羅曼粉蛋雞感染E亞型禽白血病病毒的分子生物學(xué)檢測(cè)分析

何建宇， 孫 蕓，2， 徐 飛，2， 羅東還，2， 張小波，2， 吳詩(shī)卉， 冉 鳳， 龍小川， 王廷龍， 李 濤， 溫貴蘭，2*

(1. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025； 2. 貴州省動(dòng)物生物制品工程技術(shù)研究中心，貴州貴陽(yáng)550016； 3. 貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，貴州貴陽(yáng)550008)

禽白血病是由反轉(zhuǎn)錄病毒科、α反轉(zhuǎn)錄病毒屬的禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)引起的禽類腫瘤疾病[1]。根據(jù)血清中和試驗(yàn)、宿主范圍、囊膜糖蛋白特性等，ALV可分為A～K 11個(gè)亞群[2，3]。根據(jù)自然傳播方式與病毒復(fù)制的生物學(xué)特性，ALV又可劃分為外源性病毒和內(nèi)源性病毒，其中A、B、C、D、J、K為外源性病毒，E、F、G、H、I為內(nèi)源性病毒。通常情況下，E亞群ALV無(wú)致病性或致病性較弱[4]，但會(huì)影響外源性ALV的檢測(cè)，造成結(jié)果誤差[5]。由于外源性ALV與內(nèi)源性ALV同時(shí)存在的情況時(shí)有發(fā)生，也極易造成不同亞群之間的基因重組[6]。2021年11月1日，貴州省惠水縣某養(yǎng)殖場(chǎng)的羅曼粉蛋雞出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，3天內(nèi)共死亡89只，產(chǎn)蛋率下降7%?，F(xiàn)將養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的10只病死雞進(jìn)行禽白血病病毒排查檢測(cè)情況報(bào)道如下，供參考。

1 材料與方法

1.1 檢測(cè)病料采集10只送檢病死雞的肝臟、脾臟(分別編號(hào)1～10)作為檢測(cè)病料。

1.2 主要試劑2×EsTaqDNA聚合酶(購(gòu)自康為世紀(jì)有限公司)、RNA提取試劑盒(購(gòu)自世紀(jì)元亨公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DL 2 000 DNA Marker[均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司]。

1.3 主要儀器高速冷凍離心機(jī)(型號(hào)：TGL-18M，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司)、基因擴(kuò)增儀(型號(hào)：T20，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)、電泳儀(型號(hào)：DYY-8C，北京市六一儀器廠)。

1.4 引物設(shè)計(jì)ALVp27基因是ALV各亞群的高度保守基因，內(nèi)源性和外源性病毒中均存在。P27蛋白是ALV群特異性抗原，是ALV核心衣殼蛋白的主要成分，含量高，占病毒總蛋白的30%以上，是制備檢測(cè)抗體的首選抗原[7]。因此本試驗(yàn)參考徐麗等[8]的方法，利用Primer Premier 7.0軟件設(shè)計(jì)ALVp27基因的通用擴(kuò)增引物。按照張喜懿等[9]的方法，參照GenBank中ALV-A(登錄號(hào)：MF926337)、ALV-B(登錄號(hào)：M14902)、ALV-K(登錄號(hào)：KP686142)的p27基因序列，以及ALV-J(登錄號(hào)：Z46390)的gp85基因序列，分別設(shè)計(jì)A、B、J、K亞型ALV核酸檢測(cè)擴(kuò)增引物。按照黃新[10]的方法，參照ALV-E(登錄號(hào)：KF746200)的p27基因序列設(shè)計(jì)E亞型ALV核酸檢測(cè)擴(kuò)增引物。各引物信息見(jiàn)表1。

表1 引物信息

1.5 ALV核酸檢測(cè)液氮條件下研磨肝臟、脾臟，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)方法提取總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒明書(shū)方法合成各病毒cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系：dNTP Mix 4 μL、Primer Mix 2 μL、RNA Template 4 μL、5×RT Buffer 4 μL、DTT 2 μL、HifiScript 1 μL、加入RNase-Free Water補(bǔ)足至20 μL。反轉(zhuǎn)錄程序：42 ℃ 45 min，85 ℃ 5 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物-20 ℃保存?zhèn)溆?。以各cDNA為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系25 μL：2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件見(jiàn)表2。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表2 PCR反應(yīng)條件

1.6 ALV-E的遺傳進(jìn)化分析將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果上傳至 NCBI(美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心)、BLAST(生物大分子序列比對(duì)搜索工具)進(jìn)行比對(duì)，以GenBank中11株ALV各亞型毒株為參考株，利用生物信息分析軟件MegAlign 7.1進(jìn)行同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。參考毒株信息見(jiàn)表3。

表3 參考毒株信息

2 結(jié)果與分析

2.1 ALV核酸檢測(cè)結(jié)果PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，1、2、3、5、6、9號(hào)病料在744 bp處出現(xiàn)特異性條帶，說(shuō)明10只病死雞中有6只存在ALV感染(見(jiàn)圖3)。6份陽(yáng)性樣品經(jīng)ALV-E亞型檢測(cè)同樣在1 074 bp處出現(xiàn)特異條帶(見(jiàn)圖4)。

2.2 遺傳進(jìn)化分析將雞場(chǎng)分離的病毒株(命名為：HS202101S株)與11株ALV參考株進(jìn)行同源性分析，結(jié)果HS202101S毒株與ALV-E亞型的E-ros001、E-B9、E-TYR毒株同源性最高，均為99.1%；與ALV-J亞型的GZN16毒株同源性最低，為37.1%；與其他亞型毒株同源性均相對(duì)較低，為37.3%～41.2%。 構(gòu)建HS202101S毒株與11株ALV參考毒株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，由圖5可見(jiàn)：HS202101S毒株與E-ros001、E-B9、E-TYR屬于1個(gè)小分支，進(jìn)化關(guān)系最近。

M：DL 2 000 DNA Marker； -：陰性對(duì)照； +：陽(yáng)性對(duì)照； 1～10：檢測(cè)樣品圖3 ALV核酸PCR檢測(cè)

M：DL 2 000 DNA Marker； 1～6：檢測(cè)樣品； +：陽(yáng)性對(duì)照； -：陰性對(duì)照?qǐng)D4 ALV-E核酸PCR檢測(cè)

圖5 ALV系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

3 結(jié)論

經(jīng)實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)檢測(cè)分析，貴州省惠水縣某養(yǎng)雞場(chǎng)存在ALV-E感染。

4 討論

4.1本次檢測(cè)旨在排查惠水縣某養(yǎng)雞場(chǎng)的羅曼粉蛋雞是否存在ALV感染，結(jié)果表明在沒(méi)有特征癥狀情況下，6只雞存在ALV-E內(nèi)源性感染。內(nèi)源性ALV是存在于雞染色體基因組上的 ALV前病毒基因組或片段，可隨染色體的復(fù)制而垂直傳播，致瘤性很低。外源性 ALV 通常不通過(guò)宿主細(xì)胞染色體傳遞給下一代[11]，可誘發(fā)腫瘤，可垂直和水平傳播。

4.220世紀(jì)90年代，我國(guó)首次分離到外源性ALV-J，主要是從國(guó)外引進(jìn)白羽雞所致，隨后國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖的黃羽雞、蛋雞及地方品種雞陸續(xù)被各型ALV感染，并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，其中引起雞發(fā)病死亡的主要是外源性ALV。大部分雞的染色體基因組中存在ALV的前病毒DNA，宿主體內(nèi)的ALV-E在一定條件下可產(chǎn)生完整的病毒粒子或表達(dá)某些特征蛋白質(zhì)。攜帶完整ALV-E病毒粒子的雞往往對(duì)其他外源性ALV 的抵抗力較差，更容易發(fā)生外源性 ALV 誘發(fā)的禽白血病腫瘤[11]。ALV-E 基因座遵循孟德?tīng)栠z傳方式，很多ALV-E原病毒是不完整或轉(zhuǎn)錄沉默的，但仍然有一些完整的、能夠活躍轉(zhuǎn)錄并產(chǎn)生感染性病毒的元件存在，這些具有轉(zhuǎn)錄活性元件的ALV-E會(huì)影響雞的產(chǎn)蛋量和蛋重等重要的經(jīng)濟(jì)特征；此外，攜帶ALV-E21毒株的低羽鳥(niǎo)類與正常羽鳥(niǎo)類相比，產(chǎn)量較低，死亡率較高[12]。綜上所述，對(duì)于E亞型禽白血病病毒的研究也應(yīng)當(dāng)引起重視。