局密切相關(guān)[23]。因此探究免疫細(xì)胞相關(guān)的生物標(biāo)志物對改善GC患者的預(yù)后具有重要意義[24]。

    本研究首先通過CIBERSORT算法,結(jié)合TCGA數(shù)據(jù)庫中患者的詳細(xì)臨床信息,篩選出了浸潤情況與GC患者生存率呈顯著相關(guān)的兩類免疫細(xì)胞,即靜止記憶性CD4 T細(xì)胞和調(diào)節(jié)型T細(xì)胞。靜止記憶性CD4 T細(xì)胞在細(xì)胞免疫中有重要作用[25],但在腫瘤進展中的意義尚不明確,本研究發(fā)現(xiàn)其浸潤程度與生存呈負(fù)相關(guān),可為后續(xù)研究提供參考。對于調(diào)節(jié)型T細(xì)胞,Li等[26]研究發(fā)現(xiàn)其特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子FOXP3的高表達顯示了GC良好的預(yù)后,這與本研究發(fā)現(xiàn)的高調(diào)節(jié)型T細(xì)胞浸潤預(yù)示著GC更有利的預(yù)后一致。WGCNA作為一種高可信度的高通量數(shù)據(jù)挖掘算法,已成為鑒定疾病相關(guān)基因最可靠的方法之一。Huang等[27]基于WGCNA發(fā)現(xiàn)了3個與GC患者的預(yù)后相關(guān)的基因,有望將其作為GC治療靶標(biāo)。Jiang等[28]利用WGCNA構(gòu)建了1個ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)作為膀胱癌預(yù)后標(biāo)志物。然而根據(jù)對既往文獻的檢索發(fā)現(xiàn)尚未有GC方面的研究將WGCNA用于浸潤免疫細(xì)胞相關(guān)預(yù)后基因的鑒定。本研究創(chuàng)新性地將CIBERSORT算法與WGCNA結(jié)合,基于高通量表達芯片數(shù)據(jù),探索基因網(wǎng)絡(luò)和免疫細(xì)胞浸潤之間的關(guān)聯(lián),挖掘出了與預(yù)后免疫細(xì)胞相關(guān)性最顯著的核心模塊。并通過生存分析鑒定出4個GC預(yù)后相關(guān)的免疫細(xì)胞浸潤調(diào)控基因(CGB5、LINC00106、LINC00392、UPK1B)。

    在這些被篩選出的差異預(yù)后基因中,已有研究表明CGB5和UPK1B在腫瘤進展中發(fā)揮作用。CGB5 在滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤和某些非滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤中異常表達,可以獨立預(yù)測晚期GC患者的總生存率和無復(fù)發(fā)生存率不良;并能促進卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞血管生成擬態(tài)的形成,有望為卵巢癌的治療提供新的靶標(biāo)和思路[29-30]。UPK1B 在膀胱癌中上調(diào),與膀胱癌的腫瘤分期,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)。它通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)途徑,促進膀胱癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移,然而目前UPK1B在GC機制中的作用尚不明確[31]。而基因LINC00106、LINC00392尚無研究顯示與腫瘤相關(guān)。因此,這些基因在消化道腫瘤中的潛在作用以及它們參與的生物學(xué)功能與腫瘤之間的聯(lián)系需要全面研究。

    本研究回顧性地基于已經(jīng)完成的國外公共數(shù)據(jù)庫進行了分析,但由于患者信息獲取不全,一些患有感染、免疫系統(tǒng)疾病或服用抗炎藥的患者也有可能被納入了這項研究,從而干擾了免疫浸潤分析。此外,WGCNA算法本身在獲取基因間相互作用信息時對蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用和甲基化存在依賴,也使本研究仍有一定的局限性。由于現(xiàn)行數(shù)據(jù)庫中收錄過少,本研究尚未完整地驗證LINC00106和LINC00392表達與GC患者預(yù)后的關(guān)系,其作用還有待后續(xù)進一步分析鑒定。

    總之,本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫,運用合理的生物信息方法,在兩類與GC生存率密切相關(guān)的免疫細(xì)胞中鑒定出了4個與GC免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)預(yù)后基因,揭示了腫瘤浸潤的免疫細(xì)胞是GC預(yù)后的重要因素,為GC的早期診斷和治療以及免疫療法研究和新靶向藥的開發(fā)提供了分子依據(jù)。

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