0＃柴油對(duì)大黃魚早期生活階段的急性毒性效應(yīng)

劉守海，張海景，陳耀輝，季 曉，夏利花，何彥龍，秦玉濤，張昊飛

（1.國家海洋局東海環(huán)境監(jiān)測中心，上海 201206；2.自然資源部海洋生態(tài)監(jiān)測與修復(fù)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201206；3.國家海洋局東海海洋環(huán)境調(diào)查勘察中心，上海 200137；4.上海海洋大學(xué)海洋生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，上海 201306）

隨著海上石油運(yùn)輸量的日益增加，世界油輪進(jìn)出港口次數(shù)也增加，所發(fā)生的船舶溢油事故是主要的石油突發(fā)性輸入來源，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國進(jìn)口的石油90%依靠海上船舶運(yùn)輸完成，每年發(fā)生的各類船舶溢油事故超過500起，隨著沿岸港口油輪密度增加，發(fā)生石油污染事故的風(fēng)險(xiǎn)也不斷增大［1］。溢油事故頻繁發(fā)生，會(huì)給漁業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)等產(chǎn)業(yè)帶來巨大損失，同時(shí)也使得海洋環(huán)境受到嚴(yán)重污染，給海洋生態(tài)資源造成巨大損害［2-4］。石油烴能夠通過呼吸、攝食等途徑進(jìn)入生物體并在組織內(nèi)積累，造成細(xì)胞DNA損傷，降低酶的活性、影響生物的發(fā)育等［5-9］。低濃度石油長期的亞急性毒性可干擾其繁殖和攝食，高濃度石油會(huì)使魚卵和仔幼魚在短時(shí)間內(nèi)大量死亡［10-12］。漂浮在海面的油膜易黏附在魚卵和仔、稚魚表面，使魚卵不能正常孵化，仔、稚魚喪失或減弱活動(dòng)能力，影響其正常生理功能，有的甚至死亡。海水中石油烴水溶性成分對(duì)魚卵和仔、稚魚的危害主要通過表皮侵入體內(nèi)，影響海洋生物早期發(fā)育階段的神經(jīng)中樞和呼吸器官［13-15］，因此魚卵和仔、稚魚對(duì)石油類的毒性十分敏感［15-17］。李磊等［15］研究了0＃柴油和原油水溶性成分（water accommodated fraction，WAF）對(duì) 黑 鯛（Sparus macrocephlus）肝臟7-乙氧基異吩噁唑酮-脫乙基酶（EROD）活性及細(xì)胞色素P4501A1（CYP1A1）mRNA表達(dá)量的影響。李磊等［18］應(yīng)用半靜態(tài)雙箱動(dòng)力學(xué)模型在室內(nèi)模擬了黑鯛對(duì)0＃柴油和東海平湖原油水溶性成分（WAF）的生物富集實(shí)驗(yàn)。李傳慧等［8］研究了不同濃度勝利原油暴露1、2、4、8、15 d以及解除污染1 d和3 d后對(duì)半滑舌鰨（Cynoglossussemilaevis）幼魚肝臟谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）和谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶（GST）活性的影響。呂福榮等［19］研究了0＃柴油、船用柴油和船用重質(zhì)燃料油分散液（WAF）對(duì)馬糞海膽（Hemicentrotuspulcherrimus）卵細(xì)胞、精子及胚胎發(fā)育的毒性效應(yīng)，并通過色譜-質(zhì)譜對(duì)3種油品分散液進(jìn)行了組分分析。上述學(xué)者在石油中的原油、汽油、柴油等對(duì)海洋生物的影響方面都做了較為詳實(shí)的研究報(bào)道，但不同油品成分不同，對(duì)海洋生物的毒性效應(yīng)也不盡相同。

本項(xiàng)目以東海海域常見的經(jīng)濟(jì)魚類——大黃魚（Larimichthyscrocea）為研究對(duì)象，在0＃柴油水溶性成分暴露脅迫下進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)，獲得0＃柴油對(duì)大黃魚的急性毒性效應(yīng)；建立劑量-時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，解析大黃魚對(duì)0＃柴油脅迫的生理響應(yīng)特征，以期為0＃柴油海洋生態(tài)污染的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用海水從自然海區(qū)抽取，鹽度為21，pH為8.1，進(jìn)行沉淀和砂濾，充分曝氣（24 h以上）后備用。實(shí)驗(yàn)對(duì)象來自江蘇省海洋水產(chǎn)研究所大黃魚育苗場，大黃魚魚卵為親魚（體長約為40 cm）的自然排卵，仔魚由魚卵直接培養(yǎng)孵化，為剛孵化3 d未開口的仔魚和孵化10 d開口仔魚，幼魚為育苗場自然生長的大黃魚，平均體長為（3.89±1.12）cm，平均體質(zhì)量為（3.01±1.05）g。實(shí)驗(yàn)用油為中石化加油站售的0＃柴油。

1.2 實(shí)驗(yàn)?zāi)敢旱闹苽?/h3>

將0＃柴油與沙濾海水按1∶10（V∶V）配比，置于磁力攪拌機(jī)上，連續(xù)高速攪拌24 h后靜置3 h分離出水相［20］，注入水溶分（WAF）母液貯存瓶中，母液置于冰箱4℃保存。采用紫外分光光度法測定母液中的總石油烴濃度，即為柴油水溶性成分，為了更準(zhǔn)確地反映真實(shí)濃度，用0＃柴油作為其標(biāo)準(zhǔn)油。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大黃魚魚卵、初孵仔魚、仔魚

魚卵、初孵仔魚實(shí)驗(yàn)容器采用自制實(shí)驗(yàn)裝置［9］，主體為6孔的細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)實(shí)驗(yàn)容器分隔6個(gè)實(shí)驗(yàn)圓形槽，上層有密封蓋，每個(gè)槽對(duì)應(yīng)密封蓋中間有一個(gè)小孔。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)容器中分別投入約60個(gè)未孵化的受精卵（高囊胚期，卵徑為0.9 mm）、48尾初孵3 d仔魚（體長約為1 mm）和48尾孵化10 d仔魚（體長約為7 mm）。

參照《化學(xué)品魚類胚胎和卵黃囊仔魚階段的短期毒性試驗(yàn)》（GB 21807-2008）方法，進(jìn)行靜態(tài)毒性實(shí)驗(yàn)?？刂茖?shí)驗(yàn)溫度為（18±2）℃，pH為8.1，實(shí)驗(yàn)用水溶解氧高于6 mg·L-1。采用靜態(tài)法進(jìn)行孵化實(shí)驗(yàn)，間隔24 h換100%同等濃度的溶液。每間隔24 h用顯微鏡進(jìn)行觀察，記錄實(shí)驗(yàn)期間胚胎的死亡率（卵發(fā)白不透明或卵膜內(nèi)物質(zhì)凝聚為一白色的小點(diǎn)）、孵化率（破膜而出）、形態(tài)畸形率（脊椎畸形、尾椎彎曲等），剔除已經(jīng)死亡的受精卵。當(dāng)用顯微鏡觀察到對(duì)照組魚卵破膜仔魚時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)束。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置柴油水溶性成分在大黃魚魚卵中的5個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度：7.52、3.37、1.52、0.68、0.31 mg·L-1；初孵仔魚（3 d）設(shè)置5個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度：4.80、2.40、1.20、0.60、0.30 mg·L-1；初孵仔魚（10 d）設(shè)置5個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度：7.20、3.60、1.80、0.90、0.45 mg·L-1；同時(shí)以自然海水為對(duì)照組，每個(gè)濃度組設(shè)3個(gè)平行樣。使用0＃柴油水溶性成分母液和實(shí)驗(yàn)海水按照配比獲得相對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)濃度。

1.3.2 大黃魚幼魚

以自行設(shè)計(jì)定制的30 L密封玻璃缸為容器，每個(gè)容器上部用玻璃板遮蓋密封，防止石油揮發(fā)，玻璃缸體中有一個(gè)小的缸體，放置一些過氧化鈉作為氧氣再生劑，為幼魚提供氧氣。在每個(gè)玻璃缸體中投入40尾幼魚［平均體長為（4.5±0.3）cm，平均體質(zhì)量為（1.89±0.27）g］?？刂茖?shí)驗(yàn)溫度為（18±2）℃，pH為8.1，實(shí)驗(yàn)用水溶解氧高于6mg·L-1。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)濃度組：9.80、5.20、2.80、1.50、0.80 mg·L-1，同時(shí)以自然海水為對(duì)照組，每個(gè)濃度組設(shè)3個(gè)平行樣。采用靜態(tài)法進(jìn)行96 h實(shí)驗(yàn)，每間隔24 h換100%同等濃度的溶液。觀察和統(tǒng)計(jì)24、48、72、96 h出現(xiàn)的死亡個(gè)體數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

參照《GB 17378.7-2007》第7部分“近海污染生態(tài)調(diào)查和生物監(jiān)測規(guī)定”中半致死濃度（LC50）的計(jì)算方法。采用概率單位算法，求得回歸方程并進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)，計(jì)算96 h半致死濃度LC50及95%置信區(qū)間。根據(jù)《化學(xué)品魚類胚胎和卵黃囊仔魚階段的短期毒性試驗(yàn)》（GB 21807-2008）中的公式SC＝96 h LC50×0.1，推算出安全濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 0＃柴油水溶性成分對(duì)大黃魚魚卵和初孵仔魚的毒性效應(yīng)

2.1.1 魚卵的孵化率

大黃魚魚卵的孵化率隨著0＃柴油水溶性成分暴露濃度的升高而逐漸下降，孵化率最低僅有15.40%（7.52 mg·L-1暴露濃度）。0＃柴油水溶性成分濃度對(duì)魚卵孵化率顯示出顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，兩者的劑量反應(yīng)曲線為y＝-19.2lnx＋57.06（圖1）。

2.1.2 初孵仔魚的致畸率

隨著0＃柴油水溶性成分暴露濃度的升高，大黃魚初孵仔魚的致畸率逐漸上升，致畸率最高為35.23%（7.52 mg·L-1暴露濃度）。0＃柴油水溶性成分濃度對(duì)初孵仔魚的致畸率顯示出顯著的正相關(guān)關(guān)系，兩者的劑量反應(yīng)曲線為y＝4.264x＋4.216（圖2）。

圖1 0＃柴油水溶分對(duì)大黃魚魚卵孵化率的影響曲線Fig.1 Hatching rate of fish eggs of L.crocea in water accommodated fractions of No.0 diesel fuel

圖2 0＃柴油水溶性成分對(duì)大黃魚初孵仔魚致畸率的影響曲線Fig.2 Teratogenic rate of L.crocea larvae in water accommodated fractions of No.0 diesel fuel

2.2 0＃柴油水溶性成分對(duì)大黃魚初孵仔魚（3 d）的96 h急性毒性效應(yīng)

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，0＃柴油水溶性成分濃度與初孵仔魚（3 d）的死亡率之間顯示出顯著的正相關(guān)關(guān)系（圖3），兩者的劑量反應(yīng)曲線為y＝16.29x＋20.45，半致死濃度（96 h LC50）為1.00 mg·L-1，安全濃度為0.10 mg·L-1（表1）。

圖3 0＃柴油水溶性成分對(duì)大黃魚仔魚（3 d）的96 h死亡率Fig.3 96 h mortality rate of L.crocea larvae（3d）in water accomm odated fractions of No.0 diesel fuel

表1 0＃柴油水溶性成分對(duì)大黃魚仔魚和幼魚的急性毒性效應(yīng)Tab.1 Acute toxic effect of L.crocea larvae and young in water accommodated fractions of No.0 diesel fuel

2.3 0＃柴油水溶性成分對(duì)大黃魚仔魚（10 d）的96 h急性毒性效應(yīng)

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，0＃柴油水溶性成分濃度與仔魚（10 d）的死亡率之間顯示出顯著的正相關(guān)關(guān)系（圖4），兩者的劑量反應(yīng)曲線為y＝23.67x-15.72，半致死濃度（96 h LC50）為1.07 mg·L-1，安全濃度為0.11 mg·L-1（表1）。

圖4 0＃柴油水溶性成分對(duì)大黃魚仔魚（10 d）的96 h死亡率Fig.4 96 h mortality rate of L.crocea larvae（10 d）in water accommodated fractions of No.0 diesel fuel

2.4 0＃柴油水溶性成分對(duì)大黃魚幼魚的96 h急性毒性效應(yīng)

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，0＃柴油水溶性成分濃度與幼魚的死亡率之間顯示出顯著的正相關(guān)關(guān)系（圖5），兩者的劑量反應(yīng)曲線為y＝25.28x-20.38，半致死濃度（96 h LC50）為2.02 mg·L-1，安全濃度為0.20 mg·L-1（表1）。

圖5 0＃柴油對(duì)大黃魚幼魚的96 h死亡率Fig.5 96 h mortality rate of L.crocea young in water accommodated fractions of No.0 diesel fuel

3 討論

石油類的生物毒性效應(yīng)與其所含的低分子量烷烴和芳香烴的組成及絕對(duì)含量有密切關(guān)系［21］。0＃柴油的飽和烷烴和芳香烴分別約占總組分的65%～70%和20%～30%［20］，且芳香烴含量越高的油類對(duì)生物的毒性越大［22］。水生生物孵化失敗和發(fā)育遲緩是石油類污染物的主要毒性效應(yīng)之一［23］。研究表明，石油烴對(duì)魚胚胎發(fā)育有影響，孵出仔魚多為畸形且在孵化后死亡［24-25］，主要表現(xiàn)在有機(jī)物進(jìn)入胚胎，毒性會(huì)干擾胚胎的正常發(fā)育，或阻滯魚卵的孵化從而延長孵出時(shí)間，或使孵出的仔魚畸形，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致胚體死亡［26-27］。本研究中，隨著海水中0＃柴油水溶性成分濃度的升高，大黃魚魚卵的孵化率明顯下降，且在濃度為0～3.37 mg·L-1下降得最快。石油污染對(duì)魚類的神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等有一定的影響。體表皮膚滲透或者呼吸器官呼吸等作用，是石油類WAF在生物體內(nèi)被動(dòng)吸收并富集于體內(nèi)的主要途徑［9，28-29］。賈曉平等［30］利用南海原油、0＃柴油和20＃柴油對(duì)不同魚類進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過鏡檢發(fā)現(xiàn)，不同濃度組仔魚的鰓部不同程度的分布著散性油滴，阻礙了仔魚的正常呼吸。另外，多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)，石油類污染物會(huì)使魚類體內(nèi)酶的活性發(fā)生變化，從而導(dǎo)致機(jī)體自身代謝和自我調(diào)節(jié)發(fā)生紊亂［5，31］。本研究使用0＃柴油水溶性成分對(duì)不同階段的大黃魚進(jìn)行了96 h急性毒性效應(yīng)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，大黃魚初孵仔魚（3 d）、大黃魚仔魚（10 d）和大黃魚幼魚的安全濃度分別為0.10、0.11、0.20 mg·L-1；半致死濃度分別為大黃魚幼魚（2.02 mg·L-1）＞仔魚（10 d）（1.07 mg·L-1）＞初孵仔魚（3 d）（1.00 mg·L-1）。由此可推斷，仔魚階段對(duì)0＃柴油水溶性成分的毒性比幼魚階段更為敏感，表明隨著大黃魚的生長發(fā)育，其對(duì)0＃柴油的耐受性也有一定增強(qiáng)。