亞硫酸鉍瓊脂平板培養(yǎng)基驗收研究

金倩儀

（中山市食品藥品檢驗所，廣東中山 528437）

在微生物的試驗過程中，培養(yǎng)基的質(zhì)量直接影響檢驗結(jié)果，這其中包含了培養(yǎng)基自身質(zhì)量的優(yōu)劣、配制和使用方法是否正確、保存是否符合條件等過程[1-2]。沙門氏菌檢驗是食源性微生物檢測的常規(guī)項目，該項檢測實驗中使用的培養(yǎng)基為亞硫酸鉍（BS）瓊脂培養(yǎng)基，檢測中一般購買商品化的BS瓊脂平板直接進(jìn)行菌種檢測，也可購買BS瓊脂干粉制作平板用于檢測（現(xiàn)用現(xiàn)配），培養(yǎng)基中的亞硫酸鉍指示劑可以抑制革蘭氏陽性菌和大腸菌群生長，但不影響沙門氏菌的生長。

在沙門氏菌檢驗中，BS瓊脂平板培養(yǎng)基的質(zhì)量關(guān)系到沙門氏菌檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，選擇傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌和糞腸球菌4種菌株對BS瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性和生長率的檢驗，探究影響B(tài)S瓊脂平板培養(yǎng)基驗收結(jié)果的相關(guān)因素。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

傷寒沙門氏菌[CMCC(B)50071]，廣東省微生物菌種保藏中心提供；鼠傷寒沙門氏菌[ATCC 14028]、大腸埃希氏菌（ATCC 25922）、糞腸球菌（ATCC 29212），美國 MicroBioLogics ATCC。

Quintix2102-1CN電子天平，賽多利斯貿(mào)易有限公司；KB400生化培養(yǎng)箱，賓德亞太有限公司；SG603A-HE生物安全柜，美國BAKER公司。

1.2 檢驗環(huán)境

遵循無菌操作原則在二級生物安全實驗室進(jìn)行檢測。

1.3 試驗方法

1.3.1 平板制作

稱取適量的亞硫酸鉍瓊脂干粉加水進(jìn)行煮沸滅菌，待冷卻至40 ℃后傾注平板（直徑90 mm的平皿，通常要加入15～25 mL瓊脂培養(yǎng)基），放到水平平面待瓊脂凝固。需要在使用前一天配置，可常溫放置于生物安全柜到第2天直接使用。

1.3.2 接種方法

傷寒沙門氏菌（菌株T1）和鼠傷寒沙門氏菌（菌株T2）作為目標(biāo)菌，采用目標(biāo)菌半定量方法。如圖1a所示，用1 μL的接種環(huán)分A、B、C、D四個區(qū)進(jìn)行劃線，A、B、C三個區(qū)按0.5 cm的間隔劃4條平行線，D區(qū)內(nèi)劃一條連續(xù)的曲線[3]。大腸埃希氏菌（N1）和糞腸球菌（N2）作為非目標(biāo)菌，采用非目標(biāo)菌半定量方法。如圖1b所示，用1 μL的接種環(huán)取1環(huán)工作懸液在待測培養(yǎng)基表面劃6條平行線。接種后的平板倒置培養(yǎng)于（36±1）℃培養(yǎng)箱中40～48 h。

圖2 目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌半定量劃線法接種模式圖

1.3.3 試驗設(shè)置

選用同一生產(chǎn)廠家兩個批號的BS瓊脂干粉配制新鮮培養(yǎng)基并制作BS瓊脂平板（命名為BS1、BS2）和另一生產(chǎn)廠家兩個批號的商用BS瓊脂平板（BS3、BS4），分別使用4種菌株（T1、T2、N1、N2）的新、舊菌株進(jìn)行劃線和菌種培養(yǎng)。

1.3.4 接種結(jié)果評價

培養(yǎng)后，評價菌落的形狀、大小和生長密度，并計算生長指數(shù)G。每條有比較稠密菌落生長的劃線則G為1；如果僅有一半的線有稠密菌落生長則G為0.5；如果沒有菌落生長、生長量少于劃線的一半或菌落生長微弱則G為0[4]。記錄每個平板的得分總和便是G值，目標(biāo)菌的G值一般是≥6，非目標(biāo)菌的G值一般≤1。

2 結(jié)果與分析

不同類型、不同批號的亞硫酸鉍瓊脂平板的驗收結(jié)果如表1所示。BS1使用鼠傷寒沙門氏菌（T2）舊菌株劃線的平板生長指數(shù)不符合標(biāo)準(zhǔn)要求，但是用新菌株劃線的平板是符合要求的；BS2的所有菌株劃線的平板都在標(biāo)準(zhǔn)要求范圍內(nèi)，因此該批號的BS瓊脂干粉培養(yǎng)基通過了培養(yǎng)基驗證；BS4瓊脂平板使用傷寒沙門氏菌（T1）劃線的平板均沒有生長，且使用糞腸球菌（N2）舊菌株劃線的平板生長指數(shù)也超出標(biāo)準(zhǔn)要求；BS3瓊脂平板使用傷寒沙門氏菌（T1）舊菌株劃線其生長指數(shù)偏低，且糞腸球菌（N2）舊菌株的劃線平板也超出了正常生長。為此，對所有菌株進(jìn)行一次驗證實驗，發(fā)現(xiàn)糞腸球菌（N2）的舊菌株受到了污染，有雜菌；同時，舊菌株活性比新菌株差，因此舊菌株的結(jié)果不可作為培養(yǎng)基驗收結(jié)果。由于BS4瓊脂平板的傷寒沙門氏菌（T1）的G值不符合標(biāo)準(zhǔn)要求，判定該批次的平板不合格。

表1 亞硫酸鉍瓊脂驗收實驗結(jié)果

GB 4789.28-2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》表明，每次進(jìn)行驗收都應(yīng)進(jìn)行菌株的純度和形態(tài)驗證，在保存和使用時應(yīng)注意避免交叉污染，本次實驗可說明使用后的菌株不宜反復(fù)使用，最好是當(dāng)天廢棄銷毀。每次打開后易交叉污染，一旦發(fā)現(xiàn)菌株有污染現(xiàn)象應(yīng)立即處理掉并換新的工作菌株，且舊的菌株即便是不被污染，也可能會因為傳代次數(shù)過多而失去活力。運(yùn)輸條件和儲存條件對培養(yǎng)基質(zhì)量影響也是不可忽視的，對溫度有要求的培養(yǎng)基應(yīng)在收到后立即轉(zhuǎn)存。生產(chǎn)商在送出時也應(yīng)該和物流溝通好，確保運(yùn)輸過程中不會影響到培養(yǎng)基的質(zhì)量。而且平板的配置、儲存也有一定的要求，一般已配置的平板保存不超過4周，且要求保存在2～8 ℃條件下。已配置的平板在使用前也要觀察是否有異常，而BS平板配置與一般培養(yǎng)基不同，需要在使用前一天配置，可常溫放置于生物安全柜至第2天使用。如果培養(yǎng)基購置后還未進(jìn)行培養(yǎng)基驗證又需要立即使用時，可以進(jìn)行實驗的時候同時進(jìn)行培養(yǎng)基的驗收實驗，在用實驗生長出的菌進(jìn)行平板劃線時同時使用陰陽性菌株劃線，通過結(jié)果反饋來驗證培養(yǎng)基是否符合驗收標(biāo)準(zhǔn)，在得到比較準(zhǔn)確的驗收結(jié)果的同時，觀察培養(yǎng)基在日常檢驗中的使用狀況。

3 結(jié)論

同一生產(chǎn)商不同批號、不同狀態(tài)生產(chǎn)的培養(yǎng)基質(zhì)量有優(yōu)劣之分并不穩(wěn)定。因此，培養(yǎng)基驗收實驗[5-6]是不可或缺的一個步驟，這直接影響了實驗結(jié)果。不同的培養(yǎng)基應(yīng)參照GB 4789.28-2013《食品微生物學(xué)檢驗培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》進(jìn)行驗收試驗。實驗室可以多采購不同品牌的培養(yǎng)基使用，通過多次驗收實驗以及使用心得來選購符合本實驗室實際狀況的培養(yǎng)基。