西瓜PME基因生物信息學(xué)分析及克隆

王學(xué)征 ，李鈺婷 ，張 博 ，張雨桐 ，張晏航 ，韓文灝，朱子成 ，劉 識(shí) ，劉宏宇

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，哈爾濱 150030；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生院，哈爾濱 150030；4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

隨著人們生活水平逐步提高，對(duì)生活質(zhì)量特別是對(duì)農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)要求越來(lái)越高。農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)主要以商品品質(zhì)、感官品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)為主。果實(shí)質(zhì)地是評(píng)價(jià)西瓜商品性重要指標(biāo)，果實(shí)硬度過(guò)高，難以食用；果實(shí)過(guò)于酥松，口感不佳，不耐運(yùn)輸和貯藏。

果膠是細(xì)胞壁主要成分之一，對(duì)果實(shí)硬度有直接影響。果膠屬于多糖，結(jié)構(gòu)復(fù)雜具有許多被修飾側(cè)鏈。果膠甲酯酶（Pectin methylesterase,PME）廣泛存在于植物和一些具有細(xì)胞壁重塑降解作用的微生物中，可催化細(xì)胞壁中果膠主鏈發(fā)生脫甲酯化反應(yīng)，產(chǎn)生羧基基團(tuán)，同時(shí)釋放氫離子和甲醇，達(dá)到細(xì)胞壁分離目的，降低果實(shí)硬度[1]。齊秀東等研究發(fā)現(xiàn)，在嘎拉蘋(píng)果發(fā)育過(guò)程中，PME基因表達(dá)量增加，果實(shí)硬度顯著下降[2]。Segonne 等研究表明，蘋(píng)果果實(shí)發(fā)育和成熟過(guò)程中PME對(duì)細(xì)胞壁重塑具有重要影響，且特定基因Md-PME2可作為蘋(píng)果質(zhì)地不利性狀表現(xiàn)早期篩選指標(biāo)[3]。

果膠甲酯酶不僅調(diào)控細(xì)胞壁組成、降解[4]和果實(shí)成熟[5]，且在花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)[6]、形成層細(xì)胞分化[7-8]等植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程發(fā)揮重要作用。Thumdee等研究發(fā)現(xiàn)番木瓜軟化與PME相關(guān)[9]。王艷婷通過(guò)體外提取細(xì)胞壁多糖對(duì)擬南芥PMEs超大基因家族中2個(gè)新基因PME1和PME26作遺傳鑒定和表征分析，結(jié)果顯示PME1 和PME26 調(diào)控細(xì)胞壁果膠甲酯化程度，具有催化果膠與HG去甲酯化作用[10]。

PME是多基因家族，近年來(lái)，對(duì)于同一物種PME基因研究不斷深入。熊興鵬研究發(fā)現(xiàn)，BcPME37c基因敲除突變體花粉在雙核時(shí)期出現(xiàn)異常，花粉內(nèi)壁顯著加厚，表明BcPME37c基因突變引起果膠中HG去甲酯化過(guò)程異常，從而影響花粉發(fā)育[11]。目前，PME基因在擬南芥中共鑒定出67 個(gè)[12]、水稻中43個(gè)[13]、大豆中16個(gè)[14]、亞麻中105個(gè)[15]、雷蒙德氏棉中81 個(gè)[16]，但在葫蘆科植物中研究較少。西瓜、甜瓜等葫蘆科植物是主要園藝作物和經(jīng)濟(jì)作物，與模式植物擬南芥在果實(shí)硬度變化等方面存在差異。本試驗(yàn)從模式植物擬南芥和東北農(nóng)業(yè)大學(xué)西甜瓜分子育種課題組西瓜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)入手，通過(guò)生物信息學(xué)分析，選用BLAST 比對(duì)方法在葫蘆科數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定甜瓜、西瓜果膠甲酯酶同源基因，對(duì)其蛋白質(zhì)一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)。在此基礎(chǔ)上，在西瓜中克隆一個(gè)PME基因Cla012554，分析在西瓜各部位及在不同果肉質(zhì)地西瓜果實(shí)發(fā)育過(guò)程中表達(dá)情況，進(jìn)一步探究PME結(jié)構(gòu)及作用機(jī)制，為西瓜果膠甲酯酶基因研究、功能分析及利用提供參考及依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 PME基因生物信息學(xué)分析

1.1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源及BLAST比對(duì)分析

擬南芥4 個(gè)PME基因cDNA 序列來(lái)源于TAIR網(wǎng)站（http://www.arabidopsis.org/），西瓜2 個(gè)PME基因來(lái)源于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)西甜瓜分子育種實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。利用BLAST 比對(duì)分析（BLAST program為BLASTn），將上述基因核苷酸序列在葫蘆科數(shù)據(jù)庫(kù)（http://cucurbitgenomics.org/）甜瓜比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)Melon（DHL92） mRNA 和西瓜比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù) Water?melon（97103）CDS中比對(duì)，找到符合要求基因。

1.1.2PME基因各級(jí)結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)篩選出PME基因mRNA 序列，運(yùn)用Prot?Param（http://web.expasy.org/protparam/）分析 PME 蛋白序列一級(jí)結(jié)構(gòu)（分子質(zhì)量、等電點(diǎn)和氨基酸數(shù)量等）；運(yùn)用ProtScale（http://web.expasy.org/protscale/）分析PME 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)親疏水性；運(yùn)用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）分析PME 蛋白序列二級(jí)結(jié)構(gòu)（α螺旋、β轉(zhuǎn)角、鏈延伸結(jié)構(gòu)和無(wú)規(guī)則卷曲）。運(yùn)用SWISS-MODEL（http://www.swissmodel.expasy.org/）分析PME 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)并構(gòu)建模型；運(yùn)用Cell-PLoc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）對(duì) PME 蛋白質(zhì)作亞細(xì)胞定位。

1.1.3 分子進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

運(yùn)用MEGA 7.0軟件，通過(guò)Neighbor-Joining 對(duì)篩選出PME 蛋白結(jié)構(gòu)域序列作比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，其中矯正參數(shù)值設(shè)置為1 000。

1.2 Cla012554基因克隆及表達(dá)量測(cè)定

1.2.1 材料來(lái)源

栽培西瓜W1-1和黏籽西瓜PI186490由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)西甜瓜分子育種研究室提供，W1-1果實(shí)圓形，果肉軟沙。PI186490 果實(shí)圓形，果肉堅(jiān)硬。其中W1-1 為基因克隆材料，W1-1 和PI186490 為基因時(shí)空表達(dá)材料。采集黏籽西瓜PI186490 和栽培西瓜W1-1 授粉35 d 后根、莖、葉、果肉組織，3 次生物學(xué)重復(fù)。液氮處理，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA備用。

1.2.2 RNA提取及cDNA合成

RNA 提取采用Trizol 提取法，利用東洋紡（上海）生物科技有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)經(jīng)檢驗(yàn)合格RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。其中 RNA 模板為 0.5～1 μg，Primer Mix 0.5 μL，5×RT Buffe 2 μL，RT Enzyme Mix 0.5 μL，水補(bǔ)齊至10 μL。反轉(zhuǎn)錄條件為37 °C 15 min，95 °C 5 min，cDNA在-20 ℃條件下保存。

1.2.3Cla012554基因克隆

根據(jù)葫蘆科數(shù)據(jù)庫(kù)中Cla012554 基因cDNA 序列，利用Primer 6.0 軟件設(shè)計(jì)特異性上、下游引物（見(jiàn)表1 第一條序列），以RNA 反轉(zhuǎn)錄cDNA 為模板，使用TOYOBO KOD One PCR Master Mix 酶作PCR擴(kuò)增。

擴(kuò)增程序如下：98 ℃預(yù)變性1 min，此后33個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)98 ℃變性10 s，58 ℃退火5 s，68 ℃延伸5 s，最終72 ℃延伸1 min。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，選取條帶位置正確且亮度高目的片段回收。通過(guò)載體轉(zhuǎn)運(yùn)至大腸桿菌，將菌液送往生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.2.4Cla012554基因時(shí)空表達(dá)量分析

在多重Real-time 熒光定量PCR 儀下測(cè)定該基因相對(duì)表達(dá)量。引物設(shè)計(jì)采用Primer 6設(shè)計(jì)（見(jiàn)表1第二和第三條序列），均為特異性引物，退火溫度為50～55 ℃。以西瓜Cla020175為內(nèi)參基因。qPCR反應(yīng)試劑為T(mén)HUNDERBIRD SYBR qPCR Mix，反應(yīng)體系及程序參照試劑說(shuō)明書(shū)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算待測(cè)基因相對(duì)表達(dá)量。3次生物學(xué)重復(fù)。

表1 Cla012554基因引物序列Table 1 Primer sequence of Cla012554 gene

2 結(jié)果與分析

2.1 PME基因生物信息學(xué)分析

2.1.1 PME蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

基于擬南芥4個(gè)PME基因以及2個(gè)根據(jù)西甜瓜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)選定西瓜PME基因，通過(guò)BLAST 比對(duì)，在西瓜中鑒定出3 條PME同源基因，在甜瓜中鑒定出2 條PME同源基因。運(yùn)用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)篩選得到PME蛋白序列一級(jí)結(jié)構(gòu)。由表2 可知，西瓜PME基因分布在5號(hào)、7號(hào)和9號(hào)染色體，其中9號(hào)染色體分布最多，有3個(gè)，其余染色體各1個(gè)。甜瓜PME基因分布在1號(hào)和4號(hào)染色體。葫蘆科中PME蛋白氨基酸數(shù)目相差較少，大部分氨基酸數(shù)量約為570，其中Cla014927氨基酸數(shù)目最少（528個(gè)），Cla004251氨基酸數(shù)目最多（604個(gè)）。擬南芥PME蛋白質(zhì)中，氨基酸數(shù)目相差較大，AT4G02330 氨基酸數(shù)量最少（573 個(gè)），AT3G14300 氨基酸數(shù)目最多（968 個(gè)）。葫蘆科PME 蛋白質(zhì)與擬南芥PME 蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和脂肪族指數(shù)較一致，等電點(diǎn)6.3～9.32，脂肪族指數(shù)75.71～89.60。葫蘆科 PME 蛋白質(zhì)與擬南芥 PME 蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)相差較大，葫蘆科PME 蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)平均為33.05，擬南芥PME 蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)平均為26.91。

2.1.2 PME蛋白質(zhì)親疏水性預(yù)測(cè)

運(yùn)用ProtScale 在線軟件預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)親疏水性，由表2 可知，Cla012554（親水性最大值2.444，疏水性最大值3.856）和MELO3C022701T1（親水性最大值2.444，疏水性最大值3.822）具有疏水性外，其余葫蘆科PME 蛋白具有親水性，其中，Cla015505 親水性較強(qiáng)（親水性最大值3.356，疏水性最大值2.900）。

表2 PME蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析Table 2 PME protein primary structure analysis

2.1.3 PME蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

運(yùn)用SOPMA在線軟件預(yù)測(cè)PME蛋白序列二級(jí)結(jié)構(gòu)，由表3 可知，各PME 蛋白主要是α 螺旋（35.55%）和無(wú)規(guī)卷曲（40.86%）構(gòu)成，含較少鏈延伸結(jié)構(gòu)（19.03%），含極少量β轉(zhuǎn)角（5.56%）。在此基礎(chǔ)上，AT3G14300含有較高α螺旋（41.32%），含較少無(wú)規(guī)卷曲（36.88%）和鏈延伸結(jié)構(gòu)（15.81%）；MELO3C022701T1 含較高鏈延伸結(jié)構(gòu)（21.53%）和β轉(zhuǎn)角（6.66%）；AT4G02330 含較多無(wú)規(guī)則卷曲（46.07%）、較少α 螺旋（29.14%）；Cla014927 含較少β轉(zhuǎn)角（4.17%）。

2.1.4 PME蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

Cla012554、Cla015505、AT3G14310 和ME?LO3C022701T1 有 3 種 建 模 構(gòu) 型 ，Cla015103、AT1G53830 和MELO3C021067T1 有 4 種建模構(gòu)型，Cla014927、Cla004251 和AT4G02330 有 5 種建模構(gòu)型，AT3G14300 有6 種建模構(gòu)型，如圖1 所示。在葫蘆科與擬南芥PME 蛋白質(zhì)模型構(gòu)建中，高級(jí)結(jié)構(gòu)模型均含有一條鏈且結(jié)構(gòu)相似。

2.1.5 PME蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果

運(yùn)用Cell-PLoc 2.0 軟件預(yù)測(cè)PME 蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位，PME蛋白均分布于細(xì)胞壁。

2.1.6PME基因分子進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

將篩選得到擬南芥及葫蘆科PME 蛋白質(zhì)，運(yùn)用MEGA 7.0 軟件，通過(guò)Neighbor-Joining 作序列比對(duì)分析且構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)。如圖2所示，PME蛋白質(zhì)可分為2 類(lèi)。在第一類(lèi)中，西瓜Cla012554、Cla014927和Cla0155051，甜瓜MELO3C021067T1和MELO3C022701T1序列存在高度相似，說(shuō)明同一物種及葫蘆科各物種間存在高度同源關(guān)系。第二類(lèi)中，西瓜Cla015103和Cla004251，擬南芥AT4G02330蛋白質(zhì)間高度相似，說(shuō)明其蛋白質(zhì)功能相似。

表3 PME蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Table 3 Prediction of the secondary structure of PME protein

圖1 擬南芥、西瓜和甜瓜PME蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.1 Prediction of high-level structure of PME protein in Arabidopsis,watermelon and melon

圖2 分子進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建Fig.2 Construction of molecular evolutionary tree

2.2 Cla012554基因克隆

Cla012554 基因克隆以栽培西瓜 W1-1 的 2 葉1 心時(shí)期幼葉cDNA 為模板，作PCR 擴(kuò)增，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，選取條帶位置正確且亮度高目的片段回收。通過(guò)載體轉(zhuǎn)運(yùn)至大腸桿菌，將菌液送往生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。菌液經(jīng)測(cè)序后，利用DNAMAN 軟件將測(cè)序結(jié)果與Cla012554基因CDS序列比對(duì)，兩者相似度為95.62%（見(jiàn)圖3），可能品種間存在差異。

2.3 Cla012554基因組織表達(dá)特性

qRT-PCR 分析Cla012554 基因組織表達(dá)特性，由圖4 可知，在正常生長(zhǎng)條件下Cla012554 基因在不同組織中均表達(dá)，其中，莖中表達(dá)量最高，其次為果肉和葉片，根中表達(dá)量最少。

圖3 Cla012554基因測(cè)序結(jié)果序列比對(duì)Fig.3 Sequence alignment of Cla012554 gene sequencing results

圖4 Cla012554基因在W1-1不同組織中相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression of Cla012554 gene in W1-1 different tissues

2.4 Cla012554基因在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中表達(dá)特性

qRT-PCR結(jié)果表明，Cla012554基因隨西瓜果實(shí)發(fā)育，表達(dá)量呈不同變化，結(jié)果見(jiàn)圖5，Cla012554基因在栽培西瓜W1-1 中，隨果實(shí)成熟，果肉軟化，表達(dá)量逐漸上升，在28 d 果實(shí)近成熟時(shí)達(dá)到高峰。而在黏籽西瓜PI186490 果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，果肉未軟化，該基因表達(dá)量也未發(fā)生變化。因此，推測(cè)該基因與西瓜果肉成熟軟化相關(guān)。

圖5 Cla012554基因在兩種西瓜果實(shí)發(fā)育中相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression of Cla012554 gene during fruit development of two watermelon cultivars

3 討 論

本研究從擬南芥4個(gè)果膠甲酯酶基因和2個(gè)來(lái)自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)西甜瓜分子育種西瓜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的果膠甲酯酶基因入手，通過(guò)BLAST 比對(duì)方法在葫蘆科數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定甜瓜、西瓜果膠甲酯酶同源基因，并預(yù)測(cè)分析其生物信息學(xué)。在西瓜中共鑒定出3條PME同源基因，在甜瓜中鑒定出2條PME同源基因。超過(guò)2/3西瓜、甜瓜和擬南芥PME蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)目在584、等電點(diǎn)8.4，脂肪族指數(shù)81.6，不穩(wěn)定指數(shù)31.4，且為可溶蛋白質(zhì)，具有較強(qiáng)親水性。說(shuō)明西瓜、甜瓜與擬南芥PME 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)相似。菊歐文氏桿菌、番茄、胡蘿卜以及棉花PME蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)高度相似[17-19]，均具有3個(gè)內(nèi)含疏水結(jié)構(gòu)折疊的螺旋結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)差異主要表現(xiàn)在半胱氨酸（Cys）殘基、組氨酸（His）殘基和芳香族氨基酸殘基，與本研究結(jié)果一致。葫蘆科作物甜瓜、西瓜PME 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋、無(wú)規(guī)卷曲和鏈延伸結(jié)構(gòu)，含有較少鏈延伸結(jié)構(gòu)和β轉(zhuǎn)角。對(duì)蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)建模，通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)發(fā)現(xiàn)，甜瓜、西瓜與擬南芥果膠甲酯酶蛋白質(zhì)均有不同程度相似性，推斷各物種間PME基因家族間同源性較高。

此外，通過(guò)同源克隆方法獲得西瓜Cla012554基因全長(zhǎng)并分析該基因時(shí)空表達(dá)量，Cla012554 基因作CDS序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相似度為95.62%，表明序列間一致度較高。序列間存在差異，可能是克隆過(guò)程中由于Cla012554基因片段較長(zhǎng)，KOD酶保真性低、切膠回收時(shí)紫外線對(duì)DNA 損傷等產(chǎn)生誤差，也可能是Cla012554基因在葫蘆科植物中存在基因多態(tài)性所致[20-21]。

本研究結(jié)果表明，Cla012554 基因在不同組織中均表達(dá)，說(shuō)明PME基因在西瓜發(fā)育中發(fā)揮重要作用。Cla012554 在莖中表達(dá)量最高，其次是果肉和葉片，在根中表達(dá)量最低。Yang 等從楊樹(shù)中找到果膠甲酯酶基因PtoPME35，基因表達(dá)分析表明PtoPME35 在多種組織中具有組成型表達(dá)模式，莖中表達(dá)量最高[22]。Shoko 等研究表明，擬南芥中AtPME35 在莖特異性表達(dá)最高，是控制莖機(jī)械強(qiáng)度必需基因，結(jié)果表明，果膠甲酯酶基因不僅控制果肉硬度，也增加莖機(jī)械強(qiáng)度，具有抗倒伏作用，在果膠初生細(xì)胞壁及次生細(xì)胞壁中發(fā)揮作用[23]。

果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，Cla012554 基因在W1-1中，隨果實(shí)成熟果肉軟化，基因表達(dá)量不斷升高。PI186490 果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，果肉未軟化且該基因表達(dá)量也未發(fā)生變化。鄧佳等研究發(fā)現(xiàn)，在葡萄柚果實(shí)后熟軟化過(guò)程中，PME基因表達(dá)量均隨果實(shí)軟化呈不同程度增加[24]。由此推斷，PME基因家族中Cla012554基因可能與西瓜果肉成熟軟化相關(guān)。通過(guò)本研究分析葫蘆科PME基因家族生物信息學(xué)，初步了解家族成員，為今后葫蘆科PME基因家族發(fā)掘、利用及種質(zhì)資源改良提供新思路。