趨化因子CXCL14在不同轉(zhuǎn)移潛能結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)及其與血管生成的關(guān)系

曾仰澤，馬家馳，孫曉雯

（1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 腫瘤外科，安徽 蚌埠 233000；2.甘肅省天水市中醫(yī)院 普通外科，甘肅 天水 741000）

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，全世界每年約有130多萬新發(fā)的結(jié)直腸癌患者。男性結(jié)直腸癌的發(fā)病率居所有惡性腫瘤的第3位，病死率居第4位；在女性中，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率分別是第3位和第2位[1]。近年來，結(jié)直腸癌發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢[2]，轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因，術(shù)后5年大約40%的結(jié)直腸癌出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[3]。因此，揭示結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制并探究有效的治療新方法是治療結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。CXC趨化因子配體14（C-X-C motif chemokine ligand 14，CXCL14）是新近發(fā)現(xiàn)的趨化因子家族的一員，最早從乳腺和腎臟組織中提取得到[4]，能夠激活巨噬細(xì)胞、未成熟樹突狀細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的趨化活性[5]，CXCL14蛋白參與體內(nèi)免疫反應(yīng)，宿主對腫瘤特異免疫的激活以及腫瘤生長的自分泌調(diào)節(jié)等機(jī)制影響腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[6-9]。目前CXCL14在結(jié)直腸癌進(jìn)展、轉(zhuǎn)移方面的作用機(jī)理尚不清楚。本研究目的是探討自分泌及旁分泌的CXCL14對結(jié)直腸癌新生血管的影響機(jī)理，為臨床治療結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移提供潛在的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株本研究采用的大腸癌細(xì)胞株HT-29、WiDr、CaCo-2、Colo-320 和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）購自于購自美國ATCC。

1.1.2 主要試劑重組人CXCL14（rCXCL14）和兔抗人CXCL14 單克隆抗體購自美國R&D 公司。CXCL14 siRNA 購自大連寶生物工程公司。LipofectAMINETM2000 和 Opti-MEM?Ireduced serum medium均購自美國Invitrogen 公司。Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System 購自日本Takara 公司。Diff-Quick 染色液購自北京索萊寶科技有限公司。8 μm 孔徑的Transwell 上室購自美國Corning 公司。BioCoat Matrigel Invasion Chambers購自美國Corning公司。Angiogenesis Assay kit 購自日本Kurabo 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)HT-29 細(xì)胞的培養(yǎng)采用McCoy's培養(yǎng)基，WiDr 細(xì)胞采用MEME 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，CaCo-2 和Colo-320 細(xì)胞應(yīng)用RPMI1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)。HUVEC 用HuMedia-EB2 培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，上述培養(yǎng)基中均加入10% 熱滅活胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和100 μg/mL 的鏈霉素。細(xì)胞放置于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2 d更換培養(yǎng)基，經(jīng)4～8 個(gè)傳代培養(yǎng)后進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 RT-PCR 分析依據(jù)GenBank 提供的CXCL14 基因全序列，應(yīng)用Primer 3 軟件設(shè)計(jì)引物，所有引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。CXCL14（NM_004887）上游引物：5'-GGT TGC CAG AAA AAT GTG CT-3'，下游引物：5'-GTT GGG AAC CTC ACA TGCT T-3'，擴(kuò)增片段長度為189 bp；β-actin（NM_001101）上游引物：5'-CTG GCA CCA CAC CTT CTA CAAT-3'，下游引物：5'-AAT GTC ACG CAC GAT TTC CCG C-3'，擴(kuò)增片段長度為382 bp。42 ℃下30 min 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，94 ℃變性3 min, 94 ℃變性30 s，62 ℃退火45 s，68 ℃延伸60 s，共進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)。經(jīng)采用1.5% 瓊脂糖凝膠對擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳條帶。β-actin 為陽性對照。

1.2.3 Western blot 實(shí)驗(yàn)Cell-Lysis buffer 裂解1×106/mL 的HT-29、WiDr、CaCo-2 和Colo-320 細(xì)胞細(xì)胞提取總蛋白，裂解后的裂解液在1 500r/min、4 ℃下離心10 min 后，采集上清液，Bradford 法測定上清液中的蛋白濃度。在100 ℃、5 min 條件下進(jìn)行蛋白變性，取30 μg 蛋白加入10% 的SDS-PAGE 膠加樣孔內(nèi)后電泳2 h，在250 mA、1 h、30 min 的條件下將電泳后膠板上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，室溫下用5% 脫脂牛奶封閉1 h 后，TBST 緩沖液洗膜3 次， 每次5 min， 然后將PVDF 膜置于含鼠抗人CXCL14 單克隆抗體（稀釋比為1:1 000）的封閉液中孵育2 h，TBST 液再洗膜3 次，每次10 min 后，將膜孵育在二抗溶液（稀釋比例為1:5 000）中，洗膜3 次，ECL 法顯色。應(yīng)用Image J 軟件測定條帶的灰度值。

1.2.4 CXCL14 siRNA 的合成及轉(zhuǎn)染siRNA 序列由銳博科技有限公司提供，CXCL14 siRNA 正向序列：5'-GGG UCC AAA UGC AAG UGC UTT-3'，反向序列：5'-AGC ACU UGC AUU UGG ACC CTT-3'；陰性對照siRNA 正向序列：5-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3'，反向序列：5-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3'。4種結(jié)直腸癌細(xì)胞以5×105/2.5 mL 種植于6 孔的培養(yǎng)皿中過夜，使細(xì)胞附壁。次日，500 μL Opti-MEM?I Reduced Serum Medium 稀 釋200 nmol/L CXCL14 siRNA或?qū)φ誷iRNA，同時(shí)用同樣試劑稀釋10 μL 的LipofectamineTM2000，于室溫下靜置5 min 后，快速將兩者混合，再于室溫下靜置20 min，以便形成 siRNA/LipofectamineTM復(fù)合物。然后將 100 μL 的siRNA/LipofectamineTM復(fù)合物加入到包含結(jié)直腸癌細(xì)胞和培養(yǎng)基的6 孔培養(yǎng)皿的孔中，輕柔搖晃培養(yǎng)皿，混勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h 后，收集細(xì)胞用Western blot 法檢測CXCL14 基因的沉默效果。

1.2.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)WST-1 增殖實(shí)驗(yàn)依據(jù)血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中CXCL14 濃度的分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，其中培養(yǎng)基中加入0 ng/mL 的CXCL14組作為對照組；實(shí)驗(yàn)組又分為1 ng/mL、10 ng/mL和100 ng/mL 的CXCL14+1 μg/mL 的 抗CXCL14抗體5 個(gè)亞組。取對數(shù)生長期的各組結(jié)直腸癌細(xì)胞，按l×l05/mL 的濃度接種于96 孔的培養(yǎng)皿，細(xì)胞完全貼壁后，更換培養(yǎng)基含不同濃度的CXCL14或抗CXCL14 抗體后孵育72 h， 每孔內(nèi)加入 100 μL 的 Cell Titer 96 Aqueous One Solution Reagent 液后置于37 ℃的孵育箱中4 h，在酶標(biāo)儀上測定波長490 nm 每孔的吸光度值。

1.2.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)Matrigel 基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)基按1:5 的比例在4 ℃下混勻，吸取50 μL加入底部有多個(gè)8 μm 微孔的Transwell 小室底部。實(shí)驗(yàn)前30 min 再取50 μL 稀釋的Matrigel 基質(zhì)膠涂于Transwell 小室底部成膠，無血清培養(yǎng)基洗Transwell 小室使其基底膠膜水化。HUVEC以2×105/500 μL 的密度接種到成膜的Transwell小室內(nèi)，將Transwell 小室置于24 孔的培養(yǎng)板的下室內(nèi)，下室中加入1 000 μL 含有20%FBS、1、10、100 ng/mL 的 CXCL14、100 ng/mL 的CXCL14+1 μg/mL 的CXCL14 抗 體的培養(yǎng)基，在37 ℃培養(yǎng)箱中，孵育24 h。取出Transwell 小室，用棉簽擦掉小室內(nèi)未濾過細(xì)胞，用PBS 液洗3 次，5% 戊二醛固定后，加入Giemsa 染色30 min，再次用PBS 洗2 次，將Transwell 小室在顯微鏡下（×200）計(jì)數(shù)5 個(gè)隨機(jī)視野穿膜的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)。

1.2.7 血管新生實(shí)驗(yàn)人成纖維細(xì)胞與HUVEC 接種在24 孔的培養(yǎng)盤中共同培養(yǎng)，第2 天更換培養(yǎng)基并加入不同濃度的CXCL14，再于24 孔培養(yǎng)盤中均放入用帶有0.45 μm 微孔聚碳酸酯膜底部覆蓋的Transwell 小室，或不加CXCL14，但微孔內(nèi)含2×104/mL HT-29 或CaCo-2 的Transwell 小室，組成共同培養(yǎng)系統(tǒng)。每天更換培養(yǎng)液，共同培養(yǎng)12 d 后，去除培養(yǎng)液，用PBS 液清洗培養(yǎng)孔3 次后用10% 甲醛固定30 min，然后用抗CD31 抗體進(jìn)行血管染色后自然干燥。在顯微鏡下取10 個(gè)不同區(qū)域的新生血管拍照，然后每張照片用血管分析軟件（日本Kurabo 公司）計(jì)算每張圖片的血管總面積或總長度，以像素表示新生血管總長度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組內(nèi)檢驗(yàn)采用重復(fù)測量方差分析，組間差異性比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CXCL14 mRNA 與蛋白在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示，CXCL14 mRNA和蛋白表達(dá)于高肝轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29和WiDr，而在CaCo-2、Colo-320低肝轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌細(xì)胞中未檢測到表達(dá)（圖1A）；Western blot檢測結(jié)果顯示，CXCL14蛋白表達(dá)于高肝轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌細(xì)胞株（HT-29和WiDr），而在低肝轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌細(xì)胞中無表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參，Image軟件對圖像進(jìn)行半定量結(jié)果顯示，HT-29和WiDr細(xì)胞CXCL14的表達(dá)量分別為19 120±1 545、17 395±2 169，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.328，P=0.072） （圖1B）。

2.2 CXCL14 基因沉默結(jié)果

圖1 CXCL14在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)檢測 A：CXCL14 mRNA表達(dá)；B：CXCL14 蛋白表達(dá)Figure 1 Detection of CXCL14 expression in colorectal cancer cell lines A: CXCL14 Mrna expression; B: CXCL14 protein expression

圖2 CXCL14 基因沉默作用檢測Figure 2 Detection of effects of CXCL14 gene silencing

4株結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染CXCL14 siRNA后，HT-29和WiDr細(xì)胞CXCL14蛋白表達(dá)被抑制，而陰性對照組（controlsi RNA）和未轉(zhuǎn)染組（untreated）仍表達(dá)CXCL14。CXCL14 siRNA轉(zhuǎn)染與否，CaCo-2、Colo-320細(xì)胞均無CXCL14表達(dá)（圖2）。

2.3 CXCL14 對HUVEC 增殖的影響

CXCL14 以濃度遞增的方式增強(qiáng)HUVEC 的增殖，0、1、10、100 ng/mL CXCL14作用后的吸光度值分別為：1.13±0.12、1.49±0.093、1.76±0.142、2.11±0.106；CXCL14抗體能夠抑制CXCL14對HUVEC增殖的增強(qiáng)作用（吸光度值：1.17±0.03）（圖3）。

2.4 CXCL14 對HUVEC 遷移的影響

CXCL14 以濃度遞增的方式提升HUVEC 的遷移能力， 0、1、10、100 ng/mL CXCL14作用后的遷移細(xì)胞數(shù)分別為：（1 5.3±1.4）、（20.6±2.0）、（24.9±1.9）、（31.5±2.6）個(gè)；CXCL14抗體能夠拮抗CXCL14的作用，100 ng/mL CXCL14+CXCL14 抗體作用后的遷移細(xì)胞數(shù)為（14.7±2.3）個(gè)（圖4）。

圖3 不同濃度CXCL14 對HUVEC 增殖的影響Figure 3 The effects of different concentrations of CXCL14 on proliferation of HUVECs

圖4 不同濃度CXCL14 對HUVEC 遷移的影響Figure 4 The effects of different concentrations of CXCL14 on migration of HUVECs

2.5 CXCL14 對HUVEC 血管生成的影響

CXCL14能夠促進(jìn)新生血管的形成，并與濃度呈依賴性，0、1、10、100 ng/mL CXCL14作用后CD31染色的像素值分別為：67 000±8 760、82 000± 7 054、110 000±13 075、129 000±11 009）；CXCL14抗體能夠拮抗CXCL14的作用，100 ng/mL CXCL14+CXCL14抗體作用后的CD31染色的像素值為68 329±12 698（圖5）。

2.6 不同表達(dá)CXCL14 的結(jié)直腸癌細(xì)胞對HUVEC 血管生成的影響

結(jié)直腸癌細(xì)胞株H T-2 9 表達(dá)CXCL14，而CaCo-2細(xì)胞株不表達(dá)CXCL14，為觀察不同表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞對HUVEC新生血管的影響，在包含成纖維細(xì)胞+HUVEC的24孔培養(yǎng)盤上放置底部覆蓋聚碳酸酯膜帶有0.45 μm微孔的Transwell，內(nèi)分別置有1×104/mL的HT-29或CaCo-2結(jié)直腸癌細(xì)胞組成共同培養(yǎng)系統(tǒng)，共同孵育12 d后，結(jié)果顯示，與HT-29細(xì)胞共培養(yǎng)組的CD31像素值為148 765±17 000，而與CaCo-2細(xì)胞共培養(yǎng)組、無結(jié)直腸癌細(xì)胞對照組CD31像素值明顯降低，分別為100 765±13 054、67 062±9 760；與比較轉(zhuǎn)染CXCL14 siRNA的HT-29細(xì)胞共培養(yǎng)組的CD31像素值也明顯降低，其值為113 250±11 009（圖6）。

圖5 不同濃度CXCL14 對HUVEC 血管生成的影響Figure 5 The effects of different concentrations of CXCL14 on angiogenesis of HUVECs

圖6 不同CXCL 14 表達(dá)水平的結(jié)直腸癌細(xì)胞對HUVEC 血管生成的影響Figure 6 The effects of colorectal cancer cells with different CXCL14 expression levels on angiogenesis of HUVECs

3 討 論

趨化因子是器官形成和免疫防御過程中細(xì)胞遷移的重要調(diào)控因子，CXCL14是趨化因子CXC家族的新成員，CXCL14參與體內(nèi)的多種生物學(xué)功能的調(diào)控，如腫瘤相關(guān)血管的形成、炎癥免疫反應(yīng)、宿主對腫瘤特異度免疫的激活以及腫瘤的自分泌調(diào)節(jié)等[10-14]。近期CXCL14在腫瘤方面的研究表明，CXCLl4與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，CXCL14在卵巢癌、肺癌、宮頸癌組織中的表達(dá)減少或者缺失[15-17]，在乳腺癌中CXCL14蛋白的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有負(fù)相關(guān)性[18]。而在胃癌，肝癌及直腸癌中存在著高表達(dá)[19-21]。趨化因子CXCL14的功能為細(xì)胞增殖、分化、遷移的調(diào)控因子[17]。

前期通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)確定了4株結(jié)直腸癌細(xì)胞的肝轉(zhuǎn)移能力，分為高肝轉(zhuǎn)移株（HT-29和WiDr）和低肝轉(zhuǎn)移株（CaCo-2和Colo-320）[22]，這為本研究奠定了良好基礎(chǔ)。本次研究結(jié)果表明：CXCL14基因和蛋白的表達(dá)與結(jié)直腸癌細(xì)胞的肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，即CXCL14只表達(dá)于高肝轉(zhuǎn)移細(xì)胞株HT-29和WiDr，而在低肝轉(zhuǎn)移株CaCo-2和Colo-320則未檢測到表達(dá)。Zeng等[20]的研究證實(shí)CXCL14在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著高于正常的大腸組織并與肝轉(zhuǎn)移相關(guān)，上述研究表明CXCL14的表達(dá)與結(jié)直腸癌的肝轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。為了進(jìn)一步研究CXCL14在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制，本團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)檢測CXCL14對血管內(nèi)皮細(xì)胞增生和遷移的影響，結(jié)果顯示CXCL14以濃度遞增的方式促強(qiáng)化血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。新生血管在腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，為闡明CXCL14對腫瘤新生血管的作用，本研究纖維細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞在體外孵育新生血管，發(fā)現(xiàn)CXCL14能夠明顯提升新生血管的生成。為進(jìn)一步探究微環(huán)境中結(jié)直腸癌細(xì)胞起源的CXCL14對腫瘤新生血管的影響，本研究創(chuàng)造性的運(yùn)用不同表達(dá)CXCL4的癌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建雙層培養(yǎng)系統(tǒng)表明腫瘤微環(huán)境中結(jié)直腸癌細(xì)胞起源的CXCL14能夠上調(diào)腫瘤新生血管的生成。另有研究[23]表明，趨化因子CXCL14通過上調(diào)MMP-2促進(jìn)了乳腺癌SKOV-3細(xì)胞的遷移。分析上述結(jié)果，CXCL4在結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移中通過強(qiáng)化血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移而上調(diào)腫瘤新生血管的生成，促進(jìn)了結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移。CXCL14促進(jìn)腫瘤生長的效果取決于表達(dá)CXCL14的細(xì)胞類型，腫瘤間質(zhì)中的成纖維細(xì)胞表達(dá)CXCL14具有促進(jìn)腫瘤生長的效果[24]。在乳腺癌中CXCL14 mRNA在腫瘤間質(zhì)中的表達(dá)升高是患者預(yù)后不良的獨(dú)立因素[25]。此外，在人前列腺癌中成纖維細(xì)胞中過表達(dá)的CXCL14可促進(jìn)前列腺癌增殖、腫瘤新生血管的形成以及巨噬細(xì)胞浸潤，其機(jī)制可能是過表達(dá)的CXCL14與成纖維細(xì)胞共同作用促進(jìn)了前列腺癌細(xì)胞的增生和侵襲[26]。Pelicano等[27]的研究中指出，CXCL14 介導(dǎo)ROS-活化蛋白-1通路可調(diào)節(jié)線粒體功能和活性氧應(yīng)激能力促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移，乳腺癌細(xì)胞內(nèi)線粒體呼吸鏈紊亂ROS上調(diào)導(dǎo)致新一代細(xì)胞亞克隆進(jìn)而激活細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)和侵襲 。還有研究表明低分化大腸腺癌CXCL14表達(dá)明顯高于中高分化大腸腺癌，高臨床分期大腸腺癌CXCL14的表達(dá)高于低臨床分 期[28-30]的大腸腺癌。

綜上所述，CXCL14在結(jié)直腸癌的表達(dá)與其轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，CXCL14通過提升腫瘤新生血管促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移，為此，通過阻斷CXCL14的表達(dá)進(jìn)而達(dá)到抑制結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移提供了潛在的治療靶點(diǎn)。