基于Nrf2/ARE通路研究銀杏葉滴劑對(duì)口腔潰瘍大鼠的作用機(jī)制*

鄭蕾，李國(guó)芳，楊盼盼，單志鳴

鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院，河南 鄭州 450000

近年來(lái)，隨著生活節(jié)奏的加快及飲食結(jié)構(gòu)的改變，口腔潰瘍的發(fā)生率明顯升高。據(jù)臨床調(diào)查[1]，復(fù)發(fā)性口腔潰瘍發(fā)生率已達(dá)20%，對(duì)患者的生活和工作有諸多不便?？谇粷儗儆诳谇火つさ某Ｒ?jiàn)病，其病灶部位常伴隨充血水腫、灼痛感，嚴(yán)重者可影響飲食和語(yǔ)言交流，且根治困難[2-3]。目前，臨床治療口腔潰瘍多以對(duì)癥治療為主，包括補(bǔ)充維生素、抗感染等，但部分患者治療效果不理想，且易產(chǎn)生不良反應(yīng)[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，口腔潰瘍的發(fā)病機(jī)制與局部氧化應(yīng)激關(guān)系密切，氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡則不利于潰瘍面愈合[6-7]。銀杏葉提取物是從銀杏葉中分離的成分，包括銀杏黃銅、銀杏多糖等多種活性成分，具有改善血液循環(huán)、降低血壓、抗氧化等多種生物學(xué)活性[8-10]。本研究通過(guò)建立口腔潰瘍大鼠模型，觀察銀杏葉滴劑(提取物)對(duì)其的治療效果，并初步探討其調(diào)控機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠，50只，8周齡，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2017-0001，飼養(yǎng)于12 h/12 h明暗交替、溫度23～25 ℃、濕度45%～55%的條件下，倫理批號(hào)：20200101。

1.2 藥物及試劑銀杏葉滴劑(德國(guó)Dr.Willmar Schwabe藥廠，批號(hào)：C20201014)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為：A001-1-1、A006-2、A003-3-1)；兔抗鼠酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)、核因子E2相關(guān)因子(nuclear factor erythroid-2 related factor，Nrf2)、血紅素加氧酶1(heme oxygenase，HO-1)單抗及山羊抗兔IgG抗體(美國(guó)SantaCruz公司，批號(hào)分別為：SC-25269、SC-28312、SC-17786、SC-51993)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司，批號(hào)：20190326)；BCA蛋白定量分析試劑盒(Thermo公司，批號(hào)：20190452)。

1.3 儀器7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)；通用型電泳儀、CheniDoc XRS型化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-rad公司)。

2 方法

2.1 模型建立及分組采用化學(xué)灼燒法[11]建立口腔潰瘍大鼠模型：50只大鼠中隨機(jī)選取40只用1%的戊巴比妥鈉(0.025 g·kg-1)以腹腔注射麻醉大鼠，手術(shù)鑷夾取直徑約1 mm的NaOH晶體在大鼠左側(cè)下唇靠口角黏膜處灼燒30 s，然后用無(wú)菌生理鹽水沖洗，形成潰瘍。將造模成功的大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、銀杏葉滴劑低劑量(25 mg·kg-1)組、銀杏葉滴劑中劑量(50 mg·kg-1)組、銀杏葉滴劑高劑量(100 mg·kg-1)組，另取10只大鼠僅作麻醉，不進(jìn)行灼燒造模，作為對(duì)照組。連續(xù)給藥10 d，模型組和對(duì)照組大鼠灌胃等量生理鹽水。

2.2 潰瘍面積測(cè)定各組大鼠分別在給藥前(0 d)，給藥第1天、第3天、第7天，用游標(biāo)卡尺測(cè)量潰瘍最大橫徑(D1)、最大縱徑(D2)，計(jì)算潰瘍面積[12]。

潰瘍面積=0.25×π×D1×D2(π=3.14)

2.3 檢測(cè)潰瘍組織中SOD、GSH-Px、MDA水平末次灌胃給藥1 h后，脫頸椎處死大鼠，立即取潰瘍組織，稱其質(zhì)量，用預(yù)冷生理鹽水制備質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為10%的組織勻漿液，于4 ℃、2 800 r·min-1(離心半徑為10 cm)離心10 min，取上清液，分別采用黃嘌呤氧化酶法、羥胺比色法、硫代巴比妥酸比色法測(cè)定潰瘍組織中SOD、GSH-Px、MDA水平。

2.4 檢測(cè)潰瘍組織中TH、Nrf2、HO-1的蛋白表達(dá)每組隨機(jī)取3只大鼠口腔潰瘍組織，液氮研磨后轉(zhuǎn)至離心管，加入1×磷酸鹽緩沖液勻漿，提取總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，每個(gè)泳道進(jìn)樣 20 μL，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳，電轉(zhuǎn)1.5 h至硝酸纖維素膜，封閉2 h，加入一抗搖床孵育過(guò)夜(4 ℃)，洗膜后加入二抗，常溫孵育2 h，暗室中曝光、顯影。掃描拍照后，應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析，以目的蛋白TH、Nrf2、HO-1與內(nèi)參β-actin的灰度值比值表示其相對(duì)表達(dá)量。

2.5 檢測(cè)潰瘍組織中THmRNA、Nrf2mRNA、HO-1mRNA表達(dá)每組隨機(jī)取3只大鼠的口腔潰瘍組織，Trizol法提取潰瘍組織中總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得互補(bǔ)鏈cDNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)，反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq 13.5 μL，上下游引物各 0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 4.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性3 min，94 ℃變性20 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，重復(fù)42個(gè)循環(huán)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

3 結(jié)果

3.1 大鼠的表觀指標(biāo)40只大鼠全部建模成功，形成直徑約3 mm的潰瘍，表面附黃白色假膜，邊緣充血水腫；模型組大鼠出現(xiàn)毛發(fā)暗淡無(wú)光澤、活動(dòng)頻繁、易激怒、弓背等表型，給予銀杏葉滴劑灌胃干預(yù)后，上述情況均得到緩解。

3.2 不同時(shí)間點(diǎn)大鼠潰瘍面積比較潰瘍面積組間、時(shí)間、交互比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；干預(yù)第0、1天潰瘍面積組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，干預(yù)第3、7天銀杏葉滴劑低、中、高劑量組潰瘍面積均明顯減小(P<0.05)；與銀杏葉滴劑低劑量組比較，干預(yù)第3、7天銀杏葉滴劑中、高劑量組潰瘍面積均明顯減小(P<0.05)，且銀杏葉滴劑高劑量組小于中劑量組；與干預(yù)第0天比較，干預(yù)第1、3天模型組潰瘍面積均無(wú)明顯變化(P>0.05)，干預(yù)第7天其明顯減小(P<0.05)；與干預(yù)第0天比較，干預(yù)第1天銀杏葉滴劑低、中、高劑量組潰瘍面積均無(wú)明顯變化(P>0.05)；干預(yù)第1、3、7天隨時(shí)間的延長(zhǎng)潰瘍面積明顯減小(P<0.05)。見(jiàn)表2和圖1。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)大鼠的潰瘍面積比較

A：模型組；B：銀杏葉滴劑低劑量組；C：銀杏葉滴劑中劑量組；D：銀杏葉滴劑高劑量組

3.3 對(duì)大鼠潰瘍組織中SOD、GSH-Px、MDA水平的影響與對(duì)照組比較，模型組潰瘍組織中SOD、GSH-Px 水平均明顯降低、MDA水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，銀杏葉滴劑低、中、高劑量組潰瘍組織中SOD、GSH-Px均明顯升高、MDA水平明顯降低(P<0.05)；與銀杏葉滴劑低劑量組比較，銀杏葉滴劑中、高劑量組潰瘍組織中SOD、GSH-Px均明顯升高、MDA水平明顯降低(P<0.05)，且銀杏葉滴劑高劑量組優(yōu)于低劑量組。見(jiàn)表3。

表3 對(duì)大鼠潰瘍組織中SOD、GSH-Px、MDA水平的影響

3.4 對(duì)大鼠潰瘍組織中TH、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，模型組潰瘍組織中TH、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，銀杏葉滴劑低、中、高劑量組潰瘍組織中TH、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.05)；與銀杏葉滴劑低劑量組比較，銀杏葉滴劑中、高劑量組潰瘍組織中TH、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.05)，且高劑量的作用效果優(yōu)于低劑量。見(jiàn)表4和圖2。

表4 對(duì)潰瘍組織中TH、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)的影響

圖2 Western Blot法測(cè)定大鼠潰瘍組織HT、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)

3.5 對(duì)大鼠潰瘍組織中THmRNA、Nrf2mRNA、HO-1mRNA表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，模型組潰瘍組織中THmRNA、Nrf2mRNA、HO-1mRNA的相對(duì)表達(dá)均明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，銀杏葉滴劑低、中、高劑量組潰瘍組織THmRNA、Nrf2mRNA、HO-1mRNA的相對(duì)表達(dá)均明顯升高(P<0.05)；與銀杏葉滴劑低劑量組比較，銀杏葉滴劑中、高劑量組潰瘍組織中THmRNA、Nrf2mRNA、HO-1mRNA相對(duì)表達(dá)均明顯升高(P<0.05)，且高劑量作用效果顯著優(yōu)于中劑量。見(jiàn)表5。

表5 對(duì)潰瘍組織中TH mRNA、Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA表達(dá)的影響

4 討論

口腔潰瘍的致病機(jī)制目前仍不明確。研究認(rèn)為，其發(fā)病與免疫異常、維生素缺乏、遺傳改變等多種因素有關(guān)[13-15]。西醫(yī)多通過(guò)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物[16]、免疫調(diào)節(jié)劑改善癥狀，雖然短期內(nèi)可緩解潰瘍的癥狀，但長(zhǎng)期服用不良反應(yīng)較大，且對(duì)復(fù)發(fā)性口腔潰瘍較難控制。中醫(yī)藥在治療口腔潰瘍中有一定優(yōu)勢(shì)[17-18]。研究表明[19-20]，口腔潰瘍病灶部位的損傷不利于口腔黏膜自我修復(fù)。故尋找有效藥物改善病情有重要臨床意義。

本研究采用化學(xué)灼燒法建立口腔潰瘍大鼠模型，40只大鼠全部建模成功，提示該法模型復(fù)制成功率高，且穩(wěn)定性、重復(fù)性好。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠出現(xiàn)毛發(fā)暗淡無(wú)光澤、活動(dòng)頻繁、易激怒、弓背等表現(xiàn)，給予銀杏葉滴劑干預(yù)后，上述情況均得到緩解，說(shuō)明銀杏葉滴劑可緩解潰瘍引起的癥狀。與模型組比較，干預(yù)第3、7天后銀杏葉滴劑低、中、高劑量組潰瘍面積均明顯縮小，且呈劑量依賴性；同時(shí)銀杏葉滴劑低、中、高劑量組潰瘍面積隨干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，潰瘍面積明顯縮小，提示銀杏葉滴劑可有效促進(jìn)大鼠口腔潰瘍的愈合。銀杏葉滴劑低、中、高劑量組潰瘍組織中SOD、GSH-Px水平均升高、MDA水平降低，且呈劑量依賴性，說(shuō)明銀杏葉滴劑可有效改善口腔潰瘍大鼠氧化應(yīng)激狀態(tài)。Bagan等[21]研究表明，活動(dòng)性口瘡性口腔炎患者血清中MDA、GSH-Px 水平升高，與發(fā)生口腔潰瘍相關(guān)。銀杏葉滴劑在臨床上廣泛用于心腦血管疾病防治[22-23]，已有研究證實(shí)[24]，銀杏葉總黃酮可有效降低腦缺血損傷大鼠腦組織MDA水平、升高SOD、GSH-Px活性，抑制腦內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)、減輕腦組織損傷。銀杏葉滴劑中含有銀杏葉總黃酮等活性物質(zhì)，給藥后，口腔潰瘍大鼠潰瘍組織內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)被有效抑制，從而促進(jìn)潰瘍愈合。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組潰瘍組織中THmRNA、Nrf2、HO-1mRNA表達(dá)均低于對(duì)照組，提示大鼠口腔黏膜的發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)；銀杏葉滴劑低、中、高劑量組潰瘍組織中THmRNA、Nrf2mRNA、HO-1mRNA的表達(dá)均較模型組升高，且呈劑量依賴性，提示銀杏葉滴劑可能通過(guò)激活潰瘍組織內(nèi)Nrf2/ARE通路促進(jìn)口腔潰瘍恢復(fù)。Nrf2是Cap′n′collar調(diào)節(jié)蛋白家族重要成員，在炎癥、糖尿病、腫瘤等多種疾病的病理生理過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[25-28]。Nrf2是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激關(guān)鍵因子，當(dāng)機(jī)體接收外界刺激信號(hào)后，其進(jìn)入細(xì)胞核中，與下游ARE結(jié)合從而調(diào)控多種抗氧化因子表達(dá)，抑制氧化反應(yīng)[29-31]。Nrf2/ARE通路激活后，其下游內(nèi)源性保護(hù)因子 HO-1 表達(dá)增加，從而抑制潰瘍病灶的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕口腔黏膜氧化應(yīng)激損傷[32]。

綜上所述，銀杏葉滴劑可有效促進(jìn)大鼠口腔潰瘍愈合，可能與激活潰瘍組織內(nèi)Nrf2/ARE通路，改善氧化應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)，這為臨床上銀杏葉相關(guān)藥物的開(kāi)發(fā)及用于治療口腔潰瘍提供參考。