劉守海,張海景,陳耀輝,季 曉,夏利花,何彥龍,秦玉濤,張昊飛
(1.國家海洋局東海環(huán)境監(jiān)測中心,上海 201206;2.自然資源部海洋生態(tài)監(jiān)測與修復(fù)技術(shù)重點實驗室,上海 201206;3.國家海洋局東海海洋環(huán)境調(diào)查勘察中心,上海 200137;4.上海海洋大學(xué)海洋生態(tài)與環(huán)境學(xué)院,上海 201306)
隨著海上石油運(yùn)輸量的日益增加,世界油輪進(jìn)出港口次數(shù)也增加,所發(fā)生的船舶溢油事故是主要的石油突發(fā)性輸入來源,據(jù)統(tǒng)計,我國進(jìn)口的石油90%依靠海上船舶運(yùn)輸完成,每年發(fā)生的各類船舶溢油事故超過500起,隨著沿岸港口油輪密度增加,發(fā)生石油污染事故的風(fēng)險也不斷增大[1]。溢油事故頻繁發(fā)生,會給漁業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)等產(chǎn)業(yè)帶來巨大損失,同時也使得海洋環(huán)境受到嚴(yán)重污染,給海洋生態(tài)資源造成巨大損害[2-4]。石油烴能夠通過呼吸、攝食等途徑進(jìn)入生物體并在組織內(nèi)積累,造成細(xì)胞DNA損傷,降低酶的活性、影響生物的發(fā)育等[5-9]。低濃度石油長期的亞急性毒性可干擾其繁殖和攝食,高濃度石油會使魚卵和仔幼魚在短時間內(nèi)大量死亡[10-12]。漂浮在海面的油膜易黏附在魚卵和仔、稚魚表面,使魚卵不能正常孵化,仔、稚魚喪失或減弱活動能力,影響其正常生理功能,有的甚至死亡。海水中石油烴水溶性成分對魚卵和仔、稚魚的危害主要通過表皮侵入體內(nèi),影響海洋生物早期發(fā)育階段的神經(jīng)中樞和呼吸器官[13-15],因此魚卵和仔、稚魚對石油類的毒性十分敏感[15-17]。李磊等[15]研究了0#柴油和原油水溶性成分(water accommodated fraction,WAF)對 黑 鯛(Sparus macrocephlus)肝臟7-乙氧基異吩噁唑酮-脫乙基酶(EROD)活性及細(xì)胞色素P4501A1(CYP1A1)mRNA表達(dá)量的影響。李磊等[18]應(yīng)用半靜態(tài)雙箱動力學(xué)模型在室內(nèi)模擬了黑鯛對0#柴油和東海平湖原油水溶性成分(WAF)的生物富集實驗。李傳慧等[8]研究了不同濃度勝利原油暴露1、2、4、8、15 d以及解除污染1 d和3 d后對半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)幼魚肝臟谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)活性的影響。呂福榮等[19]研究了0#柴油、船用柴油和船用重質(zhì)燃料油分散液(WAF)對馬糞海膽(Hemicentrotuspulcherrimus)卵細(xì)胞、精子及胚胎發(fā)育的毒性效應(yīng),并通過色譜-質(zhì)譜對3種油品分散液進(jìn)行了組分分析。上述學(xué)者在石油中的原油、汽油、柴油等對海洋生物的影響方面都做了較為詳實的研究報道,但不同油品成分不同,對海洋生物的毒性效應(yīng)也不盡相同。
本項目以東海海域常見的經(jīng)濟(jì)魚類——大黃魚(Larimichthyscrocea)為研究對象,在0#柴油水溶性成分暴露脅迫下進(jìn)行急性毒性實驗,獲得0#柴油對大黃魚的急性毒性效應(yīng);建立劑量-時間-效應(yīng)關(guān)系,解析大黃魚對0#柴油脅迫的生理響應(yīng)特征,以期為0#柴油海洋生態(tài)污染的風(fēng)險評估提供科學(xué)依據(jù)。
實驗所用海水從自然海區(qū)抽取,鹽度為21,pH為8.1,進(jìn)行沉淀和砂濾,充分曝氣(24 h以上)后備用。實驗對象來自江蘇省海洋水產(chǎn)研究所大黃魚育苗場,大黃魚魚卵為親魚(體長約為40 cm)的自然排卵,仔魚由魚卵直接培養(yǎng)孵化,為剛孵化3 d未開口的仔魚和孵化10 d開口仔魚,幼魚為育苗場自然生長的大黃魚,平均體長為(3.89±1.12)cm,平均體質(zhì)量為(3.01±1.05)g。實驗用油為中石化加油站售的0#柴油。
將0#柴油與沙濾海水按1∶10(V∶V)配比,置于磁力攪拌機(jī)上,連續(xù)高速攪拌24 h后靜置3 h分離出水相[20],注入水溶分(WAF)母液貯存瓶中,母液置于冰箱4℃保存。采用紫外分光光度法測定母液中的總石油烴濃度,即為柴油水溶性成分,為了更準(zhǔn)確地反映真實濃度,用0#柴油作為其標(biāo)準(zhǔn)油。
1.3.1 大黃魚魚卵、初孵仔魚、仔魚
魚卵、初孵仔魚實驗容器采用自制實驗裝置[9],主體為6孔的細(xì)胞培養(yǎng)板,每個實驗容器分隔6個實驗圓形槽,上層有密封蓋,每個槽對應(yīng)密封蓋中間有一個小孔。在每個實驗容器中分別投入約60個未孵化的受精卵(高囊胚期,卵徑為0.9 mm)、48尾初孵3 d仔魚(體長約為1 mm)和48尾孵化10 d仔魚(體長約為7 mm)。
參照《化學(xué)品魚類胚胎和卵黃囊仔魚階段的短期毒性試驗》(GB 21807-2008)方法,進(jìn)行靜態(tài)毒性實驗??刂茖嶒灉囟葹椋?8±2)℃,pH為8.1,實驗用水溶解氧高于6 mg·L-1。采用靜態(tài)法進(jìn)行孵化實驗,間隔24 h換100%同等濃度的溶液。每間隔24 h用顯微鏡進(jìn)行觀察,記錄實驗期間胚胎的死亡率(卵發(fā)白不透明或卵膜內(nèi)物質(zhì)凝聚為一白色的小點)、孵化率(破膜而出)、形態(tài)畸形率(脊椎畸形、尾椎彎曲等),剔除已經(jīng)死亡的受精卵。當(dāng)用顯微鏡觀察到對照組魚卵破膜仔魚時實驗結(jié)束。根據(jù)預(yù)實驗,設(shè)置柴油水溶性成分在大黃魚魚卵中的5個實驗濃度:7.52、3.37、1.52、0.68、0.31 mg·L-1;初孵仔魚(3 d)設(shè)置5個實驗濃度:4.80、2.40、1.20、0.60、0.30 mg·L-1;初孵仔魚(10 d)設(shè)置5個實驗濃度:7.20、3.60、1.80、0.90、0.45 mg·L-1;同時以自然海水為對照組,每個濃度組設(shè)3個平行樣。使用0#柴油水溶性成分母液和實驗海水按照配比獲得相對應(yīng)的實驗濃度。
1.3.2 大黃魚幼魚
以自行設(shè)計定制的30 L密封玻璃缸為容器,每個容器上部用玻璃板遮蓋密封,防止石油揮發(fā),玻璃缸體中有一個小的缸體,放置一些過氧化鈉作為氧氣再生劑,為幼魚提供氧氣。在每個玻璃缸體中投入40尾幼魚[平均體長為(4.5±0.3)cm,平均體質(zhì)量為(1.89±0.27)g]??刂茖嶒灉囟葹椋?8±2)℃,pH為8.1,實驗用水溶解氧高于6mg·L-1。根據(jù)預(yù)實驗設(shè)置5個濃度組:9.80、5.20、2.80、1.50、0.80 mg·L-1,同時以自然海水為對照組,每個濃度組設(shè)3個平行樣。采用靜態(tài)法進(jìn)行96 h實驗,每間隔24 h換100%同等濃度的溶液。觀察和統(tǒng)計24、48、72、96 h出現(xiàn)的死亡個體數(shù)。
參照《GB 17378.7-2007》第7部分“近海污染生態(tài)調(diào)查和生物監(jiān)測規(guī)定”中半致死濃度(LC50)的計算方法。采用概率單位算法,求得回歸方程并進(jìn)行可靠性檢驗,計算96 h半致死濃度LC50及95%置信區(qū)間。根據(jù)《化學(xué)品魚類胚胎和卵黃囊仔魚階段的短期毒性試驗》(GB 21807-2008)中的公式SC=96 h LC50×0.1,推算出安全濃度。
2.1.1 魚卵的孵化率
大黃魚魚卵的孵化率隨著0#柴油水溶性成分暴露濃度的升高而逐漸下降,孵化率最低僅有15.40%(7.52 mg·L-1暴露濃度)。0#柴油水溶性成分濃度對魚卵孵化率顯示出顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系,兩者的劑量反應(yīng)曲線為y=-19.2lnx+57.06(圖1)。
2.1.2 初孵仔魚的致畸率
隨著0#柴油水溶性成分暴露濃度的升高,大黃魚初孵仔魚的致畸率逐漸上升,致畸率最高為35.23%(7.52 mg·L-1暴露濃度)。0#柴油水溶性成分濃度對初孵仔魚的致畸率顯示出顯著的正相關(guān)關(guān)系,兩者的劑量反應(yīng)曲線為y=4.264x+4.216(圖2)。
圖1 0#柴油水溶分對大黃魚魚卵孵化率的影響曲線Fig.1 Hatching rate of fish eggs of L.crocea in water accommodated fractions of No.0 diesel fuel
圖2 0#柴油水溶性成分對大黃魚初孵仔魚致畸率的影響曲線Fig.2 Teratogenic rate of L.crocea larvae in water accommodated fractions of No.0 diesel fuel
統(tǒng)計結(jié)果顯示,0#柴油水溶性成分濃度與初孵仔魚(3 d)的死亡率之間顯示出顯著的正相關(guān)關(guān)系(圖3),兩者的劑量反應(yīng)曲線為y=16.29x+20.45,半致死濃度(96 h LC50)為1.00 mg·L-1,安全濃度為0.10 mg·L-1(表1)。
圖3 0#柴油水溶性成分對大黃魚仔魚(3 d)的96 h死亡率Fig.3 96 h mortality rate of L.crocea larvae(3d)in water accomm odated fractions of No.0 diesel fuel
表1 0#柴油水溶性成分對大黃魚仔魚和幼魚的急性毒性效應(yīng)Tab.1 Acute toxic effect of L.crocea larvae and young in water accommodated fractions of No.0 diesel fuel
統(tǒng)計結(jié)果顯示,0#柴油水溶性成分濃度與仔魚(10 d)的死亡率之間顯示出顯著的正相關(guān)關(guān)系(圖4),兩者的劑量反應(yīng)曲線為y=23.67x-15.72,半致死濃度(96 h LC50)為1.07 mg·L-1,安全濃度為0.11 mg·L-1(表1)。
圖4 0#柴油水溶性成分對大黃魚仔魚(10 d)的96 h死亡率Fig.4 96 h mortality rate of L.crocea larvae(10 d)in water accommodated fractions of No.0 diesel fuel
統(tǒng)計結(jié)果顯示,0#柴油水溶性成分濃度與幼魚的死亡率之間顯示出顯著的正相關(guān)關(guān)系(圖5),兩者的劑量反應(yīng)曲線為y=25.28x-20.38,半致死濃度(96 h LC50)為2.02 mg·L-1,安全濃度為0.20 mg·L-1(表1)。
圖5 0#柴油對大黃魚幼魚的96 h死亡率Fig.5 96 h mortality rate of L.crocea young in water accommodated fractions of No.0 diesel fuel
石油類的生物毒性效應(yīng)與其所含的低分子量烷烴和芳香烴的組成及絕對含量有密切關(guān)系[21]。0#柴油的飽和烷烴和芳香烴分別約占總組分的65%~70%和20%~30%[20],且芳香烴含量越高的油類對生物的毒性越大[22]。水生生物孵化失敗和發(fā)育遲緩是石油類污染物的主要毒性效應(yīng)之一[23]。研究表明,石油烴對魚胚胎發(fā)育有影響,孵出仔魚多為畸形且在孵化后死亡[24-25],主要表現(xiàn)在有機(jī)物進(jìn)入胚胎,毒性會干擾胚胎的正常發(fā)育,或阻滯魚卵的孵化從而延長孵出時間,或使孵出的仔魚畸形,嚴(yán)重的會導(dǎo)致胚體死亡[26-27]。本研究中,隨著海水中0#柴油水溶性成分濃度的升高,大黃魚魚卵的孵化率明顯下降,且在濃度為0~3.37 mg·L-1下降得最快。石油污染對魚類的神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等有一定的影響。體表皮膚滲透或者呼吸器官呼吸等作用,是石油類WAF在生物體內(nèi)被動吸收并富集于體內(nèi)的主要途徑[9,28-29]。賈曉平等[30]利用南海原油、0#柴油和20#柴油對不同魚類進(jìn)行實驗,通過鏡檢發(fā)現(xiàn),不同濃度組仔魚的鰓部不同程度的分布著散性油滴,阻礙了仔魚的正常呼吸。另外,多個研究發(fā)現(xiàn),石油類污染物會使魚類體內(nèi)酶的活性發(fā)生變化,從而導(dǎo)致機(jī)體自身代謝和自我調(diào)節(jié)發(fā)生紊亂[5,31]。本研究使用0#柴油水溶性成分對不同階段的大黃魚進(jìn)行了96 h急性毒性效應(yīng)實驗,結(jié)果顯示,大黃魚初孵仔魚(3 d)、大黃魚仔魚(10 d)和大黃魚幼魚的安全濃度分別為0.10、0.11、0.20 mg·L-1;半致死濃度分別為大黃魚幼魚(2.02 mg·L-1)>仔魚(10 d)(1.07 mg·L-1)>初孵仔魚(3 d)(1.00 mg·L-1)。由此可推斷,仔魚階段對0#柴油水溶性成分的毒性比幼魚階段更為敏感,表明隨著大黃魚的生長發(fā)育,其對0#柴油的耐受性也有一定增強(qiáng)。