羅伊氏乳桿菌的抑菌能力及其對(duì)肉仔雞盲腸內(nèi)容物菌群的影響

劉 瀅 劉雪連* 魏秀蓮 婁迎霞 李晟碩

1.北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司飼用微生物工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100192；2.北京市飼料監(jiān)察所，北京100107

羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）是一種存在于人和動(dòng)物腸道中具有抑制胃腸道病原菌繁殖、調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道菌群作用的飼用益生菌[1]。隨著飼料中促生長(zhǎng)類抗生素的禁用，羅伊氏乳桿菌作為飼用微生態(tài)制劑開發(fā)具有較高的應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)潛力。雛雞因生長(zhǎng)迅速、消化系統(tǒng)發(fā)育不完善、抵抗力弱等生理特點(diǎn)對(duì)于養(yǎng)雞全期的生產(chǎn)性能有重要影響，通過(guò)益生菌調(diào)節(jié)雛雞盲腸菌群、改善雛雞體質(zhì)有助于提升養(yǎng)殖效益[2-5]。本試驗(yàn)通過(guò)研究羅伊氏乳桿菌的抑菌能力及添加不同水平的羅伊氏乳桿菌制劑對(duì)肉仔雞盲腸內(nèi)容物菌群的影響，為羅伊氏乳桿菌制劑在肉仔雞養(yǎng)殖上的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及儀器

主要試材：羅伊氏乳桿菌DBN-JP 分離自健康仔豬糞便，保藏于大北農(nóng)集團(tuán)飼用微生物工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；羅伊氏乳桿菌CICC6118、CICC6119、CICC6121 購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心；羅伊氏乳桿菌制劑：羅伊氏乳桿菌DBNDBN-JP 活菌數(shù)≥5×1011cfu/g，由北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司飼用微生物工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；試驗(yàn)用基礎(chǔ)飼糧由北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司提供；硫酸黏菌素為市售。

主要儀器：酶標(biāo)儀（Epoch，Thermo）。

1.2 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1）抑菌性能。牛津杯法。

2）試驗(yàn)動(dòng)物及分組。試驗(yàn)地點(diǎn)在大北農(nóng)玉田養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行，試驗(yàn)雞舍及配備的肉仔雞養(yǎng)殖設(shè)備均由該養(yǎng)殖場(chǎng)提供。隨機(jī)選用體重、健康情況基本一致的1日齡AA 白羽肉仔雞720 羽，按體重相近、性別比例相同原則隨機(jī)分為5 組，空白組：飼喂基礎(chǔ)日糧；抗生素組：飼喂基礎(chǔ)日糧+硫酸黏菌素30 g/t；菌粉組：飼喂基礎(chǔ)日糧+羅伊氏乳桿菌菌粉1 kg/t；上清液組：飼喂基礎(chǔ)日糧+羅伊氏乳桿菌上清液1 L/t；發(fā)酵液組：飼喂基礎(chǔ)日糧+羅伊氏乳桿菌發(fā)酵液1 L/t。每組6 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)24 羽雞，試驗(yàn)期42 d，常規(guī)飼養(yǎng)，自由采食，日常管理與免疫程序按雞場(chǎng)常規(guī)辦法進(jìn)行。參照NRC 肉仔雞營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制，前期（1～21日齡）和后期（22～42日齡）日糧成分及營(yíng)養(yǎng)素水平見表1和表2。料型為粉料，基礎(chǔ)日糧中只添加抗球蟲藥鹽霉素（60 μg/mL），不添加其他抗生素。

表1 1～21日齡日糧組成

表2 22～42日齡日糧組成

3）樣品采集與處理。于試驗(yàn)第43 天結(jié)算飼糧，所有雞禁食8 h。試驗(yàn)第44 天對(duì)所有試驗(yàn)雞進(jìn)行稱重并記錄，每個(gè)重復(fù)內(nèi)選取3 羽體重最接近該組平均體重的肉仔雞并標(biāo)記，按順序剪斷其頸靜脈致死，用衛(wèi)生棉線分別將盲腸于兩端結(jié)扎后從外端剪斷，置于密閉的樣品袋中冰凍保存，迅速帶至實(shí)驗(yàn)室，以無(wú)菌方法取腸道食糜于滅菌離心管中，液氮速凍、放于-80 ℃冰箱中保存待測(cè)。

4）盲腸內(nèi)容物菌群。將含有大腸桿菌、乳酸桿菌和沙門氏菌目的片段的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分別建立各菌群的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用實(shí)時(shí)熒光定量方法對(duì)所有樣本拷貝數(shù)進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算不同微生物的數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用IBM SPASS Statistics 24 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），運(yùn)用Dun－can’s 法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，以P<0.05 判斷差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅伊氏乳桿菌的抑菌能力

由表3可知，羅伊氏乳桿菌DBN-JP 對(duì)大腸桿菌k88 的抑菌能力雖低于0.02%硫酸黏菌素，但顯著高于羅伊氏乳桿菌CICC6118、CICC6119 和CICC6121；對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌能力與0.02%硫酸黏菌素相比差異不顯著，顯著高于羅伊氏乳桿菌CICC6118、CICC6119 和CICC6121；對(duì)沙門氏菌的抑菌能力與0.02%硫酸黏菌素相比差異不顯著，但顯著高于羅伊氏乳桿菌CICC6118、CICC6119 和CICC6121。由表4可知，80 ℃加熱15 min 對(duì)羅伊氏乳桿菌DBN-JP 的抑菌能力影響不顯著。

表3 不同樣品對(duì)致病菌的抑菌能力 mm

表4 加熱對(duì)羅伊氏乳桿菌DBN-JP 發(fā)酵液抑菌能力的影響 mm

2.2 羅伊氏乳桿菌對(duì)肉仔雞盲腸內(nèi)容物菌群的影響

由表5可知，與空白組相比，上清液組、發(fā)酵液組盲腸內(nèi)容物中大腸桿菌的數(shù)量顯著降低，菌粉組和發(fā)酵液組盲腸內(nèi)容物中乳酸桿菌數(shù)量顯著提高，發(fā)酵液組盲腸內(nèi)容物中沙門氏菌的數(shù)量顯著降低；與抗生素組相比，上清液組、發(fā)酵液組盲腸內(nèi)容物中大腸桿菌數(shù)量差異不顯著，菌粉組、發(fā)酵液組盲腸內(nèi)容物中乳酸桿菌數(shù)顯著升高，發(fā)酵液組盲腸內(nèi)容物中沙門氏菌數(shù)量差異不顯著，菌粉組、上清液組盲腸內(nèi)容物中沙門氏菌數(shù)量顯著高于抗生素組。

表5 對(duì)肉仔雞盲腸內(nèi)容物菌群的影響

3 討 論

羅伊氏乳桿菌是一種專性異型發(fā)酵菌株，其作為一種飼料添加劑菌株具有廣闊的發(fā)展前景[6]。大量研究[7-9]表明，羅伊氏乳桿菌具有多種生物學(xué)功能，尤其在抑制病原菌生長(zhǎng)和調(diào)節(jié)腸道菌群方面發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，羅伊氏乳桿菌DBN-JP 對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌具有較好的抑菌作用，這與吳惠貞等[10]、朱振軍等[11]的研究結(jié)果相似；但張紫薇[12]的研究表明，羅伊氏乳桿菌J1 對(duì)以大腸桿菌和沙門氏菌為代表的革蘭氏陰性菌和以金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌為代表的革蘭氏陽(yáng)性菌無(wú)抑菌效果，這可能與不同菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和種類具有多樣性有關(guān)。本研究結(jié)果表明，羅伊氏乳桿菌DBN-JP 對(duì)金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑菌能力與0.02%硫酸黏菌素差異不顯著，對(duì)大腸桿菌的抑菌能力略低于0.02%硫酸黏菌素，顯著高于對(duì)照菌株；乳酸菌的耐熱能力直接關(guān)系到其產(chǎn)業(yè)化，良好的耐熱能力有助于乳酸菌在飼料中的添加和應(yīng)用。一般來(lái)說(shuō)，制備顆粒料的溫度一般在75～80 ℃、15 min，本研究發(fā)現(xiàn)，80 ℃加熱15 min 對(duì)羅伊氏乳桿菌DBN-JP 的抑菌能力影響不顯著，這說(shuō)明羅伊氏乳桿菌DBN-JP 發(fā)酵液具有較好的耐熱能力，更適用于產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用需求。

研究[13]發(fā)現(xiàn)，羅伊氏乳桿菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群、改善腸道環(huán)境、維持動(dòng)物腸道微生物的菌群平衡等功能。本研究表明，與空白組相比，飼料中添加羅伊氏乳桿菌DBN-JP 上清液和發(fā)酵液可以顯著降低盲腸內(nèi)容物中的大腸桿菌的數(shù)量，添加發(fā)酵液可顯著降低沙門氏菌的數(shù)量，添加菌粉和發(fā)酵液可以顯著提高盲腸內(nèi)容物中乳酸桿菌數(shù)量；與抗生素組相比，飼料中添加上清液或發(fā)酵液對(duì)盲腸內(nèi)容物中大腸桿菌數(shù)量的抑菌效果和添加抗生素差異不大，添加菌粉或發(fā)酵液盲腸內(nèi)容物中乳酸桿菌數(shù)顯著升高，添加發(fā)酵液對(duì)盲腸內(nèi)容物中沙門氏菌數(shù)量差異不顯著，添加菌粉或上清液對(duì)盲腸內(nèi)容物中沙門氏菌的抑制效果差于抗生素組。這與楊家軍等[14]、WALSHAM 等[15]的研究結(jié)果相似，說(shuō)明飼料中添加羅伊氏乳桿菌DBN-JP 菌粉、發(fā)酵液或上清液具有抑制肉仔雞盲腸內(nèi)容物中大腸桿菌和沙門氏菌，提高乳酸桿菌數(shù)量的有益效果，具有替代抗生素的潛力。

4 結(jié) 論

在肉仔雞日糧中添加羅伊氏乳桿菌DBN-JP 制劑具有抑制病原菌生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)盲腸內(nèi)容物菌群的有益效果。