貝萊斯芽胞桿菌ZZBV-3的鑒定及其對草莓根腐病的防效

姚錦愛，黃 鵬，賴寶春，余德億*

（1. 福建省作物有害生物監(jiān)測與治理重點實驗室/福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，福州350013；2. 漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，漳州363005）

草莓Fragaria ananassa為多年生宿根性草本植物，具有較高的食用和經(jīng)濟價值。近年來，我國草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，但隨著栽培面積的擴大及土地多年連作，導(dǎo)致根腐越發(fā)嚴重，嚴重時發(fā)病率可達80%以上，給草莓生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟損失[1,2]。尖孢鐮刀菌 Fusarium oxysporum是引起草莓根腐病的主要病原菌之一，作為世界性土傳病原真菌，其寄主范圍廣，還會引起黃瓜枯萎病、辣椒根腐病、棉花枯萎病等100多種植物病害發(fā)生[3]。草莓根腐病發(fā)病初期從幼根前端或中部變成褐色或黑褐色，不定根的中間部位表皮壞死，病健交界明顯，被侵染的植株長勢弱，葉片變黃，分蘗減少，結(jié)果減少，嚴重時維管束褐變、壞死，整株植株萎蔫，最后枯死[4,5]。

目前，對于草莓根腐病的防治仍以化學(xué)防治為主，然而化學(xué)藥劑的長期使用，易導(dǎo)致農(nóng)藥殘留及病原菌產(chǎn)生抗藥性等問題的產(chǎn)生[6,7]。生物防治是目前植物病害防治的發(fā)展方向之一，其中微生物拮抗菌具有對環(huán)境友好、對人類健康安全，在防病的同時還能對作物產(chǎn)生促生作用等優(yōu)點而備受關(guān)注[8-10]?，F(xiàn)階段，雖有解淀粉芽胞桿菌和枯草芽胞桿菌的一些菌株被篩選用于防控草莓根腐病的病原菌尖孢鐮刀菌[11-13]，但可供選擇的菌株資源仍相對較少，因此仍有必要分離篩選對草莓根腐病原菌尖孢鐮刀菌優(yōu)質(zhì)、高效的生防菌株。針對這一需求，本研究以漳州市草莓種植基地的土壤為拮抗菌分離來源，室內(nèi)測定分離菌株對草莓根腐病原菌尖孢鐮刀菌的抑菌活性，從中篩選出抑菌率最高的菌株，并在此基礎(chǔ)上對所篩菌株進行分類鑒定及抑菌譜和盆栽防效測定，為該菌株的應(yīng)用提供支持，也為利用微生物資源防控草莓根腐病提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤樣本采集自漳州市草莓種植基地，使用五點法采樣，在草莓根系周圍10～15 cm深處采集土樣共20份，用營養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基（蛋白胨10 g、牛肉膏粉3 g、氯化鈉5 g、瓊脂17 g、蒸餾水1 L）分離、純化菌株。供試的草莓根腐病原菌 F. oxysporum、花生白絹病菌 Sclerotium rolfsii、草莓灰霉病菌Botrytis cinerea、蘭花根腐病菌 F. oxysporum、蘭花炭疽病菌 C. destructivum、柑橘青霉病菌 Penicillium italicum和玉米黑曲霉病Aspergillus niger等7株病原菌由福建省福州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所提供，菌株保存和活化采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基（馬鈴薯6 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L）。供試草莓均為苗齡6個月的健康植株，采用經(jīng)121 ℃、30 min高壓蒸汽滅菌泥炭土為試驗栽培基質(zhì)，試驗期間常規(guī)肥水管理。供試對照藥劑為50%多菌靈可濕性粉劑（Carbendazim，江蘇藍豐生物化工有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 拮抗菌株的分離 采用稀釋涂布法分離土壤中的細菌[14]，土樣風(fēng)干后稱取1 g放入裝有100 mL無菌水的試管中混勻，依次以10倍梯度稀釋得到各濃度的土壤稀釋液。分別取10-3、10-4和10-5的稀釋液100 μL涂布于NA培養(yǎng)基平板，后倒置于（28±1）℃、RH（80±5）%、光周期12L:12D的HGZ-150型光照培養(yǎng)箱（上?；厶﹥x器制造有限公司）內(nèi)培養(yǎng)2 d，挑取培養(yǎng)基上的單菌落進行轉(zhuǎn)接純化；將純化后的細菌菌株接種于NA斜面培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2 d，后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 拮抗菌株的篩選 以草莓根腐病原菌尖孢鐮刀菌為靶標菌，采用對峙法和抑菌圈法，對分離的細菌進行初篩和復(fù)篩[15,16]。初篩：用5 mm打孔器在純化好的草莓根腐病菌邊緣打孔，將菌餅接入PDA平板培養(yǎng)基中心，用無菌接菌環(huán)在距菌餅25 mm的四個方向分別接入從土壤分離到的細菌，置于與1.2.1相同條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，從中篩選出抑菌帶寬大于5 mm的菌株進行復(fù)篩。復(fù)篩：將5 mm純化好的草莓根腐病菌菌餅接入PDA平板培養(yǎng)基中心，置于與1.2.1相同條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d，加入無菌水，輕輕刮下孢子，充分振蕩混勻，用無菌濾紙過濾，稀釋制成約含1×107孢子/mL的孢子懸浮液。取5 mL孢子懸浮液加入100 mL 45 ℃左右的PDA培養(yǎng)基中，搖勻，倒入培養(yǎng)皿中，制成含尖孢鐮刀菌的平板。取初篩菌株，各自接種到裝有50 mL NB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于（28±1）℃、220 r/min的ZWY-240型旋轉(zhuǎn)式搖床振蕩培養(yǎng)2 d；收集發(fā)酵液，于（12±1）℃、10000 r/min的KDC-140HR型高速冷凍離心機中離心20 min，后取上清液用0.22 μm濾膜過濾除菌得到無菌發(fā)酵液；在含尖孢鐮刀菌的PDA平板上用直徑5 mm的打孔器選擇合適的間距打孔, 并取50 μL濾液注入小孔內(nèi)，靜置30 min后，置于與1.2.1相同條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，測量抑菌圈直徑并記錄試驗結(jié)果。每處理重復(fù)3次，計算每株初篩菌株的抑菌率。

1.2.3 拮抗菌株的鑒定 將菌株接種至PDA平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落的形態(tài)、大小、邊緣、透明度等特征，并結(jié)合革蘭氏染色觀察菌體及芽胞形態(tài)，并對照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[17]從形態(tài)特征初步鑒定菌株的屬；結(jié)合16S rDNA和gyrB基因進行分子生物學(xué)鑒定[18,19]，從基因?qū)用孀罱K確定所篩拮抗菌株的種。用細菌基因組DNA提取試劑盒（OMEGA）提取細菌的DNA。采用16S rDNA基因通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）[18]和 gyrB 基因簡并引物（UP-1: 5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′和UP-2r: 5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′，其中 Y＝C/T, R＝A/G,N=A/G/C/T）[19]，通過C1000 Thermal Cyclers 型PCR儀（Bio-Rad）對細菌基因組DNA進行擴增，其PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。使用DYCP-31DN型瓊脂糖水平電泳儀（北京六一生物科技有限公司）檢測PCR擴增產(chǎn)物，另用試劑盒回收目的條帶，再送樣生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序；先對所測序列進行 BLAST 同源性比對，后上傳登錄至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中，并從GenBank數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)菌株的16S rDNA和gyrB基因序列，在MEGA 5.0上用Neighbor-joining分析法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.2.4 拮抗菌株的抑菌譜 以小核菌屬的花生白絹病菌、葡萄孢核盤菌屬的草莓灰霉病菌、鐮刀菌屬的蘭花根腐病菌、炭疽菌屬蘭花炭疽病菌、青霉菌屬的柑橘青霉病菌、曲霉屬的玉米黑曲霉病菌等6個屬的6種植物病原菌為靶標菌，按照1.2.2中初篩方法活化培養(yǎng)所鑒定拮抗菌和靶標菌，測定所鑒定菌株對6種植物病原菌的抑菌帶寬，以抑菌帶寬大于5 mm為抑菌指標[20]。

1.2.5 拮抗菌株的盆栽防效 試驗使用草莓“紅顏”和“甜查理”兩個品種進行，試驗設(shè) 3個處理：1）每株先灌根107孢子/mL尖孢鐮刀菌菌液10 mL，2 d后噴施無菌水20 mL；2）每株先灌根107孢子/mL尖孢鐮刀菌菌液10 mL，2 d后再噴施108cfu/mL生防菌ZZBV-3發(fā)酵液20 mL；3）每株先灌根107孢子/mL尖孢鐮刀菌菌液10 mL，2 d后再噴施1000倍50%多菌靈溶液20 mL。每處理30株，重復(fù)3次。接種后第14 d統(tǒng)計病情指數(shù)并計算防效，病情分級標準：0級，無病斑；1級，0＜病斑面積占總面積≤5%，植株長勢受損；2級，5%＜病斑面積占總面積≤15%，植株根莖部出現(xiàn)病斑；3 級，15%＜病斑面積占總面積≤25%，植株根莖病部擴大，呈現(xiàn)黑腐狀；4級，25%＜病斑面積占總面積≤50%，葉片萎蔫倒伏；5級，病斑面積占總面積＞50%，植株死亡。病情指數(shù)＝Σ（各級病株數(shù)×各級級數(shù)）/（調(diào)查總株數(shù)×5）×100；防治效果（%）＝（對照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù)）/對照區(qū)病情指數(shù)×100。。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用DPS 7.05數(shù)據(jù)處理軟件的DMRT檢驗法，分析比較拮抗菌株ZZBV-3對6種植物病原菌抑菌寬度及盆栽防效的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的分離和篩選

通過稀釋涂布法共分離到 39株菌株，將分離得到的菌株與草莓根腐病菌做生長對峙試驗，初篩出抑菌帶寬大于5 mm的菌株共3株用于復(fù)篩。復(fù)篩結(jié)果表明，菌株ZZBV-3抑菌活性最好，其抑菌圈直徑為16.2 mm，對草莓根腐病菌的生長具有抑制作用（圖1A）。

2.2 拮抗菌株的鑒定

菌株接種至NA培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h后生長良好，菌落呈淡黃色、邊緣不規(guī)則、表面平滑、干燥（圖1B），屬革蘭氏陽性菌，菌體桿狀，長度1.2～1.7 μm，寬度0.5～0.6 μm，芽胞間生（圖1C），對照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，初步將此菌株歸為芽胞桿菌屬。

圖1 菌株ZZBV?3的抑菌圈直徑（A）、菌落特征（B）和顯微特征（C）Fig. 1 Inhibition diameter (A), colony morphology (B) and microscopic morphology (C) of strain ZZBV?3

對菌株ZZBV-3的DNA進行16S rDNA和gyrB擴增，經(jīng)測序獲得1445和1162 bp的序列片段；系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，菌株ZZBV-3的16S rDNA基因序列（登錄號：MW345914）與貝萊斯芽胞桿菌Bacillus velezensis模式菌株（登錄號：MK641661、EF433407、KY694464）相似度分別為100%、99.83%和99.83%（圖 2A），gyrB基因序列（登錄號：MW350103）與貝萊斯芽胞桿菌模式菌株（登錄號：MH921421和LC191187）相似度分別為99.83%和99.74%（圖2B）。結(jié)合生防菌ZZBV-3菌株的形態(tài)特征，最終將ZZBV-3菌株鑒定為貝萊斯芽胞桿菌。

圖2 基于16S rDNA（A）和gyrB（B）序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of strain ZZBV?3 constructed on the basis of 16S rDNA (A) and gyrB (B) sequences

2.3 拮抗菌株的抑菌譜

抑菌譜測定表明，菌株ZZBV-3對6個屬的6種常見植物病原菌均具有不同程度的抑制作用，其中對鐮刀菌屬的蘭花根腐病菌抑制作用最強，抑菌帶寬達18.1 mm，對其他5個屬的植物病原菌也有良好的抑制作用，抑菌帶寬12.6～16.3 mm（表1）?？梢?，拮抗放線菌ZZBV-3對多種病原菌具有良好的抑菌效果。

表1 菌株ZZBV?3對6種植物病原菌的抑菌帶寬Table 1 Inhibition width of strain ZZBV?3 against 6 phytopathogens

2.4 拮抗菌株的盆栽防效

盆栽試驗結(jié)果表明，接種2 d后，噴施無菌水的“紅顏”和“甜查理”品種均出現(xiàn)了葉片萎蔫、莖稈腐爛倒伏、植株死亡等病狀；接種14 d后，“紅顏”品種的病情指數(shù)達34.22、“甜查理”為57.11；而經(jīng)過菌株ZZBV-3發(fā)酵液和1000倍50%多菌靈處理的植株，“紅顏”品種病情指數(shù)僅為7.56和6.44；“甜查理”品種病情指數(shù)僅為10.67和9.33。從防治效果可以看出，菌株ZZBV-3發(fā)酵液在“紅顏”和“甜查理”上防治效果達77.96%和81.18%，與施用1000倍50%多菌靈的防治效果80.98%和83.54%無顯著差異（表2）。說明該菌株ZZBV-3對尖孢鐮刀菌引起的草莓根腐病具有抑制作用。

表2 菌株ZZBV?3對草莓根腐病的盆栽防效Table 2 Control efficacy of strain ZZBV?3 on strawberry root rot

3 討論

生物防治是一種安全、有效、持久的控害方法，其中利用拮抗菌防治植物病害和促進植物生長已成為重要發(fā)展方向和研究熱點之一[21-23]。菌株篩選和鑒定是拮抗菌應(yīng)用的基礎(chǔ)，是生物防治能否成功的關(guān)鍵所在；本研究從草莓種植基地土壤中分離篩選出一株對草莓根腐病菌尖孢鐮刀菌具有顯著拮抗效果的生防菌株ZZBV-3，其抑菌圈直徑達16.2 mm；根據(jù)對生防菌株ZZBV-3的菌落形態(tài)觀察、結(jié)合16S rDNA和gyrB序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，最終將菌株ZZBV-3鑒定為貝萊斯芽胞桿菌。貝萊斯芽胞桿菌是一種新型生防細菌，王偉等[24]報道菌株X-75對番茄灰霉病菌灰葡萄孢菌Botrytis cinerea具有明顯的拮抗作用，李生樟等[25]發(fā)現(xiàn)菌株 504 對水稻細菌性條斑病菌黃單胞菌Xanthomonas oryzae具有顯著的抑制作用，Nam等[26]發(fā)現(xiàn)菌株nsb-1對草莓炭疽病菌膠孢炭疽菌C. gloeosporioides有良好抑菌作用。本研究中的貝萊斯芽胞桿菌ZZBV-3不僅對草莓根腐病菌具有顯著的拮抗效果，對其他6個屬的6種常見植物病原菌也有良好的抑制作用，抑菌譜廣，研究結(jié)果為進一步研究其在田間應(yīng)用中的效果提供了理論基礎(chǔ)。

拮抗菌株僅在室內(nèi)試驗中表現(xiàn)出拮抗作用還是不夠的，只有在田間應(yīng)用中依舊表現(xiàn)出良好抑菌防效的生防菌株，才具有生防應(yīng)用潛力[27]。本研究中菌株ZZBV-3對草莓“紅顏”和“甜查理”品種上根腐病的盆栽防效達77.96%和81.18%，不僅與施用1000倍50%多菌靈的防治效果80.98%和83.54%相差不大，還與雷白時等[12]利用解淀粉芽胞桿菌防治草莓根腐病、李玉洋等[28]利用解淀粉芽胞桿菌SN06防治棉花枯萎病、任遷琪等[29]利用鏈霉菌F32防治西瓜枯萎病的盆栽防治效果相似。說明菌株ZZBV-3對草莓根腐病的發(fā)生具有抑制作用，在實際應(yīng)用中具有一定的生防潛力，研究結(jié)果在豐富草莓根腐病原菌尖孢鐮刀菌的生防資源的同時推動了貝萊斯芽胞桿菌等微生物資源在植物病害生防中的應(yīng)用研究。

拮抗菌株有效定殖是其發(fā)揮防治植物病害功效的首要條件[27]，菌株ZZBV-3如欲投入生產(chǎn)使用，還需探討其在草莓植株體內(nèi)和栽培基質(zhì)中的定殖能力及定殖后的生防能力，也需進一步分析其代謝產(chǎn)物中的抑菌活性物質(zhì)，明確其抑菌機制，只有這樣才能更加安全、有效、長久地利用拮抗菌株防控目標作物上的致病菌。