急性酶解血管平滑肌及Genistein 對(duì)其泡沫化的影響

盧楠娟，白 冰，何 簫，張黎明

心血管病是全球發(fā)病率和病死率的主要原因，動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是大多數(shù)心血管病發(fā)病的基礎(chǔ)[1-4]。 泡沫細(xì)胞形成在AS 發(fā)生、發(fā)展的各環(huán)節(jié)都發(fā)揮著重要的作用，然而目前尚沒(méi)有效逆轉(zhuǎn)AS 的方法[5]。 Allahverdian 等[6]報(bào)道發(fā)現(xiàn)平滑肌細(xì)胞在人類冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中比之前已知的要多， 人類AS 斑塊中許多被鑒定為單核細(xì)胞源性的泡沫細(xì)胞實(shí)際來(lái)源于平滑肌細(xì)胞。 血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMC） 是構(gòu)成人類AS 斑塊中的主要類型細(xì)胞[7-8],需進(jìn)一步研究平滑肌源性泡沫細(xì)胞生物發(fā)生的特異性機(jī)制，以探索其在AS 中的作用。

Genistein 是異黃酮類化合物，主要在豆類植物中，可調(diào)整血脂、抗氧化、抑制血管炎癥等反應(yīng)，也是天然的酪氨酸激酶 （protein tyrosine kinase，PTK）抑制劑，從而具有直接或間接抗AS 作用[9-11]。 因此，本研究探討Genistein 對(duì)平滑肌源性泡沫化的影響,為抗AS 治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 8~12 周齡健康雄性維斯塔爾（Wistar）大鼠，來(lái)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，Dulbecco 改良的Eagle 培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）高糖型；胎牛血清購(gòu)自ExCellBio 公司； 氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)購(gòu)自廣東奕源生物公司；平滑肌肌動(dòng)蛋（α-smooth muscle actin，SMA） 抗體購(gòu)自 Abcam 公司；FITC 標(biāo)記的山羊抗兔抗體購(gòu)自美國(guó)AffinitY 公司；木瓜蛋白酶、二硫代蘇糖醇 （DL-Dithiothreitol，DTT）、 氯 化 鈣 （Calcium chloride，CaCl2）、4- 輕乙基呱嗦乙磺酸（2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid，HEPES）、油紅 O 染料、 葡萄糖（glucose,Glu）、Genistein、Daidzein、Tyrphostin等試劑購(gòu)自Sigma 公司。

1.2 儀器和設(shè)備 體式顯微鏡購(gòu)自日本Nikon SMZ645； 熒光顯微鏡、 倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱美國(guó)Thermo 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 腸系膜動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（mesenteric artery smooth muscle cells，MASMC）原代分離、培養(yǎng) Wistar大鼠頸椎脫臼;放血；75%酒精消毒，打開(kāi)腹腔，結(jié)扎腸系膜動(dòng)脈主干；體式顯微鏡下去除腸系膜動(dòng)周?chē)窘M織。 取0 ℃無(wú)鈣生理鹽溶液[12]（physiological salt solution,PSS）漂洗和沖洗血管腔內(nèi)殘留的血液。去除腸系膜動(dòng)脈主干及末端細(xì)小分支，保留腸系膜動(dòng)脈2、3 級(jí)分支。 用高壓滅菌的1%雙抗PSS 漂洗血管段，移入 1 ml 分離液(9.7 ml PSS、0.3 ml 50 mg/L牛血清白蛋白和1 μl 1 mol/L CaCl2)內(nèi)，眼科剪把腸系膜動(dòng)脈剪成約1 mm×1 mm 的小段。 加入1.5 mg DTT，于37 ℃水浴搖床內(nèi)預(yù)熱10 min。 加入1.5 mg/ml木瓜蛋白酶溶液，37 ℃水浴搖床內(nèi)孵育10 min；加入含1.5 mg/ml 透明質(zhì)酸酶的分離液和1 mg/ml 膠原酶F 溶液，37 ℃水浴中孵育6 min。 再次離心,棄掉上清夜，用0 ℃的分離液漂洗，終止酶反應(yīng)。2 ml 10%FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基， 輕輕吹散均勻， 置于 37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱3.5 mm 培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)， 分別于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)1 d、5 d 后取出觀察細(xì)胞生長(zhǎng)變化。 待細(xì)胞長(zhǎng)到90%匯合度的時(shí)候，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3.2 臺(tái)盼藍(lán)染色 急性酶消MASMC 制備單細(xì)胞懸液（106細(xì)胞/ml），細(xì)胞懸液與0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液以9∶1 混合混勻。 血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)3 min 內(nèi)活細(xì)胞和死細(xì)胞數(shù)，計(jì)算活細(xì)胞率。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組和處理 實(shí)驗(yàn)分5 組，分組如下：對(duì)照組(細(xì)胞和高糖培養(yǎng)基)、模型組（50 mg/L ox-LDL）、Genistein 組（50 μmol/L Genistein 與 50 mg/L ox-LDL）、Daidzein 組(50 mg/L ox-LDL 與 50 μmol/L Daidzein)、Tyrphostin 組(50 mg/L ox-LDL 與 50 μmol/L Tyrphostin)。

1.3.4 油紅O 染色 將原代平滑肌細(xì)胞以1×105/孔接種12 孔板，4 h 后待細(xì)胞貼壁加入含50 mg/L ox-LDL 的 10%FBS 的 DMEM 培養(yǎng) 24 h，PBS 漂洗，40 g/L 多聚甲醛固定15 min，60%異丙醇潤(rùn)洗，每孔加入 0.5 ml 過(guò)濾好的油紅 O 染色 30 min，PBS 漂洗，倒置顯微鏡下觀察泡沫細(xì)胞染色。

1.3.5 油紅萃取實(shí)驗(yàn) 上述油紅O 染色后， 每孔加入0.5 ml 異丙醇萃取細(xì)胞內(nèi)油紅O 染色液，取100 μl 加入 96 孔板，518 nm 處測(cè)其吸光值，定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量。

1.3.6 免疫熒光化學(xué)染色 取第3 代細(xì)胞， 每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于12 孔板內(nèi)，細(xì)胞匯合度60%時(shí)，PBS 漂洗，4%多聚甲醛固定10 min； 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）漂洗，0.1%TritonX-100 透膜孵育 5 min；PBS 漂洗，10%山羊血清封15 min； 兔抗鼠 α-SMA 抗體 (1∶200)4 ℃孵育過(guò)夜，PBS 漂洗，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的山羊抗兔 IgG(H 與 L)(1∶100)避光孵育細(xì)胞 60 min；PBS 漂洗，DAPI 避光染核5 min；PBS 漂洗，抗淬滅劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察培養(yǎng)的 MASMC 胞漿內(nèi)肌動(dòng)蛋白被α-SMA 標(biāo)記后呈綠色熒光， 胞核被4,6- 二脒基-2- 苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染成藍(lán)色。 隨機(jī)選取4 個(gè)不同的視野， 計(jì)算α-SMA 表達(dá)陽(yáng)性百分比，鑒定 VSMC 及檢測(cè)α-SMA 的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用Graph pad prism8.0 軟件作圖， 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析， 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s 表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩步法急性酶解分離并原代培養(yǎng)MASMC兩步法急性酶解分離可得到大量同源單個(gè)MASMC,顯微鏡下觀察MASMC 呈長(zhǎng)梭形（圖1A）。培養(yǎng)24 h細(xì)胞呈圓形或梭形， 貼壁良好(圖1B)； 培養(yǎng) 5 d 后VSMC 具有典型的“峰 -谷”結(jié)構(gòu)（圖1C）。

2.2 細(xì)胞活力鑒定 死亡的MASMC 被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色，活性良好MASMC 拒染呈無(wú)色。急性酶解獲取MASMC 活性達(dá) 99%以上（圖2）。

2.3 MASMC 的鑒定 α-SMA 是鑒定 VSMC 的標(biāo)記分子[13]。 熒光顯微鏡下觀察到，α-SMA 表達(dá)陽(yáng)性率占95%（圖4），表明分離培養(yǎng)的是高純度VSMC，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 ox-LDL 與MASMC 共培養(yǎng)建立泡沫細(xì)胞模型ox-LDL（50 mg/L）誘導(dǎo) MASMC 發(fā)生泡沫樣變。ox-LDL 刺激24 h 后， 油紅O 染色顯示細(xì)胞吞噬油紅脂質(zhì)，細(xì)胞變圓，體積增大（圖3B）,提示泡沫細(xì)胞模型建立成功。

圖 1 MASMC 形態(tài)和生長(zhǎng)特點(diǎn)（×100）

圖 2 MASMC 臺(tái)盼藍(lán)染色（×100）

2.5 Genistein 抑制泡沫細(xì)胞的形成 油紅O 染色實(shí)驗(yàn)顯示模型組與對(duì)照組(圖3A)相比吞噬大量紅色脂滴(P< 0.01)，Genistein 組與模型組相比吞噬紅色脂滴顯著減少(P< 0.05),而Daidzein 組吞噬紅色脂滴無(wú)明顯變化(P> 0.05)，Tyrphostin 組吞噬紅色脂滴顯著減少(P< 0.05，圖3)；油紅萃取結(jié)果顯示模型組較對(duì)照組增高 1.72 倍(P< 0.05)，Genistein 組較模型組降低了 1.18 倍(P< 0.05)，而Daidzein 組較模型組增高 1.12 倍(P＞ 0.05)，Tyrphostin 組較較模型組降低了 1.22 倍(P< 0.05)。

2.6 Genistein 促進(jìn)泡沫細(xì)胞表達(dá)α-SMA 與對(duì)照組相比， 模型組 α-SMA 表達(dá)明顯降低（P< 0.01）；Genistein 組與模型組相比 α-SMA 表達(dá)增多（P<0.05）,Daidzein 組與模型組相比α-SMA 表達(dá)無(wú)明顯變化，Tyrphostin 組與模型組相比α-SMA 表達(dá)增多（P< 0.05，圖 4）。

3 討論

目前報(bào)道了人和鼠VSMC 原代培養(yǎng)方法，主要包括組織貼塊法[14-16]和酶消化法[14-17]，酶分離法經(jīng)過(guò)不斷的改進(jìn)，越來(lái)越顯示其優(yōu)越性。 本實(shí)驗(yàn)參考國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中VSMC 的分離方法， 使用木瓜蛋白酶和膠原酶兩步法，成功地分離出大鼠MASMC。 組織塊[15-17]培養(yǎng)需要2~3 w，甚至更長(zhǎng)時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)采用木瓜蛋白酶和膠原酶分離MASMC 僅需1 h；組織塊培養(yǎng)時(shí)容易混入內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞獲得的VSMC 純度低是一個(gè)嚴(yán)重的缺點(diǎn)，而本研究條件下內(nèi)皮細(xì)胞不易存活[18]；用免疫熒光鑒定VSMC 的特異性標(biāo)志蛋白α-SMA 陽(yáng)性率達(dá)95%；臺(tái)盼藍(lán)染色顯示細(xì)胞活性達(dá)99%以上；一旦用酶消化分離，原代培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞就保持了原來(lái)的表型。 因此，本研究克服了以往組織培養(yǎng)方法的缺點(diǎn)，建立了一種周期短且可靠的分離和培養(yǎng)高純度、細(xì)胞活性良好、易獲取大量同源單個(gè)細(xì)胞并保持原有特性的大鼠MASMC 的方法，對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究不會(huì)產(chǎn)生偏差。

圖3 油紅O 染色(×200)和油紅萃取結(jié)果(n=3)

圖 4 VSMC 的 α-SMA 表達(dá)（× 200）

長(zhǎng)期以來(lái)， 血脂異常一直被認(rèn)為是AS 相關(guān)冠狀動(dòng)脈和外周血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，也是許多干預(yù)措施的靶點(diǎn)[19-20]。 ox-LDL 對(duì)血管壁成分的生物學(xué)效應(yīng)在AS 中起著重要作用[21]。傳統(tǒng)的觀念認(rèn)為泡沫細(xì)胞主要來(lái)源于巨噬細(xì)胞，而研究證實(shí)在人冠狀動(dòng)脈斑塊中超過(guò)50%的泡沫細(xì)胞來(lái)源于VSMC[6]。因傳代細(xì)胞可能發(fā)生轉(zhuǎn)化，本研究采用急性酶解獲取原代VSMC，更接近與人體狀態(tài)。 用50 mg/L ox-LDL作用24 h 后成功誘導(dǎo)VSMC 源性泡沫細(xì)胞模型，油紅 O 染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞吞噬大量脂滴，ox-LDL 誘導(dǎo)VSMC 泡沫化，細(xì)胞完整，并未發(fā)生嚴(yán)重凋亡壞死而影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Genistein 具有抗氧化、 調(diào)節(jié)血脂等抗AS 的作用[22]，Genistein 是一種 PTK 抑制劑，可以抑制平滑肌源性泡沫細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化[23]，為了進(jìn)一步研究Genistein 抗AS 的作用機(jī)制， 本研究采用Daidzein與 Genistein 比較，Daidzein 具有與 Genistein 相似的結(jié)構(gòu)，但Daidzein 沒(méi)有抑制PTK 的作用。 研究發(fā)現(xiàn)Daidzein 不影響平滑肌泡沫化，Genistein 抑制平滑肌細(xì)胞泡沫化，那么Genistein 對(duì)脂質(zhì)的調(diào)節(jié)作用可能與其抑制PTK 活性有關(guān)。 為此，同時(shí)研究了另一種PTK 抑制劑Tyrphostin 對(duì)平滑肌細(xì)胞泡沫化影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Tyrphostin 抑制平滑肌細(xì)胞泡沫化，表明Genistein 抑制脂質(zhì)的蓄積與依賴于PTK 抑制劑的生物活性相關(guān)。 內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)換同樣參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，本實(shí)驗(yàn)證明ox-LDL誘導(dǎo)α-SMA 的表達(dá)降低，與SMCs 的收縮性表型的缺失相關(guān)。目前對(duì)Genistein 的研究還未受到學(xué)術(shù)界的重視， 本研究表明Genistein 具有良好地抑制VSMC 源性泡沫細(xì)胞形成的作用， 為進(jìn)一步研究抗AS 治療提供了理論依據(jù)。

綜上所述，酶解法可獲取大量同源的單個(gè)高純度高活性VSMC，Genistein 抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的平滑肌源性泡沫細(xì)胞的形成，與其抑制PTK 的生物活性作用有關(guān)，為指導(dǎo)臨床應(yīng)用提供參考。