過氧化氫（H2O2）介導(dǎo)的光合誘導(dǎo)系統(tǒng)信號(hào)

姜佰文，許芳維，郝新雨，周笑竹，楊曉晗，李 威

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省寒地黑土保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

光是植物光合作用重要因素，對(duì)植物生長及發(fā)育發(fā)揮重要作用[1]。農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，由于冠層及葉片相互遮擋，大部分作物葉片處于遮蔽狀態(tài)[2]。研究表明，約80%光合有效輻射處于短期波動(dòng)，光合有效輻射主要來自于光斑[3]。因此，高效利用該部分動(dòng)態(tài)光能對(duì)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)植物至關(guān)重要[4]。葉片經(jīng)充分暗適應(yīng)，在一定光強(qiáng)照射下，其光合速率需經(jīng)一段時(shí)間才達(dá)到最大值。光合速率上升過程，被稱為光合作用誘導(dǎo)過程[5]。如農(nóng)作物冠層內(nèi)部及底部葉片存在快速光合誘導(dǎo)過程，將對(duì)葉片充分利用短期動(dòng)態(tài)光能發(fā)揮重要作用，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中植物碳積累效率最優(yōu)化。

植物體某些組織或器官受刺激后，向不受刺激組織或器官發(fā)出信號(hào)，使其表現(xiàn)出與刺激相對(duì)應(yīng)生理狀態(tài)（Systemic signaling）[6]。Karpinski等發(fā)現(xiàn)擬南芥部分葉片受強(qiáng)光刺激后引發(fā)植株光破壞防御機(jī)制上調(diào)[7]；Lake等發(fā)現(xiàn)，擬南芥幼葉發(fā)育主要受成熟葉片所處環(huán)境影響[8]；王鑫等發(fā)現(xiàn)高粱新生葉片光合特性及解剖結(jié)構(gòu)主要受老葉誘導(dǎo)，與自身所處光環(huán)境無關(guān)[9]；Hou 等發(fā)現(xiàn)酸模成熟葉片存在系統(tǒng)信號(hào)[10]。目前，系統(tǒng)信號(hào)研究多集中于擬南芥、高粱等模式作物，而關(guān)于玉米報(bào)道較少。Guo等報(bào)道，光照番茄莖尖促進(jìn)IAA（吲哚乙酸）信號(hào)傳導(dǎo)光合作用系統(tǒng)誘導(dǎo)，觸發(fā)過氧化氫（H2O2）積累[11]。H2O2被認(rèn)為是植物對(duì)脅迫反應(yīng)信號(hào)信使[12]。Karpinski 等報(bào)道H2O2誘導(dǎo)擬南芥高光強(qiáng)脅迫下光保護(hù)作用增強(qiáng)[7]。研究還表明，H2O2是響應(yīng)二氧化碳和臭氧所需長距離信號(hào)重要組成部分[13]。

玉米分布范圍廣，光合速率高，生物量大，受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。田強(qiáng)等研究表明玉米在我國農(nóng)業(yè)種植中具有重要地位，對(duì)國內(nèi)建設(shè)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)戰(zhàn)略規(guī)劃有一定影響[14]。本試驗(yàn)以玉米幼苗為材料，通過預(yù)先光照頂部葉片，測定葉片光合誘導(dǎo)過程快慢，明確農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中光合作用系統(tǒng)信號(hào)，為玉米如何高效利用動(dòng)態(tài)光能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以玉米先玉335幼苗為試驗(yàn)材料，種植在塑料盆中（直徑25 cm，高20 cm），土壤為草甸土，每盆種植1株，室外環(huán)境生長，待玉米幼苗長出4片成熟葉片、株高12～17 cm時(shí)測定。

試驗(yàn)處理分為5組，試驗(yàn)前，玉米幼苗用黑色不透明塑料布遮住葉片，試驗(yàn)于次日8: 00 開始。5 個(gè)處理分別為：處理1，1 200 μmol·m-2·s-1PFD（Photon flux density）光強(qiáng)處理頂部成熟葉片40 min，其余葉片均保持遮光，然后測定底部葉片光合誘導(dǎo)過程以及過氧化氫含量（H2O2），以整株葉片全遮光底部葉片為對(duì)照；處理 2，1 200 μmol·m-2·s-1PFD光強(qiáng)處理底部成熟葉片40 min，其余葉片均保持遮光，然后測定頂部成熟葉片光合誘導(dǎo)過程及H2O2含量，以整株葉片全遮光頂部成熟葉片為對(duì)照；處理3，整株葉片經(jīng)充分暗適應(yīng)后，對(duì)底部葉片噴施10 mL 10 mmol·L-1過氧化氫溶液，以噴施10 mL 蒸餾水（H2O）為對(duì)照，經(jīng)60 min 后，測定噴施H2O2和H2O 底部葉片光合誘導(dǎo)過程及H2O2含量；處理4，整株葉片經(jīng)充分暗適應(yīng)后，光照前用1 mL 10% 三氯乙酸（TCA）對(duì)頂部葉片基部處理10 h，然后1 200 μmol·m-2·s-1PFD光強(qiáng)處理最上端成熟葉片40 min，隨后測定底部葉片光合誘導(dǎo)過程及H2O2含量，以不施用TCA為對(duì)照；處理5，光照前0.5 mL 50 μmol·L-1二苯基碘化鉀（DPI）處理頂部葉片基部 15 min，然后 1 200 μmol·m-2·s-1PFD 光強(qiáng)處理最上端成熟葉片40 min，隨后測定底部葉片光合誘導(dǎo)過程及H2O2含量，以不施用DPI 為對(duì)照。處理葉片所用光源為可調(diào)式LED冷光源（英馳RB-101，北京）。

1.2 光合誘導(dǎo)曲線測定

采用LI-6400 便攜式光合儀（LI-COR, Lincoln,NE,USA）測定氣體交換參數(shù)。頂端目標(biāo)葉片光照40 min后，在1 200 μmol·m-2·s-1PFD光強(qiáng)下測定目標(biāo)葉片光合誘導(dǎo)過程，測定過程中光源由光合儀提供，CO2濃度保持 380 μmol·mol-1，溫度保持25 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間為30 min，每60 s 自動(dòng)測定1 次，并自動(dòng)記錄結(jié)果。根據(jù)Hou等方法[10]，對(duì)光合測定值作標(biāo)準(zhǔn)化，將每次測定最大光合值設(shè)定為100%，其余測定值為：Pn（%）=實(shí)際測定值/最大值×100%。測定光合誘導(dǎo)曲線，每個(gè)處理選用3 盆長勢一致玉米幼苗作為重復(fù)。

1.3 葉片過氧化氫含量測定

將0.5 g葉片在液氮中研磨，并用5 mL 5%（W/V）三氯乙酸提取，將混合物以10 000 r·min-1離心5 min去除沉淀物。吸取3 mL上清液，加入0.4 mL 20%四氯化鈦和0.6 mL NH4OH，收集沉淀物，溶解于 2 mL 2 mol·L-1H2SO4中，415 nm 處測定吸光值。利用已知濃度H2O2溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算測定溶液中H2O2濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 照射頂部葉片對(duì)底部葉片光合誘導(dǎo)過程的影響

1 200 μmol·m-2·s-1PFD光強(qiáng)預(yù)先照射玉米幼苗頂部成熟葉片后（見圖1A），由圖1 B可知，底部目標(biāo)測定葉片光合誘導(dǎo)速率顯著升高，光合速率從最低值達(dá)到最高值所用時(shí)間低于對(duì)照組，可見，強(qiáng)光光照玉米最頂部成熟葉片對(duì)底部葉片產(chǎn)生信號(hào)作用，有效縮短其光合誘導(dǎo)過程。頂部葉片預(yù)先受到1 200 μmol·m-2·s-1PFD 強(qiáng)光照射后，底部葉片在光合誘導(dǎo)過程12 min，光合速率已接近最高水平，而對(duì)照組葉片在光合誘導(dǎo)過程25 min，其光合速率接近最高水平。在光合誘導(dǎo)分析過程中，為更清晰明確對(duì)比光合過程所用時(shí)間，本研究對(duì)比玉米幼苗葉片光合速率達(dá)到最大光合速率50%和90%所需時(shí)間T50和T90。結(jié)果見圖1C，玉米最頂部葉片預(yù)先受到 1 200 μmol·m-2·s-1PFD 光照后，底部葉片T50 和T90 極顯著低于對(duì)照組（P<0.01）。其中，處理組T50 降低29%，T90 降低37%。同時(shí)，預(yù)先光照頂部葉片后，底部葉片H2O2含量極顯著增加（P<0.01，見圖1D）。

圖1 預(yù)先光照玉米頂部葉片對(duì)玉米底部葉片光合誘導(dǎo)過程的影響Fig.1 Effect of pre-illuminating upper leaf on photosynthetic induction in the lower leaves of maize

2.2 照射底部葉片對(duì)頂部葉片光合誘導(dǎo)過程的影響

1 200 μmol·m-2·s-1PFD強(qiáng)光預(yù)先照射玉米幼苗底部葉片后（見圖2A），由圖2B可知，頂部目標(biāo)測定葉片光合誘導(dǎo)速率無顯著升高，光合速率從最低值達(dá)到最高值所需時(shí)間與對(duì)照組一致，可見，強(qiáng)光光照玉米底部成熟葉片無法對(duì)頂部葉片光合誘導(dǎo)過程產(chǎn)生促進(jìn)作用。由圖2C 可知，玉米底部葉片預(yù)先受到光照后，頂部葉片T50和T90與對(duì)照組無顯著差異（P>0.05）。由圖2D可知，預(yù)先光照底部葉片后，頂部葉片H2O2含量無顯著增加（P>0.05）。

圖2 預(yù)先光照玉米底部葉片對(duì)玉米頂部葉片光合誘導(dǎo)過程的影響Fig.2 Effect of pre-illuminating lower leaf on photosynthetic induction in the upper leaves of maize

2.3 噴施外源H2O2對(duì)底部葉片光合誘導(dǎo)的影響

玉米底部葉片噴施外源H2O2后（見圖3A），由圖3B 可知，在未預(yù)先光照頂部葉片情況下，底部葉片光合誘導(dǎo)速率顯著升高，表明外源H2O2有促進(jìn)光合誘導(dǎo)過程的作用。底部葉片噴施外源H2O2處理（見圖3A）后，與底部葉片噴施H2O（見圖3B）對(duì)比，其T50 和T90 顯著降低（P<0.05，見圖3C）。同時(shí)，噴施H2O2后，底部葉片H2O2含量也極顯著增加（P<0.01，見圖3D）。

2.4 TCA 處理頂部葉片基部對(duì)底部葉片光合誘導(dǎo)過程的影響

TCA 處理頂部葉片葉柄后（見圖4A），即使頂部葉片預(yù)先受到1 200 μmol·m-2·s-1PFD 光照也并未促進(jìn)底部葉片光合誘導(dǎo)速率（見圖4B）。TCA 可殺死韌皮部細(xì)胞，阻止物質(zhì)通過韌皮部轉(zhuǎn)運(yùn)，信號(hào)物質(zhì)運(yùn)輸途徑可能被阻斷。當(dāng)頂部葉片被1 200 μmol·m-2·s-1PFD 光強(qiáng)照射后，TCA 處理頂部葉片后，底部葉片H2O2含量極顯著低于對(duì)照（P<0.01，見圖4D），同時(shí)，其T50 和T90 顯著高于對(duì)照（P<0.05，見圖4C）。TCA 可殺死韌皮部細(xì)胞，阻斷物質(zhì)傳遞，表明H2O2可能通過韌皮部運(yùn)輸。

2.5 DPI 處理頂部葉片基部對(duì)底部葉片光合誘導(dǎo)的影響

由圖5 可知，DPI 處理頂部葉片葉柄后（見圖5A），與TCA 結(jié)果相似，即使頂部葉片受預(yù)先1 200 μmol·m-2·s-1PFD 光照，也并未促進(jìn)底部葉片光合誘導(dǎo)速率（見圖5B）。在頂部葉柄上施用DPI，在1 200 μmol·m-2·s-1PFD光照條件下，底部葉片T50、T90 以及H2O2含量仍受到抑制（見圖5C、D）。說明DPI 對(duì)H2O2發(fā)揮淬滅作用，光合誘導(dǎo)過程可能與H2O2有關(guān)，同時(shí)光合誘導(dǎo)過程也受抑制。

圖3 H2O2和H2O噴施玉米底部葉片對(duì)底部葉片光合誘導(dǎo)過程的影響Fig.3 Effect of lower leaves treated with H2O2 and H2O on photosynthetic induction in the lower leaves of maize

圖4 TCA處理玉米頂部葉片基部對(duì)底部葉片光合誘導(dǎo)過程的影響Fig.4 Effect of the base of upper leaves treated with TCA on photosynthetic induction in the lower leaves of maize

圖5 DPI處理玉米頂部葉片基部對(duì)底部葉片光合誘導(dǎo)過程的影響Fig.5 Effect of the base of upper leaves treated with DPI on photosynthetic induction in the lower leaves of maize

3 討 論

生長在冠層底部或冠層內(nèi)部葉片，因不同位置遮擋、空氣擾動(dòng)及云層遮擋等因素，難以保證持續(xù)穩(wěn)定光照，一般情況為光斑照射[15-16]。研究表明，光層底部葉片接受光能70%以上屬于短期波動(dòng)光斑。所以，高效利用這部分短暫光能，是光層底層植物生存關(guān)鍵[17]；同時(shí)，高效利用這部分短暫光能，對(duì)冠層底部或冠層內(nèi)部葉片碳積累具有重要意義[18-19]。研究表明，冠層底部葉片具有較高Rubisco 活化酶活性，所以其具有較快光合誘導(dǎo)過程[20]。然而，因較高Rubisco 活化酶活性依賴于較高ATP/ADP 比率，維持較高Rubisco活化酶活性需消耗較多能量[21-22]。因此，遮陰狀態(tài)下，維持較高Rubisco 活化酶活性造成植物消耗能量巨大。光斑僅覆蓋植物較小部分，同時(shí)光斑也可能轉(zhuǎn)移至植株其他部分，通過預(yù)先光照冠層頂部葉片產(chǎn)生的系統(tǒng)信號(hào)，可使其他葉片準(zhǔn)備好預(yù)期光照，植物可能以最小的代價(jià)高效利用光斑。所以，系統(tǒng)調(diào)控對(duì)植物光合誘導(dǎo)具有至關(guān)重要的作用。

目前，Karpinski 等[7]、Lake 等[8]、Hou[10]等已發(fā)現(xiàn)擬南芥和酸模葉片存在長距離信號(hào)傳遞，擬南芥新生葉片解剖結(jié)構(gòu)主要由老葉所處光環(huán)境決定，而與自身所處光環(huán)境關(guān)系不顯著；而酸模成熟葉片之間，也存在光合誘導(dǎo)系統(tǒng)信號(hào)。本試驗(yàn)表明，預(yù)先光照玉米頂部葉片可促進(jìn)中部和底部葉片光合誘導(dǎo)過程，表明玉米也存在光合誘導(dǎo)信號(hào)。這種信號(hào)對(duì)草本植物具有重要意義，使葉片更高效利用光能，增加碳同化量。但關(guān)于信號(hào)傳遞途徑，尚不清楚。相關(guān)研究認(rèn)為信號(hào)物質(zhì)可能是通過木質(zhì)部、韌皮部運(yùn)輸?shù)侥康慕M織或器官[23-24]，也有研究認(rèn)為是電訊號(hào)[25]。TCA 殺死韌皮部細(xì)胞，使物質(zhì)無法通過韌皮部運(yùn)輸。

4 結(jié)論

從試驗(yàn)結(jié)果可見，玉米成熟葉片之間存在系統(tǒng)信號(hào)，這種信號(hào)顯著提高光合誘導(dǎo)過程，提高玉米葉片對(duì)光斑利用效率。本試驗(yàn)研究表明，TCA處理頂部葉片后，即使頂部葉片受到強(qiáng)光照射，也無法促進(jìn)底部葉片光合誘導(dǎo)過程。所以，光合誘導(dǎo)信號(hào)可能通過韌皮部介導(dǎo)。強(qiáng)光照射頂部葉片，使底部葉片H2O2含量升高；TCA 處理頂部葉片基部，即使頂部葉片照射強(qiáng)光也無法增加底部葉片H2O2含量，表明H2O2是通過韌皮部轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)，也抑制底部葉片光合誘導(dǎo)過程，表明H2O2可能是信號(hào)物質(zhì)。為進(jìn)一步證明H2O2信號(hào)物質(zhì)作用，利用DPI處理頂部葉片基部，發(fā)現(xiàn)DPI處理后，即使頂部葉片照射強(qiáng)光也無法增加底部葉片H2O2含量，同時(shí)，也抑制底部葉片光合誘導(dǎo)過程。DPI可猝滅H2O2，進(jìn)一步表明，H2O2在光合誘導(dǎo)中的信號(hào)物質(zhì)作用，且信號(hào)具有方向性，僅從上至下傳導(dǎo)。