雪山草雞感染傳染性法氏囊病病毒新型變異株的鑒定

姜 楠，王雨龍，張文英，牛鑫鑫，劉長軍，高玉龍，高 立，崔紅玉，李 凱，潘 青，張艷萍，劉愛晶，王笑梅，3，祁小樂

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室禽傳染病研究室，黑龍江哈爾濱 150069；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織傳染性法氏囊病參考實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150069；3.揚(yáng)州大學(xué)，江蘇省動(dòng)物重要疫病與人畜共患病協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009）

傳染性法氏囊?。╥nfectious bursal disease，IBD）是由傳染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus，IBDV）引起雛雞的一種急性、高度接觸性、免疫抑制性傳染病[1]。IBDV 主要侵害雛雞的中樞免疫器官法氏囊，導(dǎo)致其不同程度損傷，進(jìn)而引起免疫抑制，造成疫苗免疫失敗，嚴(yán)重威脅養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。

IBDV 的基因組為分節(jié)段的雙鏈RNA，分為A、B 兩個(gè)節(jié)段，A 節(jié)段長3 260 bp，包含兩個(gè)部分重疊的開放閱讀框架（open reading frame，ORF）。小ORF 在前，編碼VP5 蛋白；大ORF 在后，編碼NH2-pVP2-VP4-VP3-COOH 多聚蛋白。多聚蛋白被具有水解酶活性的VP4 蛋白水解為pVP2、VP4 和VP3，之后pVP2 被進(jìn)一步加工形成成熟的VP2[2]。VP2 蛋白是IBDV 的衣殼蛋白和主要保護(hù)性抗原，其編碼基因是IBDV 最重要的毒力基因，也決定著IBDV 的細(xì)胞嗜性。VP2 蛋白高變區(qū)（第206～350 位氨基酸）易發(fā)生突變，是A 節(jié)段基因特征的代表區(qū)段，常被用于IBDV 的遺傳演化分析[3]。B 節(jié)段長2 827 bp，僅編碼具有RNA 依賴的RNA 聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）活性的VP1 蛋白。VP1 蛋白與IBDV 毒力和遺傳演化也有重要關(guān)系[4-5]。VP1蛋白第110～252 位氨基酸序列被稱為B-marker，是B 節(jié)段基因特征的代表區(qū)段[6]。

1957 年，IBDV 首次在美國特拉華州甘布羅鎮(zhèn)被發(fā)現(xiàn)，隨后演化出了經(jīng)典毒株（classic IBDV，cIBDV）、變異毒株（variant IBDV，varIBDV）和 超 強(qiáng) 毒 株（very virulent IBDV，vvIBDV）。vvIBDV 和varIBDV 于20 世紀(jì)80 年代末和90 年代初在我國相繼出現(xiàn)，且vvIBDV 的高致死率給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[7]。隨著飼養(yǎng)環(huán)境的改善和疫苗的廣泛應(yīng)用，vvIBDV 的流行正在被有效控制。然而近年來，IBDV 新型變異株在我國主要養(yǎng)禽地區(qū)廣泛流行，在肉雞群[8]和蛋雞群[9]中都可檢測(cè)到該毒株。最近，日本也發(fā)現(xiàn)了IBDV 新型變異株的流行[10]。由于缺乏抗原性完全匹配的疫苗，IBDV 新型變異株流行范圍仍在擴(kuò)大，已成為養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的新威脅。本研究對(duì)地方品種雪山草雞的某免疫雞群進(jìn)行了IBDV 新型變異株的鑒定，以期為IBDV 流行的綜合防控提供參考。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣品采集及處理 2020 年9 月，江蘇省某雞場(chǎng)的雪山草雞出現(xiàn)疑似非典型IBD 癥狀，發(fā)病雞群為28 日齡，發(fā)病雞生長遲緩，剖檢可見法氏囊明顯萎縮，其他臟器未出現(xiàn)明顯病變。該雞群于1 日齡免疫過vvIBDV 疫苗。隨機(jī)采集發(fā)病雞法氏囊3 份，剪取適量組織置于無菌EP 管中，按1 g/mL 的比例加入無菌PBS，于組織研磨器上充分研磨得到組織勻漿，反復(fù)凍融3 次后于4 ℃5 000g離心10 min，取上清用于后續(xù)檢測(cè)。

1.1.2 主要試劑 RNAiso Plus，購自大連寶生物工程有限公司；M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自美國Invitrogen 公司；2×TaqDNA 聚合酶，購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 中的IBDV 流行毒株參考序列，設(shè)計(jì)針對(duì)VP2基因高變區(qū)和VP1基因代表區(qū)段的特異性檢測(cè)引物（表1），由北京擎科生物科技有限公司合成。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.2.2 RT-PCR 檢測(cè)及VP2基因高變區(qū)擴(kuò)增 取200 μL 上述法氏囊組織混懸液上清，依據(jù)RNAiso Plus 產(chǎn)品說明書提取組織總RNA，使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用針對(duì)IBDVVP2基因高變區(qū)的特異性引物P1/P2 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)RT-PCR 產(chǎn)物，預(yù)期擴(kuò)增片段的長度為643 bp；然后對(duì)RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并將VP2高變區(qū)序列上傳至GenBank。同時(shí)，以本實(shí)驗(yàn)室保存的IBDV 弱毒株Gt 株作為陽性對(duì)照，以去離子水為陰性對(duì)照。

1.2.3VP1基因代表區(qū)擴(kuò)增 以1.2.2 中檢測(cè)為陽性的樣品cDNA 為模板，利用針對(duì)IBDVVP1基因代表區(qū)段（B-marker）的特異性引物B293U/B1008L 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)RT-PCR 產(chǎn)物，預(yù)期擴(kuò)增片段長度為716 bp；然后對(duì)RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并將B-marker 序列上傳至GenBank。同時(shí)，以本實(shí)驗(yàn)室保存的IBDV 弱毒株Gt 株作為陽性對(duì)照，以去離子水為陰性對(duì)照。

1.2.4 遺傳演化分析 依據(jù)VP2基因高變區(qū)核苷酸序列和VP1基因B-marker 核苷酸序列，運(yùn)用序列分析軟件Clustal X program（version 2.0）進(jìn)行序列比對(duì)，使用軟件MAGA6.0 中的最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹。相關(guān)參考毒株及其GenBank 登錄號(hào)見表2。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR 檢測(cè)

檢測(cè)結(jié)果顯示：本批樣品的IBDV 陽性率為100%（3/3）。VP2高變區(qū)引物擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的目的條帶，約為643 bp（圖1-A）；VP1B-marker 引物擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的目的條帶，約為716 bp（圖1-B）。將這3 株IBDV 分別 命 名 為IBDV-JS20-9321、IBDV-JS20-9322 和IBDV-JS20-9325。3 株毒株VP2高變區(qū)序列和VP1B-marker 序列的GenBank 登錄號(hào)分別為：IBDVJS20-9321（MW328552/MW328555）、IBDV-JS20-9322（MW328553/MW328556）、IBDVJS20-9325（MW328554/MW328557）。

表2 相關(guān)參考毒株及其GenBank 登錄號(hào)

圖1 IBDV VP2 和VP1 代表區(qū)段擴(kuò)增結(jié)果

2.2 遺傳演化分析

2.2.1VP2和VP1代表區(qū)段遺傳進(jìn)化樹分析依據(jù)IBDV 基因型分型方法[11]，基于VP2基因高變區(qū)核苷酸序列的遺傳進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，IBDV 共分為9 個(gè)基因型，血清I 型包含A1—A8 共8 個(gè)基因型，其中A2 基因型包括A2a、A2b、A2c 和A2d 共4 個(gè)基因亞型。本試驗(yàn)鑒定的IBDV-JS20-9321 株、IBDV-JS20-9322 株 和IBDVJS20-9325 株與IBDV 新型變異株代表毒株SHG19均屬于A2 基因型中的A2d 亞型（圖2-A）?；赩P1基因B-marker 的核苷酸序列進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，IBDV 共分為5 個(gè)基因型，其中血清I 型包含B1—B4 共4 個(gè)基因型，IBDV-JS20-9321 株、IBDV-JS20-9322 株和IBDV-JS20-9325 株與SHG19均屬于B1 基因型（圖2-B）。綜合基因組雙節(jié)段特征判定，本次鑒定的3 株IBDV 毒株與SHG19毒株處于同一分支，是IBDV 新型變異株，為A2dB1 基因型。

圖2 IBDV 基因核苷酸序列遺傳進(jìn)化樹分析結(jié)果

2.2.2VP2和VP1代表區(qū)核苷酸同源性比對(duì)

2.2.2.1VP2VP2高變區(qū)的核苷酸序列同源性比對(duì)結(jié)果顯示，IBDV-JS20-9321 株、IBDVJS20-9322 株 和IBDV-JS20-9325 株 與A2 基 因型IBDV 毒株（變異株）的同源率較高，為89.6%～98.6%，其中與A2d 基因亞型毒株（新型變異株）的同源性最高，為95.6%～98.6%。進(jìn)一步比對(duì)發(fā)現(xiàn)，IBDV-JS20-9321 株和IBDV-JS20-9325株與SHG19 株的同源率均高達(dá)98.6%，IBDVJS20-9322 株與SHG19 株的同源率高達(dá)98.2%。IBDV-JS20-9321 株、IBDV-JS20-9322 株 和IBDVJS20-9325 株與變異株其他3 個(gè)基因亞群A2a、A2b 和A2c 的 同 源 率 分 別 為94.3%～94.5%、93.1%～93.4% 和89.6%～92.0%；與A1 基 因 群（經(jīng)典毒株）、A3 基因群（超強(qiáng)毒株）和A8 基因群（弱毒株）的同源率分別為89.4%～91.7%、88.0%～90.1% 和90.8～91.7%；與 血 清I 型 其 他4 個(gè)基因群（A4、A5、A6 和A7）毒株的同源率 較 低，為84.9%～89.8%。IBDV-JS20-9321 和IBDV-JS20-9325 的同源率為100%，其與IBDVJS20-9322 的同源率為98.6%。

2.2.2.2VP1基于VP1基因代表區(qū)段的核苷酸序列同源性比對(duì)結(jié)果顯示，分離毒株（IBDVJS20-9321 株、IBDV-JS20-9322 株 和IBDVJS20-9325 株）與B1 基因型IBDV 毒株的同源率較高，為93.3%～98.8%，其中與IBDV 新型變異株SHG19 同源率最高，可達(dá)98.8%；而與B2 基因型（超強(qiáng)毒株）、B3 基因型（HLJ0504 樣毒株）以及B4 基因型（過渡型毒株）同源率較低，分別為86.3%～86.5%、87.0%～89.1%和86.5%～87.4%。IBDV-JS20-9321 株、IBDV-JS20-9322 株 和IBDVJS20-9325 株間的同源率為100%。

2.2.3VP2高變區(qū)關(guān)鍵氨基酸比對(duì)VP2高變區(qū)關(guān)鍵氨基酸比對(duì)結(jié)果（表3）顯示，IBDVJS20-9321 株、IBDV-JS20-9322 株 和IBDVJS20-9325 株不僅具有A2 基因型毒株（變異株）共有的4 個(gè)特征性氨基酸222T、249K、286I 和318D，還具有A2d 基因亞型毒株（新型變異株）的3 個(gè)獨(dú)特氨基酸221K、252I 和299S。VP2高變區(qū)核苷酸比對(duì)結(jié)果顯示，與A2dB1 基因型（新型變異株）代表毒株SHG19 相比，IBDV-JS20-9322株存在14 個(gè)核苷酸突變，其中第1 076 位的核苷酸突變引起了VP2 蛋白的氨基酸突變（T359K）；IBDV-JS20-9321 株 和IBDV-JS20-9325 株 雖 然 存在11 個(gè)核苷酸突變，但均為無義突變。VP1基因B-marker 核苷酸比對(duì)結(jié)果顯示，分離毒株（IBDVJS20-9321 株、IBDV-JS20-9322 株 和IBDVJS20-9325 株）與SHG19 株相比存在5 個(gè)無義核苷酸突變。

3 討論

2017 年以來，IBDV 新型變異株在我國和日本主要養(yǎng)禽地區(qū)廣泛流行[8-10，12-13]。IBDV 新型變異株雖然不能致雞死亡，但在感染后3～5 d 可導(dǎo)致中樞免疫器官法氏囊的急性損傷和免疫抑制，進(jìn)而造成禽流感等疫苗免疫失敗和繼發(fā)感染以及增重等生產(chǎn)性能明顯下滑[10，13]。該毒株導(dǎo)致的亞臨床IBD給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。IBDV 新型變異株流行范圍不斷擴(kuò)大，在肉雞群和蛋雞群中均有流行。雪山草雞是我國優(yōu)良的地方品種雞之一。本研究在地方品種雪山草雞群中檢測(cè)到IBDV 新型變異株，但該雞群曾于1 日齡免疫過用于防控vvIBDV 感染的疫苗。研究[14]發(fā)現(xiàn)，新近流行的IBDV 新型變異株與vvIBDV 抗原性不匹配是導(dǎo)致IBDV 新型變異株免疫逃匿并蔓延的重要原因。

IBDV 傳統(tǒng)上分為經(jīng)典株、變異株、超強(qiáng)毒株和弱毒株。這種描述性分類方法已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法涵蓋新出現(xiàn)毒株（包括IBDV 新型變異株）的分子特征。最近，一種基于IBDV 基因組雙節(jié)段特征的IBDV 基因型分類方法[11]被提出：基于A 節(jié)段編碼的VP2高變區(qū)，IBDV 可分為A1—A8 以及AII 等9 個(gè)基因型；基于B 節(jié)段編碼的VP1B-marker，IBDV 可 分 為B1—B4 以 及BII 等5 個(gè)基因型；每個(gè)毒株可綜合A、B 的分子特征進(jìn)行基因型分類。在該分型系統(tǒng)里，變異株被歸類于A2B1 基因型。該基因型又分為4 個(gè)基因亞型，即A2aB1、A2bB1、A2cB1 和A2dB1。遺傳演化分析發(fā)現(xiàn)，本研究在雪山草雞上鑒定的IBDV 毒株（IBDV-JS20-9321 株、IBDV-JS20-9322 株 和IBDV-JS20-9325 株）與IBDV 新型變異株代表毒株SHG19 處于同一個(gè)分支，為A2dB1 基因型。與早期在北美洲流行的變異株不同，這3 個(gè)毒株的VP2高變區(qū)編碼蛋白上含有IBDV 變異株的特征性氨基酸，也具有IBDV 新型變異株的獨(dú)特氨基酸。氨基酸222T、249K、286I 和318D 已被證明與IBDV 抗原變異密切相關(guān)[15-16]，而氨基酸221K、252I 和299S 的生物學(xué)意義尚待進(jìn)一步研究。

表3 IBDV VP2 基因高變區(qū)關(guān)鍵氨基酸比對(duì)結(jié)果

IBDV 新型變異株在肉雞、蛋雞和地方品種雞的免疫雞群中不斷蔓延，已經(jīng)成為包括我國和日本在內(nèi)的東亞地區(qū)養(yǎng)禽業(yè)的重要威脅，其遺傳演化規(guī)律研究以及新疫苗的創(chuàng)制研究對(duì)IBDV 流行的綜合防控和養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。