BMAL1、CLOCK及其靶基因PER1血漿蛋白水平與高血壓的相關(guān)性

方正美，朱麗君，常微微，金岳龍，陳 燕，姚應(yīng)水,2

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院 慢性病防制研究所，安徽 蕪湖 241002；2安徽中醫(yī)藥高等專科學(xué)校 醫(yī)療系，安徽 蕪湖 241003)

高血壓作為一種全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，是腦卒中和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)等心腦血管病發(fā)病的主要危險(xiǎn)因素，其發(fā)病是由遺傳與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。生物體中許多慢性病的病理過(guò)程如胰島素依賴型糖尿病[1]、肥胖[2]和心血管病[1]都伴隨著晝夜節(jié)律基因轉(zhuǎn)錄活性的紊亂。

血壓的晝夜節(jié)律，受到位于下丘腦的視交叉上核的中樞生物鐘調(diào)節(jié)，然而，有研究還發(fā)現(xiàn)這些生物鐘基因在外周組織中同樣表達(dá)并起作用。生物鐘基因主要包括腦和肌肉芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)樣蛋白1基因(brain and muscle aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator like protein 1，ARNTL/BMAL1)、時(shí)鐘基因(clock circadian regulator，CLOCK)、隱色素基因、周期基因1-3(period circadian regulator 1-3，PER1-3)等，其中CLOCK與BMAL1形成異源二聚體復(fù)合物，與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合推動(dòng)轉(zhuǎn)錄進(jìn)行。前期研究報(bào)道，BMAL1、CLOCK和PER1基因敲除的小鼠，其血壓水平下降或升高[1]。亦有研究發(fā)現(xiàn)，在人群中，BMAL1位點(diǎn)rs6486121和CLOCK位點(diǎn)3111CC突變會(huì)增加高血壓患病風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。

上述研究提示了晝夜節(jié)律基因可能參與了高血壓發(fā)生發(fā)展，但是這些研究主要來(lái)源于動(dòng)物模型和基因的轉(zhuǎn)錄水平的研究，關(guān)于其在高血壓患者的蛋白水平卻研究甚少。因此，本研究主要分析BMAL1和CLOCK及其靶基因PER1的蛋白水平與高血壓的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 選取2019年7～8月弋磯山醫(yī)院體檢中心體檢人群151例為研究對(duì)象。根據(jù)血壓水平以及是否服用藥物將研究對(duì)象分為對(duì)照組、高血壓用藥組及高血壓未用藥組。高血壓組的納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《中國(guó)高血壓防治指南(2018年修訂版)》[5]，即收縮壓≥140和(或)舒張壓≥90 mmHg，或既往有高血壓史，年齡>50歲；生活規(guī)律；經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)通過(guò)，研究對(duì)象簽署知情同意書。高血壓組的排除標(biāo)準(zhǔn):繼發(fā)性高血壓；患其他嚴(yán)重心腦血管病，如冠心病、腦卒中、心肌梗死等；近2周有飛行時(shí)差或者夜班輪班。對(duì)照組的納入標(biāo)準(zhǔn)：3次血壓測(cè)量均值收縮壓<140 mmHg且舒張壓<90 mmHg，同時(shí)無(wú)高血壓病史；未患心腦血管病；與高血壓組同居住地；年齡>50歲；生活規(guī)律。對(duì)照組的排除標(biāo)準(zhǔn)：患心腦血管??；近2周有飛行時(shí)差或者夜班輪班。

1.2 檢測(cè)指標(biāo) 收集研究對(duì)象的血壓數(shù)據(jù)、身高、體質(zhì)量，計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)，BMI=體質(zhì)量/身高2(kg/m2)。血壓測(cè)量的方法：受試者需在清晨空腹采血之后10 min內(nèi)測(cè)量血壓，靜坐5 min，采取坐位，用歐姆龍電子血壓計(jì)統(tǒng)一測(cè)量右臂肱動(dòng)脈血壓，重復(fù)測(cè)量3次，取平均值。臨床生化指標(biāo)包括：空腹血糖、三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇(high densitylipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、肝腎功能等生化指標(biāo)，由體檢機(jī)構(gòu)用酶法測(cè)定。

1.3 BMAL1、PER1、CLOCK蛋白水平的測(cè)定 于上午9時(shí)抽取研究對(duì)象空腹外周靜脈血3 mL，用EDTA抗凝管保存并于4 h內(nèi)分裝處理，血漿分離保存在-80℃冰箱。血漿中BMAL1蛋白(武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司，SED468H)、PER1蛋白(武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司，SEM012H)、CLOCK蛋白(武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司，SEQ116Hu)水平檢測(cè)用酶聯(lián)免疫吸附法根據(jù)具體的試劑盒說(shuō)明來(lái)操作，重復(fù)2次，計(jì)算兩個(gè)平行樣的平均值。

2 結(jié)果

2.1 基本資料 54名對(duì)照和97例高血壓患者納入本研究，其中高血壓未用藥組34例，高血壓用藥組63例。受試者年齡50～80(62.14±8.33)歲。3組對(duì)象性別、年齡、三酰甘油、總膽固醇、HDL-C、血糖、BMAL1和PER1蛋白水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組相比，高血壓未用藥組與高血壓用藥組的收縮壓、舒張壓均增加，LDL-C水平降低；高血壓未用藥組CLOCK蛋白水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表 1。

表1 研究對(duì)象的基本資料

2.2 BMAL1、PER1、CLOCK蛋白與臨床資料各變量相關(guān)性分析 選取對(duì)照組與高血壓未用藥組進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示PER1蛋白水平與BMI呈正相關(guān)(r=0.225，P=0.036)；CLOCK蛋白水平與收縮壓呈負(fù)相關(guān)(r=-0.243，P=0.022)。見表 2。

表2 BMAL1、PER1、CLOCK與臨床資料各變量相關(guān)性分析

2.3 Logistic回歸分析CLOCK蛋白水平與高血壓之間的關(guān)系 以是否患高血壓及是否服藥3組為因變量(0=對(duì)照組，1=高血壓未用藥組，2=高血壓用藥組)，將單因素分析中P<0.10的變量納入多因素Logistic回歸分析中，以CLOCK蛋白水平、TC、LDL-C、BMI為自變量，行Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，CLOCK水平降低是高血壓未用藥組的危險(xiǎn)因素(P<0.05)，BMI和LDL-C水平增高是高血壓用藥組的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表3。

表3 高血壓影響因素的多元Logistic回歸分析

3 討論

人體血壓波動(dòng)存在晝夜節(jié)律性，健康人夜間血壓可下降10%～20%，早晨上升，血壓晝夜節(jié)律在維持人體健康上發(fā)揮重要作用。研究表明，與其他時(shí)間相比，在早晨血壓波動(dòng)期間，急性心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)增加40%，心臟猝死風(fēng)險(xiǎn)增加29%，腦卒中風(fēng)險(xiǎn)增加49%[10-12]。近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明，生物鐘基因功能缺失與血壓升高密切相關(guān)。

本研究探討血壓正常人群和高血壓患者外周血中BMAL1、PER1、CLOCK蛋白水平的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)未使用藥物治療的高血壓患者的CLOCK蛋白水平低于正常血壓人群，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CLOCK蛋白水平與收縮壓呈負(fù)相關(guān)。以往研究顯示，CLOCK基因敲除的小鼠與雄性野生型小鼠相比，24 h血壓節(jié)律沒(méi)有改變，但是出現(xiàn)了血壓水平的下降[13]。與野生小鼠相比，CLOCK突變雄性小鼠血壓和心率下降，同時(shí)還出現(xiàn)較低的血漿醛固酮水平，但是在腎上腺切除術(shù)后，兩組間的血壓和心率差異均消失[14]。CLOCK突變小鼠顯示一種編碼Na+/ K+-ATP酶的β1亞基的基因ATP1B1的表達(dá)降低，引起血壓升高[6]。而機(jī)體的晝夜功能協(xié)同障礙會(huì)誘導(dǎo)小鼠血管緊張素Ⅱ依賴性高血壓[15]。因此，CLOCK基因在人體腎臟系統(tǒng)對(duì)高血壓的調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要的作用。另有研究報(bào)道，CLOCK基因可上調(diào)細(xì)胞間黏附分子-1的表達(dá)并促進(jìn)單核細(xì)胞黏附到內(nèi)皮細(xì)胞，引起血管炎癥反應(yīng)[16]。而敲除CLOCK或BMAL1，會(huì)引起內(nèi)皮依賴性血管舒張功能降低[5]。人群研究顯示，位于CLOCK基因的 3′UTR 區(qū)的位點(diǎn)T3111C，其CC基因型攜帶者的高血壓患病風(fēng)險(xiǎn)是TT基因型的1.42倍[7]。Kurbatova等[17]報(bào)道，T3111C位點(diǎn)會(huì)影響CLOCK基因的轉(zhuǎn)錄水平。但是既往研究主要集中于動(dòng)物模型或人群中的基因轉(zhuǎn)錄水平，關(guān)于人群的CLOCK蛋白水平很少報(bào)道。本研究結(jié)果進(jìn)一步提示低CLOCK蛋白水平可能與高血壓的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。但是用藥治療的高血壓患者沒(méi)有出現(xiàn)差異。大量研究報(bào)道，多數(shù)降壓藥物在降低血壓同時(shí)可以調(diào)節(jié)血壓的晝夜節(jié)律，但是否對(duì)恢復(fù)正常的生物鐘節(jié)律也進(jìn)行了調(diào)節(jié)，其具體機(jī)制尚不清楚。

PER1作為CLOCK與BMAL1形成異源二聚體的靶基因，Douma等[4]發(fā)現(xiàn)，PER1在雄性小鼠的血壓調(diào)節(jié)中起重要作用。本研究中，PER1在高血壓患者與對(duì)照中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但相關(guān)性分析顯示，PER1與BMI呈正相關(guān)。BMI是衡量人體肥胖程度的重要指標(biāo)。肥胖會(huì)導(dǎo)致血壓升高，占原發(fā)性高血壓的65%～75%，是心血管和腎臟疾病的主要驅(qū)動(dòng)因素[18]。回歸分析顯示BMI升高是高血壓的危險(xiǎn)因素。PER1是否可以通過(guò)影響高血壓的危險(xiǎn)因素參與血壓的調(diào)節(jié)和高血壓的形成，還有待研究。

本研究存在一定的局限性。Kurbatova等[17]對(duì)34例高血壓患者的口腔上皮細(xì)胞的RNA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)9∶00～17∶00存在BMAL1轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)和PER1基因表達(dá)上調(diào)的一般趨勢(shì)。本研究未能收集不同時(shí)間點(diǎn)的參加者外周血樣本，無(wú)法比較BMAL1、PER1、CLOCK蛋白水平的節(jié)律變化與高血壓的關(guān)系。本研究雖然進(jìn)一步在人群基礎(chǔ)上證實(shí)CLOCK蛋白水平改變與高血壓的關(guān)系，但生物鐘參與調(diào)解高血壓的機(jī)制復(fù)雜，影響因素多，且本研究樣本量偏小，結(jié)論有待進(jìn)一步驗(yàn)證。后續(xù)研究將繼續(xù)擴(kuò)大樣本量，關(guān)注BMAL1、PER1、CLOCK蛋白水平與高血壓的關(guān)系以及不同降壓藥物在生物鐘對(duì)血壓調(diào)節(jié)中的影響。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)血漿CLOCK與高血壓具有相關(guān)性，同時(shí)降壓藥物對(duì)CLOCK表達(dá)水平有一定的影響。后期應(yīng)深入研究不同時(shí)間點(diǎn)CLOCK及BMAL1、PER1水平的變化與高血壓的關(guān)系，為高血壓的有效控制提供新的策略。