禽白血病病毒抗原高敏熒光微球快速定量檢測(cè)方法的建立

孫 雨，劉亞濤，王睿男，蔣 菲，馬 英，李秀梅，王 文，原小燕，顧小雪，王傳彬

（1.中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102600；2.新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，新疆烏魯木齊 830000；3.洛陽現(xiàn)代生物技術(shù)研究院有限公司，河南洛陽 471000）

禽白血病病毒又稱禽C 型腫瘤病毒，屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科禽C 型反轉(zhuǎn)錄病毒屬。禽白血病病毒和肉瘤病毒緊密相關(guān)，因此又稱禽白血病/肉瘤病毒。自然情況下，該病毒可感染家養(yǎng)雞、野雞（珍珠雞）、鵪鶉、鷓鴣等禽類。4～10 月齡母禽發(fā)病較多，性成熟或即將性成熟的禽群容易發(fā)病。該病呈世界性分布，在我國福建、廣東、廣西以及山東等地方品系雞群中均有不同程度的發(fā)生[1]。不同品種的雞對(duì)該病毒易感性差異較大，AA 雞與艾維茵雞的易感性明顯高于新布羅雞、羅斯雞、京白雞[2]。該病感染率高，容易引起病禽發(fā)育遲緩、免疫抑制、生產(chǎn)性能下降，引發(fā)多組織腫瘤甚至死亡，嚴(yán)重影響禽群生產(chǎn)能力，是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要傳染病[3]。禽白血病還可間接導(dǎo)致其他疫苗免疫失敗，對(duì)肉雞、蛋雞和種雞生產(chǎn)影響較大[4]。目前，對(duì)于禽白血病尚無有效的疫苗和防治藥物。世界上一些養(yǎng)禽大國控制該病的主要策略是，對(duì)禽群實(shí)施禽白血病病原監(jiān)測(cè)，凈化種禽，通過逐步凈化達(dá)到純化種禽群目的[5]。

禽白血病病毒蛋白組分主要由gag基因編碼的核心蛋白、pol基因編碼的各種酶以及env基因編碼的糖蛋白組成。其中g(shù)ag基因主要編碼非糖基化結(jié)構(gòu)蛋白。這些非糖基化結(jié)構(gòu)蛋白由基質(zhì)蛋白、蛋白酶、衣殼和核衣殼4 種成分組成，分別稱作p19、p15、p27 和p12 蛋白。p27 是病毒的衣殼蛋白，在蛋白總含量中占比高達(dá)30%，具有很多適合檢測(cè)的抗原表位，因此很多方法都以檢測(cè)p27 抗原來判定是否有禽白血病病毒感染[6]。目前國外用于檢測(cè)禽白血病病毒p27 抗原的試劑盒，主要為美國IDEXX 公司生產(chǎn)的p27 抗原ELISA 檢測(cè)試劑盒。國內(nèi)應(yīng)用較多的主要是揚(yáng)州大學(xué)、中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、北京世紀(jì)元亨公司聯(lián)合研發(fā)的禽白血病雙抗體夾心法p27 抗原ELISA 檢測(cè)試劑盒、禽白血病雙抗體夾心法p27 抗原膠體金檢測(cè)試紙條。此外，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研制的禽白血病病毒p27 抗原檢測(cè)試劑盒正在推廣應(yīng)用中[6-7]。

本研究利用已制備的2 株p27 蛋白單克隆抗體，建立雙抗體夾心檢測(cè)抗原的方法，以檢測(cè)樣品中禽白血病病毒。將p27 蛋白單克隆抗體包被于熒光層析試紙條，與樣品中的待檢抗原和另外一種經(jīng)鑭系元素?zé)晒馕⑶驑?biāo)記的p27 蛋白單克隆抗體，形成“固相單克隆抗體-抗原-熒光微球標(biāo)記的單克隆抗體”免疫復(fù)合物。通過洗滌，除去未結(jié)合微球標(biāo)記的單克隆抗體，然后讀取熒光微球發(fā)光值，計(jì)算p27 抗原的計(jì)量值，從而定量檢測(cè)家禽樣本中禽白血病抗原含量，以此判定陰陽性結(jié)果。本試驗(yàn)由檢測(cè)結(jié)果定量讀取被檢動(dòng)物體內(nèi)禽白血病病毒抗原含量，具有較高的實(shí)用和基層推廣價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

BSA 與脫脂奶粉，購自美國Oxoid 公司；比對(duì)用禽白血病病毒抗原ELISA 檢測(cè)試劑盒，購自美國IDEXX 公司（貨號(hào)HR786，批號(hào)99-09254）；禽白血病病毒p27 融合蛋白，由中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸醫(yī)診斷中心）制備保存；鑭系熒光微球、高敏熒光定量檢測(cè)系統(tǒng)，均由洛陽現(xiàn)代生物技術(shù)研究院有限公司研發(fā)制備；禽白血病陰陽性臨床樣本、禽白血病病毒相關(guān)單克隆抗體、大腸桿菌菌體裂解液、H7N9 亞型流感病毒、H5 亞型禽流感病毒、新城疫CS2 病毒等交叉試驗(yàn)樣品及禽白血病病毒p27、p12、p15、gp85重組表達(dá)蛋白，均由中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸醫(yī)診斷中心）保存[8]；胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)基以及其他相關(guān)細(xì)胞培養(yǎng)試劑，購自美國Gibco 公司；健康BALB/c 小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；高效連續(xù)點(diǎn)膜機(jī)，購自杭州峰航科技有限公司；便攜式熒光免疫分析儀，購自洛陽現(xiàn)代生物技術(shù)有限公司。

1.2 p27 蛋白單克隆抗體細(xì)胞株的復(fù)蘇與鑒定

1.2.1 雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)繁 參照本課題組已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)[9]，從液氮中取出雜交瘤細(xì)胞株2E5 和3D5，置于37 ℃水浴鍋中迅速解凍；用含有20%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液平鋪于細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37 ℃、含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～72 h，進(jìn)行分裂繁殖；穩(wěn)定后待其長成細(xì)胞單層，取生長良好的單層細(xì)胞，胰酶消化后用適量含20%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液吹懸細(xì)胞，按照體積比1:3 接種到新細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充細(xì)胞培養(yǎng)液至20 mL/瓶，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)36～72 h。

1.2.2 腹水制備 將擴(kuò)大培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞以1 000 r/min 離心5 min，棄掉細(xì)胞培養(yǎng)上清；用RPMI-1640 培養(yǎng)基重懸，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，隨后將細(xì)胞濃度稀釋至15×106個(gè)/mL；取健康BALB/c 小鼠，將培養(yǎng)好的雜交瘤細(xì)胞注射至小鼠腹腔內(nèi)，注射量為100 μL/只；觀察10～15 d，待小鼠腹部明顯腫大后，采集腹水。

1.2.3 腹水純化 采用飽和硫酸銨沉淀方法對(duì)腹水進(jìn)行純化，將純化后的p27 單克隆抗體無菌定量分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 Western Blot 檢測(cè)純化后單克隆抗體與p27蛋白反應(yīng)特異性 對(duì)禽白血病病毒p27、p12、p15、gp85 融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，檢測(cè)蛋白純度，通過BCA 蛋白濃度測(cè)定法定量濃度；將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，然后經(jīng)5%脫脂牛奶封閉2 h，PBST 洗滌3 次，每次5 min；采用純化后的2 株p27 單克隆抗體（稀釋比例1:3 000）作為一抗孵育過夜，PBST 洗滌3 次，每次5 min；以HRP 標(biāo)記的兔抗小鼠抗體作為二抗（稀釋比例1:4 000）孵育1 h，PBST 洗滌3 次，每次5 min；利用HRPDAB 底物顯色試劑盒顯色，室溫（15～25 ℃）作用5 min，以清水終止。

1.3 樣本采集及處理

1.3.1 蛋清樣品 取禽蛋破碎后的蛋清，于 -20 ℃與室溫之間反復(fù)凍融，吸取蛋清進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2 泄殖腔拭子樣品 用棉簽取待檢雞只泄殖腔樣本，置于1～2 mL 樣品稀釋液中。反復(fù)凍融后，恢復(fù)室溫振蕩混勻，12 000 r/min 離心，取上清液以待檢測(cè)。

1.3.3 胎糞樣品 用棉簽取待測(cè)胎糞樣本，置于1～2 mL 樣品稀釋液中，反復(fù)凍融后，恢復(fù)至室溫振蕩混勻，12 000 r/min 離心，取上清液以待檢測(cè)。

1.4 熒光微球試紙條制備

1.4.1 熒光微球標(biāo)記禽白血病病毒p27 蛋白單克隆抗體（1）洗滌：按需量取固體含量為1%的熒光微球分散液，加入5 倍體積的硼酸鹽緩沖液（BBS，0.05 moL/L，pH8.0），以12 000 r/min 離心15 min，棄上清，重復(fù)清洗2 次；將洗滌后的熒光微球重懸于5 倍體積的BBS。（2）熒光微球活化：取50 μL 熒光微球加至1 mL 2-（N-嗎啡啉）乙磺酸緩沖液（MES）中，混勻，12 000 r/min 離心15 min；棄上清，加入1 mL MES 緩沖液，混勻離心；重復(fù)上述步驟3 次，并用1 mL MES 緩沖液復(fù)溶；向上述溶液中加入250 μL 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺緩沖液（EDC），混勻，室溫反應(yīng)30 min；棄上清，加入4 mL 標(biāo)記緩沖液，混勻。（3）熒光微球標(biāo)記：將p27 蛋白單克隆抗體2E5 加至已活化的熒光微球中，使其終質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL，混勻；將混勻后含單克隆抗體2E5 的熒光微球溶液，置于室溫條件下避光反應(yīng)1.5 h；按溶液總體積3%加入封閉液（9%酪蛋白），置于室溫條件下避光反應(yīng)30 min；離心棄上清，用BBS 清洗2 次，并重懸已標(biāo)記的熒光微球；以1%的體積量加入胭脂紅色素，混勻，置于2～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 熒光微球墊制備 從冰箱中取出熒光微球標(biāo)記p27 蛋白單克隆抗體2E5 恢復(fù)至室溫；取出玻璃纖維素膜并用輔料切條機(jī)裁切成10 cm×30 cm規(guī)格；設(shè)置噴涂量為3 μL/cm，每張玻璃纖維素膜（10 cm×30 cm）以1.0 cm 間隔噴涂8 條；將完成噴涂的玻璃纖維素膜放置于干凈紗窗網(wǎng)，（37±2）℃干燥2～3 h，逐一垂直放入輔料斬切機(jī)中切成0.7 cm×30 cm 的熒光微球墊，置于裝有干燥劑的密封袋中室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 印膜制備（1）質(zhì)控線（C 線）印膜溶液：用磷酸鹽緩沖液（PB，0.05 mmoL/L，pH8.0）將禽白血病病毒p27 蛋白抗原稀釋至0.40 mg/mL，即為C 線印膜溶液；將其置于棕色玻璃瓶中，2～8 ℃保存?zhèn)溆?。?）檢測(cè)線（T 線）印膜溶液：用PB（0.05 mmoL/L，pH8.0）將p27 蛋白單克隆抗體3D5 稀釋至0.45 mg/mL，即為T 線印膜溶液；置于棕色玻璃瓶中，2～8℃保存?zhèn)溆谩＃?）印膜：將印膜溶液分別吸至高效連續(xù)點(diǎn)膜機(jī)的C 線管線和T線管線中；按0.8 μL/cm 在硝酸纖維素膜（NC 膜）上均勻劃出C 線和T 線，其中C 線距NC 膜頂端（0.8±0.1）cm 處，T 線距膜頂端（1.3±0.1）cm 處，C 線與T 線相距（0.5±0.1）cm；在膜的開始端、末端及不均勻處作標(biāo)記。（4）印膜干燥：將劃線的NC 膜逐一放置在干凈紗窗網(wǎng)上，忌重疊，置于干燥間干燥，（37±2）℃干燥2 h；放入裝有干燥劑的鋁箔袋內(nèi)，封口、貼上標(biāo)簽，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 樣品墊制備 將玻璃纖維素膜用輔料斬切機(jī)裁切成2.0 cm×30 cm 規(guī)格，室溫密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5 檢測(cè)卡制備 在室溫及濕度≤30%RH 的潔凈環(huán)境下，按照以下步驟組裝半成品試紙。（1）貼條：依次按印膜、吸水墊、熒光微球墊、樣品墊的順序，將各中間制品粘貼于PVC 底板上，保證各中間品在相鄰處均有1 nm～2 mm 層疊，并使印膜上的T 線靠近樣品墊一側(cè)、C 線靠近吸水墊一側(cè)。（2）切條：將已組裝好的熒光微球大板修剪整齊后，用切條機(jī)裁切為（4.0±0.1）mm 的試紙。（3）裝卡：挑取印膜無劃痕、無污染、邊緣整齊的試紙，將試紙放入底卡中，蓋上卡蓋。

1.4.6 操作步驟（1）儀器準(zhǔn)備：打開便攜式熒光免疫分析儀，選擇待檢項(xiàng)目，結(jié)果如需打印，同時(shí)打開藍(lán)牙打印機(jī)，并與便攜式熒光免疫分析儀連接。（2）樣品稀釋：用微量毛細(xì)采樣管取10 μL樣本加至已備好的樣本稀釋液管中混勻，稀釋后的樣品需在1 h 內(nèi)完成檢測(cè)。（3）取檢測(cè)卡：將恢復(fù)至室溫的試紙卡從鋁箔包裝中取出，放于平整、潔凈的臺(tái)面上。（4）加樣及孵育：用配套吸管吸取已稀釋好的樣本，垂直而緩慢地滴加2～3 滴（約80 μL）至加樣孔，室溫放置10～15 min。（5）儀器檢測(cè)讀數(shù)：讀數(shù)前先將產(chǎn)品配套ID 卡插入便攜式熒光免疫分析儀，再將檢測(cè)卡加樣口朝里放入便攜式熒光免疫分析儀檢測(cè)，5 min 內(nèi)完成讀值。

1.4.7 試驗(yàn)成立標(biāo)準(zhǔn) 陰性：用標(biāo)準(zhǔn)陰性樣本檢測(cè)，T/C＜0.1 時(shí)，試驗(yàn)成立。陽性：用禽白血病病毒p27 蛋白抗原檢測(cè)，T/C≥0.1 時(shí)，試驗(yàn)成立。

1.4.8 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 當(dāng)T/C＜0.1 時(shí)，判為禽白血病病毒抗原陰性；當(dāng)T/C≥0.1 時(shí)，判為禽白血病病毒抗原陽性。

1.5 質(zhì)控樣品檢驗(yàn)

采用高敏熒光微球快速檢測(cè)方法以及IDEXX試劑盒，分別對(duì)30 份質(zhì)控樣品（10 份禽白血病病毒強(qiáng)陽性樣品、10 份弱陽性樣品、10 份陰性樣品）開展3 次重復(fù)檢測(cè)，比較2 種檢測(cè)方法對(duì)陰性樣品的檢出率。

1.6 交叉試驗(yàn)

對(duì)于經(jīng)鑒定均為禽白血病病毒陰性的大腸桿菌菌體裂解液、H7N9 亞型流感病毒、H5 亞型禽流感病毒、新城疫CS2 病毒等4 份樣品，采用建立的高敏熒光微球快速檢測(cè)方法重復(fù)檢測(cè)3 次，同時(shí)用IDEXX 試劑盒開展平行檢測(cè)。

1.7 最低檢出量試驗(yàn)

將禽白血病病毒在DF-1 細(xì)胞傳代擴(kuò)繁，收獲細(xì)胞上清培養(yǎng)液作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品。采用Reed-Muench 方法測(cè)算毒株在DF-1 細(xì)胞的TCID50并進(jìn)行定量。將陽性標(biāo)準(zhǔn)品用稀釋液分別按1.000×103、2.000×103、4.000×103、8.000×103、1.600×104、3.200×104、6.400×104、1.280×105、2.560×105、5.120×105、1.024×106、2.048×106、4.096×106和8.192×106作梯度稀釋，制備敏感性檢驗(yàn)樣品，采用建立的高敏熒光微球快速檢測(cè)方法和IDEXX 試劑盒開展檢測(cè)，測(cè)定最低檢出量。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

采用建立的高敏熒光微球快速檢測(cè)方法，對(duì)12 份經(jīng)鑒定的陽性樣品在同批次板和不同批次板上分別進(jìn)行檢測(cè)，平行測(cè)定5 次，計(jì)算批內(nèi)、批間變異系數(shù)（CV）。

1.9 符合性試驗(yàn)

采用建立的高敏熒光微球快速檢測(cè)方法與IDEXX 禽白血病抗原ELISA 檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)送檢的240 份樣品（其中陽性樣本120 份、陰性樣本120 份），計(jì)算符合率。

2 結(jié)果

2.1 p27 蛋白單克隆抗體復(fù)蘇鑒定及特異性反應(yīng)檢測(cè)

p27 蛋 白 單 克 隆 抗 體2E5 和3D5 的SDSPAGE 電泳結(jié)果（圖1）顯示，成功復(fù)蘇禽白血病病毒p27 蛋白單克隆抗體，抗體重鏈與輕鏈大小分別為55、27 ku。經(jīng)蛋白灰度分析軟件分析，純化后的單克隆抗體純度在90%以上，滿足后續(xù)試驗(yàn)需求。使用Western Blot 檢測(cè)單克隆抗體與p27、p12、p15、gp85 等蛋白的反應(yīng)特異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)純化后的單克隆抗體只與p27 蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，與其他蛋白無交叉反應(yīng)（圖2）。

2.2 高敏熒光快速定量檢測(cè)方法建立與優(yōu)化

高敏熒光快速定量檢測(cè)方法建立后，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，當(dāng)3D5 單抗包被質(zhì)量濃度為0.45 mg/mL，鑭系熒光微球標(biāo)記2E5 單抗質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL，樣本稀釋比例為1:80 時(shí)，禽白血病病毒陽性與陰性樣本的P/N值最大。同時(shí)，取稀釋后的樣本80 μL 加入試劑卡加樣孔內(nèi)，避免強(qiáng)光照射層析15 min，然后將檢測(cè)卡放入熒光儀檢測(cè)，讀取試劑盒效價(jià)值為最佳。

圖1 禽白血病病毒p27 蛋白單克隆抗體復(fù)蘇與鑒定結(jié)果

圖2 p27 蛋白單克隆抗體反應(yīng)特異性驗(yàn)證結(jié)果

2.3 陰陽性臨界值確定

采用建立的高敏熒光快速定量檢測(cè)方法對(duì)120份陰性樣本進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定T/C值。120 份陰性樣本T/C值X為0.095，3SD 為0.05，因此陰陽性臨界T/C值X+3SD 為0.1。將此臨界T/C值（0.1）對(duì)應(yīng)為檢測(cè)臨界值，即當(dāng)試劑盒檢測(cè)值≥0.1 時(shí)，判定樣品為陽性；檢測(cè)值＜0.1 時(shí)，判定樣品為陰性。

2.4 質(zhì)控樣品檢測(cè)試驗(yàn)

采用建立的高敏熒光微球快速檢測(cè)方法和IDEXX 試劑盒，分別對(duì)30 份質(zhì)控樣品開展3 次重復(fù)檢測(cè)，比較2 種檢測(cè)方法對(duì)陰性樣品的檢出率。結(jié)果顯示，高敏熒光微球快速檢測(cè)方法以及IDEXX 試劑盒對(duì)質(zhì)控陰性樣品的檢出率均為100%。

2.5 交叉試驗(yàn)

對(duì)鑒定為禽白血病病毒p27 蛋白陰性的大腸桿菌菌體裂解液等4 份樣品，采用高敏熒光微球快速檢測(cè)方法開展3 次重復(fù)檢測(cè)，同時(shí)以IDEXX 試劑盒進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，比較2 種檢測(cè)方法的交叉反應(yīng)。結(jié)果（表1）顯示，檢測(cè)結(jié)果全部為陰性，無交叉反應(yīng)。

表1 高敏熒光微球快速檢測(cè)方法交叉試驗(yàn)結(jié)果

2.6 最低檢出量

將陽性標(biāo)準(zhǔn)品用稀釋液分別按照1.000×103、2.000×103等14 個(gè)梯度稀釋倍數(shù)進(jìn)行稀釋，制備敏感性檢驗(yàn)樣品，然后采用高敏熒光微球快速檢測(cè)方法和IDEXX 試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果（表2）顯示，高敏熒光微球快速檢測(cè)方法最低檢出量為1:（5.120×105），且T/C值在批間、批內(nèi)變化相對(duì)穩(wěn)定，較IDEXX 試劑盒最低檢出量[1:（2.560×105）]高，說明該檢測(cè)方法的敏感度高。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

采用建立的高敏熒光微球快速檢測(cè)方法，對(duì)10 份樣品在同批次板和不同批次板上分別進(jìn)行檢測(cè)，平行測(cè)定5 次，計(jì)算批內(nèi)、批間發(fā)光值的變異系數(shù)（CV）。結(jié)果（表3）顯示，本試驗(yàn)建立的高敏熒光微球快速檢測(cè)方法批內(nèi)發(fā)光值重復(fù)系數(shù)均小于10%，批間發(fā)光值重復(fù)系數(shù)均小于15%，說明該方法具有良好的重復(fù)性。

表2 高敏熒光微球快速檢測(cè)方法最低檢出量試驗(yàn)結(jié)果

表3 高敏熒光微球快速檢測(cè)方法的發(fā)光值重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.8 符合性試驗(yàn)

使用建立的禽白血病抗體高敏熒光微球快速檢測(cè)方法與IDEXX 檢測(cè)試劑盒，對(duì)抽取的240 份樣品（陰、陽性樣品各120 份）進(jìn)行檢測(cè)比對(duì)。結(jié)果（表4）顯示，兩種方法的總符合率為93.98%，陽性符合率為90.83%，陰性符合率為95.83%。

表4 符合率統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3 討論

自20 世紀(jì)70 年代以來，歐洲國家相繼報(bào)道使用ELISA 方法檢測(cè)禽白血病[10-11]。1985 年，美國報(bào)道禽白血病病毒ELISA 抗原檢測(cè)試劑盒研發(fā)成功，并得到推廣應(yīng)用[12]。與此同時(shí)，我國也開始對(duì)禽白血病病原診斷技術(shù)進(jìn)行研究。目前，國內(nèi)外對(duì)禽白血病病毒檢測(cè)技術(shù)研發(fā)主要集中于ELISA抗原檢測(cè)。我國現(xiàn)有禽白血病抗原檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)為國標(biāo)《禽白血病診斷技術(shù)》（GB/T 26436—2010），主要涉及病原的分離鑒定、病毒核酸的分子生物學(xué)檢測(cè)以及病毒抗原ELISA 檢測(cè)方法等[7，12]?；鶎訉?shí)際臨床診斷中，常根據(jù)血液學(xué)檢查和病理學(xué)特征以及結(jié)合病原和抗體檢查來確診該病。成紅細(xì)胞性白血病在外周血液、肝及骨髓涂片，可見大量的成紅細(xì)胞，肝和骨髓呈櫻桃紅色。成髓細(xì)胞性白血病在血管內(nèi)外均有成髓細(xì)胞積聚，肝呈淡紅色，骨髓呈白色。ELISA 檢測(cè)方法的穩(wěn)定性與特異性具有一定局限性。病原分離和抗體檢測(cè)是目前建立無白血病雞群的重要手段。近年來，開發(fā)靈敏度更高、檢測(cè)操作更簡(jiǎn)單的新型禽白血病抗原診斷技術(shù)成為研究熱點(diǎn)。高敏快速熒光定量檢測(cè)方法是近幾年發(fā)展成熟的一種高敏感性和特異性的新檢測(cè)方法。該方法利用鑭系熒光微球作為包被介質(zhì)，充分利用鑭系元素激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、Stokes 位移大等特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)快速、敏感檢測(cè)。1979 年，芬蘭Wallac公司研發(fā)部的Soini 和 Hemmila 首次提出建立稀土離子標(biāo)記物的“時(shí)間分辨熒光免疫分析”理論，為高敏快速熒光定量檢測(cè)方法奠定了理論基礎(chǔ)[13-14]。1984 年，Hemmila 確 定 了DELFIA（dissociation enhanced lanthanide fluoroimmunoassay）時(shí) 間 分辨免疫分析技術(shù)方案，從而使DELFIA 成為芬蘭Wallac 公司的專利技術(shù)[15-16]。2003 年，時(shí)間分辨熒光分析技術(shù)獲我國國家科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)。2014年萬孚生物研制心肌肌鈣蛋白I（cTnI）熒光微球試劑，在人醫(yī)領(lǐng)域獲得注冊(cè)證書[粵食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2014 第2400511 號(hào)][16]。

高敏快速熒光定量檢測(cè)方法相比較于ELISA檢測(cè)方法更敏感、特異，檢測(cè)本底值更低、信噪比更高、操作更簡(jiǎn)便，適用于大量樣品快速檢測(cè)，更適合基層應(yīng)用。與膠體金試紙條檢測(cè)方法相比，同樣作為適用于基層使用的快速診斷檢測(cè)技術(shù)，2 種方法具有相似之處，都需要層析試紙作為檢測(cè)媒介，但是高敏快速熒光定量檢測(cè)方法具有檢測(cè)靈敏度更高、儀器判讀結(jié)果更準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)。具體來說，在標(biāo)記物方面，膠體金試紙條檢測(cè)方法的標(biāo)記物為膠體金，高敏快速熒光定量檢測(cè)方法的標(biāo)記物為熒光微球；在檢測(cè)方法方面，膠體金試紙條使用目測(cè)方法判讀結(jié)果，高敏快速熒光定量檢測(cè)方法使用便攜式熒光檢測(cè)儀判讀檢測(cè)結(jié)果；在結(jié)果的準(zhǔn)確性方面，高敏快速熒光定量檢測(cè)方法使用儀器判讀降低肉眼判讀誤差，且操作無需專業(yè)人員，結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確，檢測(cè)時(shí)間短。因此，高敏快速熒光定量檢測(cè)方法相比較于膠體金試紙條檢測(cè)方法具有很多明顯的實(shí)驗(yàn)室與基層使用優(yōu)勢(shì)。利用鑭系熒光微球開發(fā)準(zhǔn)確、敏感、簡(jiǎn)易、快速的禽白血病新型診斷技術(shù)，可更好地滿足禽白血病防控需求[9-11]。本試驗(yàn)建立的檢測(cè)方法可使禽白血病病毒抗原檢測(cè)更快速，結(jié)果更量化、準(zhǔn)確，從而提高該病檢驗(yàn)檢疫水平，加大防疫力度，具有重要的經(jīng)濟(jì)與政治意義。

本檢測(cè)試紙采用時(shí)間分辨熒光免疫層析試驗(yàn)原理制成，樣本加入到加樣孔后與熒光微球標(biāo)記物一起沿層析膜移動(dòng)，若樣本中存在禽白血病病毒抗原，則與熒光微球標(biāo)記物及檢測(cè)線上的抗體結(jié)合而產(chǎn)生熒光信號(hào)；若樣本中不存在抗原，則不產(chǎn)生熒光信號(hào)。本研究使用禽白血病病毒p27 蛋白單克隆抗體，建立了雙抗體夾心檢測(cè)抗原的高敏熒光微球快速檢測(cè)方法。本方法敏感性高、特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單、快速，適用于基層各級(jí)獸醫(yī)部門和出入境檢驗(yàn)檢疫局對(duì)禽白血病病毒抗原的快速定量檢測(cè)，為禽白血病防控和凈化提供了重要技術(shù)手段。