RNA靶向的CRISPR/CasRx系統(tǒng)在小鼠精原細(xì)胞系GC1-spg中的應(yīng)用

李夢(mèng)真，柳 俊，鄒定峰，繆時(shí)英，王琳芳，宋 偉，李 凱

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100005)

成族規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)/CRISPR關(guān)聯(lián)因子(CRISPR associated,Cas)系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌物種抵御入侵的噬菌體和核酸中的外來(lái)遺傳元件的一種免疫應(yīng)答方式[1]，其通過(guò)各種CRISPR/Cas系統(tǒng)的RNA引導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶結(jié)合和切割外來(lái)遺傳元件而發(fā)揮作用[2]。盡管在先前的報(bào)道中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于在DNA層面進(jìn)行基因編輯以剖析特定遺傳元件的功能或糾正致病突變[3]，但當(dāng)不適合對(duì)基因組DNA進(jìn)行永久修改(例如敲除致死) 以及涉及生物安全問(wèn)題時(shí)，或者用于治療RNA病毒感染疾病(例如SARS-CoV-2感染)[4]時(shí)，RNA靶向基因編輯技術(shù)就尤為重要。CasRx是CRISPR系統(tǒng)中鑒定出的一種新的、由RNA引導(dǎo)的、靶向RNA的Cas核酸酶，其能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)錄組高效和特異的敲降[5]。迄今為止，CRISPR/CasRx介導(dǎo)的基因沉默已經(jīng)被廣泛使用，例如抑制胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)生發(fā)展[6]小鼠中用于神經(jīng)細(xì)胞命運(yùn)操縱[7]、肝臟代謝調(diào)節(jié)[4]、預(yù)防新血管形成以及植物[8]和胚胎[9]中特異基因敲降。盡管RNA靶向的CRISPR/CasRx系統(tǒng)具有廣泛的應(yīng)用前景，但是在雄性生殖領(lǐng)域中還未有相關(guān)應(yīng)用的報(bào)道。本項(xiàng)研究驗(yàn)證了CRISPR/CasRx在HEK-293T細(xì)胞中可敲降egfp(enhanced green fluorescent protein)和mCherry外源基因，以及特異敲降HEK-293T細(xì)胞內(nèi)源基因，包括mRNA和lncRNA(long non-coding RNA)。為了評(píng)估CRISPR/CasRx系統(tǒng)在雄性生殖領(lǐng)域中的應(yīng)用潛力，選取了GC1-spg細(xì)胞并利用該系統(tǒng)靶向egfp和mCherry外源基因進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎細(xì)胞系293T(human embryonic kidney cell line,HEK-293T)、小鼠精原細(xì)胞系GC1-spg(本課題組保存)；EF1a.CasRx.2A.EGFP、CasRx.pregRNA cloning backbone(武漢淼靈生物科技有限公司)；lenti.Guide.mCherry、lenti.Guide. tdTomato(王曉月教授饋贈(zèng))；DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone公司)；Fatal bovine serum(Gibco公司)；Opti-MEM培養(yǎng)基、penicillin-streptomycin(Life Technologies公司)；Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix、T4 DNA Ligase(NEB公司)；5×DNA loading dye(Generay公司)；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Green Master Mix、Fast DigestPacⅠ(Thermo Fisher Scientifical公司)；PEI(Polysciences公司)；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒中提試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；SDS-PAGE快速凝膠試劑盒(上海雅酶生物科技有限公司)；E.coliTrans5αChemically Compe-tent Cell(TransGene Biotech公司)；EcoRⅠ(TaKaRa公司)；GFP antibody(Cell Signaling公司)；mCherry antibody(Proteintech公司)；引物(北京擎科生物科技有限公司合成,見(jiàn)表1，2)；gRNA序列(北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成,見(jiàn)表3)。

表1 PCR及測(cè)序引物序列Table 1 Primers for PCR and sequenc

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q-PCR)引物序列Table 2 Real-time fluorescent quantitative PCR(q-PCR) primer sequence

表3 gRNA序列Table 3 gRNA sequence

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建：利用SnapGene設(shè)計(jì)lenti. EF1a.EGFP、lenti.EF1a.mCherry、lenti.EF1a. tdTomato目的質(zhì)粒，Q5高保真PCR Mix擴(kuò)增目的片段，同時(shí)使用PacⅠ和EcoRⅠ內(nèi)切酶酶切慢病毒表達(dá)載體，純化回收目的片段。使用同源重組酶連接目的片段和載體，轉(zhuǎn)化E.coliTrans5α感受態(tài)細(xì)菌內(nèi)，12 h后挑取單克隆菌落，送擎科公司進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)測(cè)序結(jié)果后，質(zhì)粒提取。同上方法,PCR獲得EF1a core promoter、CasRx、SV40、U6-DRs和載體片段，連接到AAV表達(dá)載體，測(cè)序比對(duì)后質(zhì)粒提取。

1.2.2 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：在6孔板培養(yǎng)皿內(nèi)鋪約106個(gè)細(xì)胞，17 h后換液。配置轉(zhuǎn)染試劑，按照1∶1的比例加入Max轉(zhuǎn)染試劑，靜置30 min后滴加入培養(yǎng)基內(nèi)，24 h后換為正常的DMEM，48 h后收細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)：HEK-293T細(xì)胞及GC1-Spg細(xì)胞均在DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素)、5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.2.4 gRNA設(shè)計(jì)及連接：gRNA設(shè)計(jì)于https://cas13design.nygenome.org，將得分前3名的gRNA進(jìn)行比對(duì)之后合成。通過(guò)BplⅠ內(nèi)切酶酶切AAV.EF1a.CasRx.U6.DRs載體以及合成的gRNA片段，T4 DNA連接酶連接。

1.2.5 Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá)：用1×SDS 80 μL裂解細(xì)胞樣品，100 ℃變性，12 000 r/min離心5 min吸取上清，棄去細(xì)胞碎片，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。用10% SDS-PAGE快速凝膠試劑盒，加入蛋白樣品，使用相應(yīng)的抗體進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 q-PCR檢測(cè)mRNA水平：1 mL Trizol加入細(xì)胞沉淀內(nèi)，加入異丙醇12 000 r/min 15 min離心獲取沉淀，使用70%冰乙醇進(jìn)行洗滌2遍，使用預(yù)熱的DEPC水進(jìn)行溶解。

1.2.7 流式細(xì)胞分選術(shù)分析陽(yáng)性細(xì)胞：使用0.25%胰蛋白酶將細(xì)胞消化下來(lái)后，PBS洗滌細(xì)胞1遍，之后使用40 μm濾膜進(jìn)行過(guò)濾，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行EGFP和mCherry陽(yáng)性細(xì)胞的分選，使用FlowJo軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建CasRx-gRNA 表達(dá)質(zhì)粒和熒光表達(dá)質(zhì)粒

通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得對(duì)應(yīng)長(zhǎng)度的目的片段，測(cè)序結(jié)果連接成功且無(wú)突變，經(jīng)質(zhì)粒提取獲得EF1a core promoter.CasRx.SV40.U6.DRs質(zhì)粒(圖1A，B)。通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得對(duì)應(yīng)長(zhǎng)度的目的片段和酶切后的載體片段，質(zhì)粒提取獲得3種熒光表達(dá)質(zhì)粒(圖1C，D)。

A.AAV-CasRx-gRNA plasmid map；B.PCR products of EF1a core promoter，SV40，U6-DRs，CasRx，AAV-vector；C.EGFP，mCherry，tdTomato fluorescent protein expression vectors；D.PCR products of EF1a promoter，EGFP，mCherry，tdTomato圖1 CasRx-gRNA和EGFP、mCherry、tdTomato熒光蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建Fig 1 Construction of CasRx-gRNA and EGFP，mCherry，tdTomato fluorescent proteins expression vectors

2.2 HEK-293T細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證CRISPR/CasRx系統(tǒng)的特異性和高效性

通過(guò)網(wǎng)站設(shè)計(jì)以及文獻(xiàn)查閱獲得EGFP和mCherry相應(yīng)gRNA，將gRNAEGFP和gRNAmCherry序列插入EF1a core promoter.CasRx.SV40.U6.DRs質(zhì)粒DR-DR之間,獲得目的質(zhì)粒(圖2A)。在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒和CasRx+gRNA 48 h后，檢測(cè)3種熒光的表達(dá)，其中EGFP和mCherry熒光為實(shí)驗(yàn)組，tdTomato為對(duì)照組，CasRx+gRNAEGFP、CasRx+gRNAmCherry組EGFP綠色熒光和mCherry紅色熒光顯著減弱，tdTomato熒光強(qiáng)度不變(圖2B)。分別檢測(cè)EGFP綠色熒光和mCherry紅色熒光蛋白的表達(dá)水平顯著降低(圖2C)。

A.AAV-CasRx-gRNA plasmid design strategy；B.fluorescence expression after HEK-293T knockdown(×20)；C.detection of the expression of EGFP and mCherry protein level by Western blot; WT.wild type圖2 CRISPR/CasRx在HEK-293T細(xì)胞內(nèi)靶向沉默外源基因的表達(dá)Fig 2 CRISPR/CasRx targetedly silenced the expression of exogenous genes in HEK-293T cells

2.3 CRISPR/CasRx系統(tǒng)在HEK-293T細(xì)胞系內(nèi)有效敲降內(nèi)源基因

選取一組EK-293T內(nèi)源表達(dá)的蛋白質(zhì)編碼基因(mRNA)B4GALNT1、ANXA4，和一組長(zhǎng)非編碼RNA(lncRNA)MALAT1和H19，設(shè)計(jì)相對(duì)應(yīng)的gRNA靶點(diǎn)(圖3A)，獲得目的質(zhì)粒。分別檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后RNA水平，顯示CasRx+gRNA能夠有效敲降內(nèi)源表達(dá)的mRNA和lncRNA(圖3B)。

A.design for non-targeting(NT),B4GALNT1,ANXA4,MALAT1,H19 targeting；B.detection of the expression of B4GALNT1,ANXA4,MALAT1,H19 by q-PCR；*P<0.01 compared with NT guide圖3 CRISPR/CasRx在HEK-293T細(xì)胞內(nèi)靶向沉默內(nèi)源基因的表達(dá)Fig 3 CRISPR/CasRx targetedly silenced the expression of endogenous genes in HEK-293T

2.4 CRISPR/CasRx系統(tǒng)在GC1-spg細(xì)胞內(nèi)有效敲降外源基因

在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒和CasRx+gRNA于GC1細(xì)胞48 h后，檢測(cè)顯示綠色熒光和紅色熒光強(qiáng)度都顯著減弱(圖4A)。流式細(xì)胞分選陽(yáng)性細(xì)胞顯示CasRx+gRNA組熒光的強(qiáng)度較高的細(xì)胞數(shù)量顯著減少(圖4B)。檢測(cè)熒光蛋白的RNA和蛋白表達(dá)水平，顯示CasRx+gRNA組能夠有效敲降外源的兩種不同的熒光蛋白(圖4C，D)。

A，B.fluorescence intensity after knockdown EGFP and mCherry of GC1-spg(×20)；C.detection for expression of EGFP and mCherry by q-PCR after egfp and mCherry knockdown of GC1-spg，*P<0.01 compared with CasRx group；D.detection for expression of EGFP and mCherry protein level by Western blot after egfp and mCherry knockdown of GC1-spg; WT.wild type圖4 CRISPR/CasRx在GC1-spg細(xì)胞內(nèi)靶向沉默外源基因的表達(dá)Fig 4 CRISPR/CasRx targeted the expression of exogenous genes in GC1-spg

3 討論

CRISPR/CasRx系統(tǒng)最直接的應(yīng)用是靶向沉默RNA。目前此系統(tǒng)被證實(shí)可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中干擾RNA，從而實(shí)現(xiàn)基因沉默。本研究通過(guò)構(gòu)建熒光表達(dá)質(zhì)粒和針對(duì)目的egfp敲降的AAV-CasRx-gRNA質(zhì)粒,從熒光表達(dá)差異直觀的證明了CRISPR/CasRx發(fā)揮敲降功能的高效性， 在HEK-293T細(xì)胞系和小鼠精原細(xì)胞系GC1-spg通過(guò)對(duì)目的基因進(jìn)行敲降，結(jié)果顯示敲降效率均在50%以上，包括mRNA和lncRNA。據(jù)報(bào)道，小鼠睪丸組織存在大量特異表達(dá)的lncRNA，傳統(tǒng)的RNA干擾技術(shù)靶向沉默lncRNA的效率不甚理想，特別是針對(duì)細(xì)胞核內(nèi)的lncRNA，而CRISPR/CasRx系統(tǒng)介導(dǎo)的基因沉默不受此限制，可在體內(nèi)體外水平高效沉默lncRNA。在CRISPR/CasRx設(shè)計(jì)gRNA方面，此系統(tǒng)不需要PAM(protospacer adjacent motif)序列，無(wú)核苷酸識(shí)別序列要求，在設(shè)計(jì)gRNA時(shí)操作簡(jiǎn)易。本研究連接了針對(duì)目的基因的3個(gè)gRNA，3個(gè)gRNA進(jìn)行比對(duì)時(shí)均無(wú)脫靶，證明了現(xiàn)階段在設(shè)計(jì)gRNA方面，https://cas13design.nygenome.org網(wǎng)站的實(shí)用性和高度可信性[10]。同時(shí)對(duì)于gRNA，已報(bào)道在circular RNA方面的篩選功能[11]，表明此系統(tǒng)對(duì)于高通量篩選出功能性RNA的應(yīng)用前景較好。另一方面，現(xiàn)階段發(fā)現(xiàn)的Cas13d同源物中CasRx蛋白體積最小，僅930 aa(氨基酸)，適用于包裝入現(xiàn)階段較安全的AAV病毒載體中，而且非常特異，在RNA水平上極少產(chǎn)生脫靶效應(yīng)，讓其在安全性以及潛在的疾病治療上擁有了巨大的優(yōu)勢(shì)。CRISPR/CasRx結(jié)合AAV病毒運(yùn)載系統(tǒng)已經(jīng)在小鼠模型上被證明可用于基因治療的多種疾病的發(fā)生發(fā)展。

體內(nèi)水平注釋基因功能是研究精子發(fā)生的理想模型。在研究某個(gè)基因在精子發(fā)生完整過(guò)程中的功能及機(jī)制時(shí)，較穩(wěn)定的方式是制備基因敲除鼠，但敲除鼠只能展現(xiàn)該基因缺失的最終結(jié)果且存在潛在的致死效應(yīng)[12]，無(wú)法展現(xiàn)該基因被干擾的一個(gè)動(dòng)態(tài)變化，而CRISPR/CasRx系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)在小鼠體內(nèi)進(jìn)行RNA編輯進(jìn)而檢測(cè)其干擾后下游基因的表達(dá)情況。所以，結(jié)合CRISPR/CasRx系統(tǒng)的功能特征和雄性生殖發(fā)育研究現(xiàn)狀，CRISPR/CasRx系統(tǒng)應(yīng)用于雄性生殖發(fā)育研究具有較好前景。本研究中構(gòu)建的AAV-CasRx-gRNA表達(dá)載體也是為應(yīng)用于雄性生殖研究的小鼠模型上。同時(shí)CRISPR/CasRx系統(tǒng)在小鼠精原細(xì)胞的應(yīng)用也為此系統(tǒng)應(yīng)用于雄性生殖研究中奠定了基礎(chǔ)。