無(wú)乳鏈球菌對(duì)奶牛乳腺成纖維細(xì)胞金屬蛋白酶及uPA 系統(tǒng)表達(dá)的影響

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

奶牛乳腺炎是奶牛被多種病原微生物（細(xì)菌、支原體等）感染而引起的一種奶牛乳腺發(fā)生的炎癥，屬于奶牛常見(jiàn)疾病。組織器官的纖維化過(guò)程主要與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的沉積、分解和相關(guān)細(xì)胞凋亡等有關(guān)，奶牛乳腺成纖維細(xì)胞（bovine mammary fibroblasts，BMFBs）是乳腺纖維化的主要參與細(xì)胞，在奶牛乳腺發(fā)生纖維化時(shí)可以產(chǎn)生ECM[1]。ECM 的合成和降解平衡失調(diào)，與基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子（tissuse inhibitors of matrix metalloproteinases，TIMPs）和纖溶酶原（plasminogen，Plg）激活系統(tǒng)的蛋白酶活性有關(guān)[2-3]。MMPs 系統(tǒng)是調(diào)控ECM 代謝的主要酶系，能使纖維膠原蛋白和ECM 的某些成分變性和降解，其中MMP-2 和MMP-9 同屬于MMPs家族中的明膠酶類(lèi)，結(jié)構(gòu)相似，可降解IV 型膠原蛋白等ECM 組分；兩者的催化活性主要受基因表達(dá)、酶原活化和活化后調(diào)節(jié)3 個(gè)方面的調(diào)控[4]。MMPs 能使卵泡形態(tài)發(fā)生改變，對(duì)哺乳動(dòng)物卵泡發(fā)育發(fā)揮著重要作用[5]。纖溶酶原激活物（plasminogen activator，PA）是一種絲氨酸蛋白酶，是纖溶酶形成的啟動(dòng)物，纖溶酶可激活MMPs 從而降解ECM[6]。PA 包括組織型纖溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，tPA）和尿激酶型纖溶酶原 激 活 物（urokinase type plasminogen activator，uPA）。纖溶酶原激活物抑制因子（plasminogen activator inhibitors，PAIs）包括PAI-1 和PAI-2，其中PAI-1 是大小為50 kDa 的蛋白，其活性中心與PA 活性中心不可逆共價(jià)結(jié)合后，可以使PA 失去活性[7]。PAI-1 通過(guò)調(diào)節(jié)ECM 的降解和沉積、刺激細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞的粘附作用等過(guò)程參與許多疾病的發(fā)展，如對(duì)組織纖維化、腫瘤和心血管疾病等的發(fā)生發(fā)展都有作用[8]。

無(wú)乳鏈球菌（S.agalactiae）是引起奶牛乳腺炎的主要病原菌之一。有研究報(bào)道，臨床型乳腺炎中鏈球菌的檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他致病菌[9]。引起奶牛乳腺炎的鏈球菌中無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌（S.dysgalactiae）和乳房鏈球菌（S.uberis）分離率較高[10]，由鏈球菌引起的奶牛乳腺炎傳播速度快、傳染性強(qiáng)、傳播范圍廣。無(wú)乳鏈球菌也稱為B組鏈球菌，是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。其屬于高接觸性傳染菌，主要通過(guò)養(yǎng)殖人員、蚊蠅和養(yǎng)殖場(chǎng)取乳設(shè)備等接觸傳播擴(kuò)散[11]。奶牛發(fā)生乳腺炎時(shí)，乳腺組織會(huì)呈現(xiàn)不同程度的紅腫、脹痛；局部乳區(qū)會(huì)出現(xiàn)發(fā)熱癥狀，還會(huì)伴隨精神沉郁、煩躁、拒絕進(jìn)食等異常情況；乳汁混濁甚至含有條狀物或顆粒樣混濁，泌乳減少甚至停止[12]。無(wú)乳鏈球菌為人獸共患病病原菌，尤其喜好感染孕婦、新生兒等免疫功能不全者，可引起產(chǎn)婦產(chǎn)后感染、菌血癥、心內(nèi)膜炎等疾病，死亡率較高[13-14]；其還可引起尼羅羅非魚(yú)器官障礙衰竭，最終導(dǎo)致魚(yú)死亡[15]。

目前，關(guān)于肝臟和腎臟等組織纖維化的研究較多，鮮見(jiàn)關(guān)于無(wú)乳鏈球菌對(duì)奶牛BMFBs MMPs/TIMPs 與uPA 系統(tǒng)表達(dá)作用的研究報(bào)道。本研究主要用熱滅活的無(wú)乳鏈球菌菌液作用于體外培養(yǎng)的BMFBs，通過(guò)研究其對(duì)MMPs/TIMPs 和uPA 系統(tǒng)表達(dá)的影響，從而進(jìn)一步闡明奶牛乳腺纖維化的病理過(guò)程和發(fā)病機(jī)理，不僅為明確ECM 代謝分子機(jī)制提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)，也為全面理解MMPs/TIMPs 及uPA 系統(tǒng)對(duì)奶牛乳腺纖維化預(yù)防和治療的新方法以及新藥物的研究與開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種及細(xì)胞

S.agalactiae菌種由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存，BMFBs 由本實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆肹16]。

1.2 主要試劑

Multisource Total RNA Miniprep Kit，購(gòu)自AXYGEN 公司；全蛋白提取試劑盒，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR 試劑盒，購(gòu)自TaKaRa 公司；DMEM/F12 培養(yǎng)基，購(gòu)自Gibco 公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；鼠抗β-actin 單克隆抗體（KM9001），購(gòu)自天津三箭生物技術(shù)股份有限公司；兔抗MMP-2 多克隆抗體、兔抗MMP-9 多克隆抗體、兔抗uPA 多克隆抗體、兔抗PAI-1 多克隆抗體、兔抗TIMP-1 多克隆抗體、兔抗TIMP-2 多克隆抗體，購(gòu)自Proteintech 公司；山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗鼠IgG-HRP 二抗，購(gòu)自天津三箭生物技術(shù)股份有限公司；SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；ECL 顯色液、蛋白預(yù)染Maker，購(gòu)自Thermo 公司；MMP-2 和MMP-9 明膠酶譜法檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自上海信帆生物科技有限公司。

1.3 熱滅活菌液配置

取凍存的S.agalactiae置于5 mL 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫?fù)u床低速培養(yǎng)10～18 h；菌液混濁后在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上劃線繼續(xù)培養(yǎng)，待長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)菌落后，挑取單個(gè)菌落擴(kuò)增培養(yǎng)；在培養(yǎng)基上挑取4～5 個(gè)長(zhǎng)勢(shì)好的單菌落移至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中（重復(fù)1 次），37 ℃恒溫?fù)u床低速培養(yǎng)15～18 h，倍比稀釋進(jìn)行涂板計(jì)數(shù)；根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究摸索情況，選取適宜濃度，將菌液制成107cfu/mL，并于75 ℃水浴鍋中熱滅活30～40 min 備用。

1.4 BMFBs 的復(fù)蘇及培養(yǎng)

預(yù)先將5 mL 青霉素-鏈霉素溶液（青霉素100 U/mL、鏈霉素0.1 mg/mL）加入555 mL 含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12 培養(yǎng)基中，配置完全培養(yǎng)基。將凍存的BMFBs 從液氮中取出，37 ℃溫浴1 min，轉(zhuǎn)移細(xì)胞及3～5 mL 完全培養(yǎng)基至15 mL 離心管中，1 000 r/min 離心6 min；棄去培養(yǎng)基，加入3～5 mL 新的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至25 cm3細(xì)胞瓶，置于37 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液并觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況；待細(xì)胞鋪滿細(xì)胞瓶后按1:3 進(jìn)行傳代，傳至第7 代細(xì)胞形態(tài)輪廓清晰，單層長(zhǎng)滿后加入無(wú)血清培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞饑餓處理24 h；處理組加入1 mL 107cfu/mL滅活的S.agalactiae菌液，對(duì)照組加入1 mL 無(wú)血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，分別作用6、12、24、48 h，收集細(xì)胞上清液檢測(cè)MMP-2、MMP-9 活性，提取總RNA 和總蛋白。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè) 選用β-actin為內(nèi)參基因，qPCR 反應(yīng)體系參考TB? Premix ExTaq?II 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，并于QuantStudioTM7 Flex Real-Time PCR System 儀器進(jìn)行反應(yīng)。設(shè)計(jì)β-actin、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2、uPA、PAI-1基因引物序列（表1），送至生工生物工程（上海）有限公司合成。根據(jù)RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取處理組和對(duì)照組細(xì)胞總RNA，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)量各組RNA 濃度和純度，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)制備cDNA，保存于-20 ℃?zhèn)溆?。以?actin作為內(nèi)參基因，利用RT-qPCR 試劑盒檢測(cè)MMP-2、MMP-9、uPA、PAI-1、TIMP-1、TIMP-2mRNA 轉(zhuǎn)錄水平，設(shè)置3 次重復(fù)試驗(yàn)。

1.5.2 Western Blot 檢測(cè) 利用全蛋白提取試劑盒提取BMFBs 總蛋白，采用BCA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。蛋白經(jīng)金屬浴100 ℃ 5 min 變性后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩７謩e以鼠抗β-actin 單克隆抗體（1:10 000 稀釋）、兔抗MMP-2 多克隆抗體（1:500稀釋）、兔抗MMP-9 多克隆抗體（1:500 稀釋）、兔抗uPA 多克隆抗體（1:500 稀釋）、兔抗PAI-1多克隆抗體（1:500 稀釋）、兔抗TIMP-1 多克隆抗體（1:300稀釋）、兔抗TIMP-2多克隆抗體（1:300）為一抗，以山羊抗小鼠IgG-HRP（1:4 000）、山羊抗兔IgG-HRP（1:3 000）為二抗，采用Western Blot 檢 測(cè)MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2、uPA、PAI-1 蛋白表達(dá)情況，設(shè)置3 次重復(fù)試驗(yàn)。

表1 qPCR 引物序列

1.5.3 明膠酶譜活性檢測(cè) 參考MMP-2、MMP-9酶譜檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)，制備含MMP 底物蛋白的SDS-PAGE 凝膠；S.agalactiae滅活菌液處理不同時(shí)間（6、12、24、48 h）后，收集處理組和對(duì)照組細(xì)胞上清液，與2×SDS-PAGE nonreducing buffer 按照體積比1:1 混合，上樣，在110 V 電壓下進(jìn)行凝膠電泳；分別用明膠酶譜檢測(cè)試劑盒1×Buffer A、1×Buffer B 敷育凝膠，然后CCB 染色液染色并脫色；將凝膠放在掃描儀上掃描，透亮區(qū)域即為MMP-2、MMP-9 的酶譜及活性位置。

1.6 數(shù)據(jù)分析 RT-qPCR 結(jié)果的數(shù)據(jù)處理采用2-ΔCT法，Western Blot 條帶和明膠酶譜條帶用ImageJ 軟件進(jìn)行灰度值分析，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值表示蛋白相對(duì)定量的結(jié)果。然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組內(nèi)差異采用雙因素方差分析，以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05：與對(duì)照組相比差異不顯著；P＜0.05，與對(duì)照組相比差異較顯著；P＜0.01，與對(duì)照組相比差異顯著；P＜0.001，與對(duì)照組相比差異極顯著），以GraPhPad Prism5 軟件制作柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1MMP-2、MMP-9mRNA 轉(zhuǎn)錄、相應(yīng)蛋白表達(dá)水平及明膠酶譜分析

2.1.1MMP-2、MMP-9mRNA 轉(zhuǎn)錄水平 作用6、12、24、48 h 后，與對(duì)照組相比，處理組MMP-2mRNA 轉(zhuǎn)錄水平除在6 h 時(shí)差異不顯著（P＞0.05）外，其他各時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)錄水平均升高，其中作用后12、24 h 顯著升高（P＜0.01），48 h 表達(dá)水平稍回落，差異較顯著（P＜0.05）（圖1-A）；MMP-9mRNA 轉(zhuǎn)錄水平呈降低—升高—降低—升高變化趨勢(shì)，在作用后12、48 h 差異不顯著（P＞0.05）（圖1-B）。結(jié)果表明，熱滅活S.agalactiae處理BMFBs 后，MMP-2mRNA 轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組相比總體呈上升趨勢(shì)，MMP-9mRNA 轉(zhuǎn)錄水平呈下降趨勢(shì)。

2.1.2 MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)情況 與對(duì)照組相比，MMP-2 蛋白除在作用6 h 時(shí)表達(dá)差異不顯著（P＞0.05）外，在12 h 和48 h 時(shí)表達(dá)極顯著升高（P＜0.001），而在作用24 h 時(shí)顯著下降（P＜0.01）（圖2-A）；MMP-9 蛋白在作用6 h 時(shí)表達(dá)較顯著升高（P＜0.05），在作用12 h 時(shí)極顯著下降（P＜0.001），在其余時(shí)間點(diǎn)差異不顯著（圖2-B）。結(jié)果表明，熱滅活S.agalactiae處理BMFBs 后，MMP-2 蛋白水平與對(duì)照組相比主要呈升高-降低-升高趨勢(shì)，MMP-9蛋白表達(dá)水平呈先升高后下降趨勢(shì)。

圖1 MMP-2、MMP-9 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平分析結(jié)果

圖2 MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)分析結(jié)果

2.1.3 MMP-2、MMP-9 蛋白明膠酶譜分析作用6、12、24、48 h 后，利用明膠酶譜法檢測(cè)MMP-2 和MMP-9 蛋白活性。結(jié)果顯示，可在72 kDa 位置處發(fā)現(xiàn)清晰、活化的MMP-2 條帶，在92 kDa 位置處發(fā)現(xiàn)亮度微弱的活化MMP-9 條帶（圖3-A）。圖中未出現(xiàn)130、225 kDa 的proMMP-2/MMP-9（MMP-2/MMP-9 蛋白前體）條帶，這可能是由不同分子量蛋白在SDS-PAGE 電泳時(shí)遷移效率不同所導(dǎo)致。與對(duì)照組相比，MMP-2 活性在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有差異，其中在作用6 h 和48 h 時(shí)差異極顯著（P＜0.001），12 h 和24 h 時(shí)差異顯著（P＜0.01，圖3-B）。MMP-9 活性主要呈升高-降低-升高趨勢(shì)，在作用12 h 時(shí)差異不顯著（P＞0.05），6、24、48 h 時(shí)差異極顯著（P＜0.001，圖3-C）。結(jié)果表明，熱滅活S.agalactiae處理BMFBs 后，MMP-2 的酶活性較MMP-9 明顯，二者均在作用6 h、48 h 時(shí)活性最強(qiáng)。

2.2TIMP-1、TIMP-2mRNA 轉(zhuǎn)錄水平和相關(guān)蛋白表達(dá)情況

圖3 MMP-2、MMP-9 蛋白明膠酶譜分析結(jié)果

2.2.1TIMP-1、TIMP-2mRNA 轉(zhuǎn)錄水平 處理6、12、24、48 h 后，與對(duì)照組相比，TIMP-1mRNA轉(zhuǎn)錄水平在中后期呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，在24 h 時(shí)表達(dá)極顯著升高（P＜0.001），在48 h 時(shí)表達(dá)顯著降低（P＜0.01），其余時(shí)間點(diǎn)表達(dá)不顯著（P＞0.05，圖4-A）；TIMP-2mRNA 轉(zhuǎn)錄水平則有著不同程度的降低。在處理后12 h 時(shí)顯著降低（P＜0.01），其余時(shí)間點(diǎn)均不顯著（P＞0.05，圖4-B）。結(jié)果表明，熱滅活S.agalactiae處理BMFBs 后，TIMP-1 mRNA 水平呈先上升后下降趨勢(shì)，TIMP-2 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平主要呈下降趨勢(shì)。

2.2.2 TIMP-1、TIMP-2 蛋白表達(dá)情況 TIMP-1蛋白除在作用24 h 時(shí)表達(dá)不顯著（P＞0.05）外，在其余時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均顯著，呈先降低后升高的變化趨勢(shì)，在6 h 時(shí)極顯著降低（P＜0.001），在12 h 時(shí)顯著降低（P＜0.01），在作用48 h 時(shí)表達(dá)極顯著升高（P＜0.001，圖5-A）。TIMP-2 蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比，在作用12 h 和24 h 時(shí)表達(dá)極顯著升高（P＜0.001），在作用其余時(shí)間點(diǎn)均不顯著（P＞0.05，圖5-B）。結(jié)果表明，熱滅活S.agalactiae作用BMFBs 后，TIMP-1 蛋白呈先下降后上升的趨勢(shì)，TIMP-2 蛋白主要呈上升趨勢(shì)，且在作用12 h 和24 h 時(shí)上升明顯。

圖4 TIMP-1、TIMP-2 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平分析結(jié)果

2.3uPA、PAI-1mRNA 轉(zhuǎn)錄水平和相應(yīng)蛋白表達(dá)情況

2.3.1uPA、PAI-1mRNA 轉(zhuǎn) 錄 水 平 作 用6、12、24、48 h 后，與對(duì)照組相比，uPAmRNA 轉(zhuǎn)錄水平總體呈降低趨勢(shì)，在作用12 h 時(shí)顯著降低（P＜0.01），在24 h 時(shí)極顯著降低（P＜0.001），其余時(shí)間點(diǎn)不顯著（P＞0.05，圖6-A）；PAI-1mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在作用后6 h 和48 h 時(shí)差異不顯著（P＞0.05），在12 h 時(shí)極顯著降低（P＜0.001），在24 h 時(shí)顯著降低（P＜0.01，圖6-B）。結(jié)果表明，熱滅活S.agalactiae作用BMFBs 后，uPA、PAI-1mRNA 轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組相比主要呈下降趨勢(shì)，且具有明顯時(shí)間依賴性。

圖5 TIMP-1、TIMP-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量分析結(jié)果

圖6 uPA、PAI-1 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平分析結(jié)果

2.3.2 uPA、PAI-1 蛋白表達(dá)情況 與對(duì)照組相比，uPA 蛋白除在6 h 時(shí)表達(dá)不顯著（P＞0.05）外，在其余時(shí)間點(diǎn)均有顯著差異，其中在12 h 和48 h時(shí)均極顯著降低（P＜0.001），在24 h 時(shí)極顯著升高（P＜0.001，圖7-A）；PAI-1 蛋白在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均有顯著差異，在作用6 h 和48 h 時(shí)極顯著降低（P＜0.001），在12 h 時(shí)顯著上升（P＜0.01），24 h 時(shí)表達(dá)極顯著上升（P＜0.001，圖7-B）。結(jié)果表明，uPA、PAI-1 蛋白水平與對(duì)照組相比均主要呈先降低后升高再降低的趨勢(shì)。

圖7 uPA、PAI-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量分析結(jié)果

3 討論

MMPs 系統(tǒng)以及uPA 系統(tǒng)是調(diào)控ECM 代謝的主要酶系。MMPs 是抗纖維化因子，可以降解ECM 以限制組織和器官纖維化的發(fā)生。MMPs 作為酶原從細(xì)胞中分泌，需要通過(guò)蛋白酶（如纖溶酶）進(jìn)行蛋白水解，纖溶酶原產(chǎn)生激活物主要發(fā)生在細(xì)胞表面。uPA 系統(tǒng)不僅參與纖溶蛋白降解，也可以促進(jìn)MMPs 活化。uPA 系統(tǒng)、纖溶酶和MMPs 構(gòu)成的級(jí)聯(lián)激活反應(yīng)是調(diào)節(jié)ECM 累積的關(guān)鍵途徑之一，uPA 位于這個(gè)級(jí)聯(lián)激活反應(yīng)的頂端，可以促進(jìn)MMPs 與纖溶酶一同降解ECM 等基膜成分，從而參與炎癥反應(yīng)，抑制纖維化進(jìn)程[17]。有研究[18]表明，在肝纖維化中，星狀細(xì)胞（HSC）活化并產(chǎn)生uPA和PAI-1，PAI-1 可與活化的uPA 結(jié)合，抑制其功能，加速ECM 沉積。在骨關(guān)節(jié)炎研究中發(fā)現(xiàn)，白介素-1β 可以上調(diào)uPA、PAI-1 和MMP-9 水平，進(jìn)而調(diào)控ECM 的代謝平衡[19]。在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠體內(nèi)，過(guò)表達(dá)PAI-1 可加重纖維化[18]；肺成纖維細(xì)胞中uPA 表達(dá)上調(diào)，PAI-1 呈下降趨勢(shì)[20]；然而，氯化汞引起的腎小管間質(zhì)纖維化中，PAI-1 表達(dá)不斷增加，而uPA 表達(dá)并沒(méi)有增加[21]，說(shuō)明在不同器官纖維化中uPA 系統(tǒng)的表達(dá)存在差異，這可能與不同的誘導(dǎo)機(jī)制有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，熱滅活的S.agalactiae誘導(dǎo)BMFBs 在早期表達(dá)MMP-2、MMP-9 和uPA，uPA 可以與纖溶酶原結(jié)合位點(diǎn)及uPA 受體結(jié)合，能將無(wú)活性的Pro-MMP 激活成為有活性的MMP[22]。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，在中期PAI-1 表達(dá)上升，而MMPs 表達(dá)下降，PAI與uPA 結(jié)合，抑制了其功能，uPA 的下調(diào)可能促進(jìn)了TGF-β1 前體激活，從而抑制MMPs 的活性，加重纖維化程度；uPA 纖溶酶一方面激活MMPs，引起ECM 降解，另一方面又誘導(dǎo)產(chǎn)生PAI-1，使纖溶酶的產(chǎn)生受限，激活不至于過(guò)度。說(shuō)明uPA系統(tǒng)一方面調(diào)控ECM 的代謝，另一方面參與誘導(dǎo)調(diào)控MMPs 的激活和調(diào)控過(guò)程，而且在纖維化中可能與ECM 的降解平衡失調(diào)有關(guān)，也可能存在相互誘導(dǎo)或抑制的關(guān)系。

抑制MMPs 蛋白水解活性或上調(diào)TIMPs 表達(dá)通常是ECM 積累導(dǎo)致纖維化的重要原因之一[23]。關(guān)于組織器官纖維化的研究報(bào)道比較多，在CCL4和膽管結(jié)扎誘導(dǎo)的肝臟纖維化模型組中，MMP-2 和MMP-9 表達(dá)顯著下降，而TIMP-1 表達(dá)顯著增高[24]；有研究[25]表明，MMPs 失衡與心肌纖維化的發(fā)展有關(guān)，在梗死大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭杏^察到發(fā)生心肌梗死的大鼠MMP-2、MMP-9 表達(dá)上調(diào)；據(jù)文獻(xiàn)[26]報(bào)道，給予小鼠模型外源性LPS（lipopolysaccharide）刺激，會(huì)導(dǎo)致MMP-2、MMP-9 蛋白水平顯著升高，心臟纖維化加重；有研究[27]發(fā)現(xiàn)，白介素-1β、表皮生長(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子-α 等因子可誘導(dǎo)MMPs轉(zhuǎn)錄，證明MMPs 的表達(dá)與細(xì)胞因子表達(dá)有關(guān)，而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 可在轉(zhuǎn)錄水平阻斷MMPs 的表達(dá)。本課題組前期研究表明，S.agalactiae可以誘導(dǎo)BMFBs 中TGF-β1、PDGF、bFGF 的 表 達(dá)[28]，在L-NAME 誘導(dǎo)高血壓大鼠模型中也觀察到了TGF-β1 表達(dá)，TGF-β1 在炎癥反應(yīng)中起著重要作用，其過(guò)高表達(dá)可促進(jìn)纖維化發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[29]。

本研究結(jié)果表明，S.agalactiae處理BMFBs后，明膠酶譜法檢測(cè)MMP-2、MMP-9 酶活性良好，且呈上調(diào)趨勢(shì)，這與陳良志等[30]研究結(jié)果類(lèi)似；MMP-2 的分泌活性與MMP-9 相當(dāng)，且二者活性在48 h 顯著升高，這與繆增強(qiáng)等[31]的研究結(jié)果類(lèi)似；在體內(nèi)，活性MMP-2、MMP-9 才具有水解膠原及其他基質(zhì)的作用，有研究[32]證明，在惡性腫瘤中MMP-2 的表達(dá)高于良性腫瘤，這種差異是由于活性MMP-2 表達(dá)不同引起的。在本試驗(yàn)中，MMP-2 分泌活性與MMP-2 蛋白表達(dá)呈現(xiàn)相同趨勢(shì)，MMP-9 表達(dá)前期也與分泌活性相同，與該研究結(jié)果類(lèi)似。PCL 兔膝后交叉韌帶（PCL）損傷后，存在炎癥細(xì)胞因子介導(dǎo)的MMPs 過(guò)表達(dá)，持續(xù)高表達(dá)的炎癥細(xì)胞因子引發(fā)MMPs 活性增加后，損傷的關(guān)節(jié)軟骨等組織將被降解，最終難以自我修復(fù)[33]。

但在本研究中，MMP-2 呈上升下降再上升的趨勢(shì)，MMP-9 也隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，下降趨勢(shì)可能與細(xì)胞因子的表達(dá)有關(guān)，也可能與S.agalactiae引發(fā)的不同誘導(dǎo)機(jī)制有關(guān)；在肺臟纖維化的相關(guān)研究中，MMP-9 減少可以減輕纖維化，此過(guò)程依賴于TGF-β1 的活性[34]，說(shuō)明在本研究中，熱滅活的S.agalactiae誘導(dǎo)BMFB 分泌MMP-2、MMP-9 來(lái)降解ECM，可能抑制纖維化進(jìn)程，同時(shí)MMPs也可能受到其他因素影響而降低表達(dá)。TIMPs 作為MMPs 的主要抑制因子，對(duì)MMPs 有很強(qiáng)抑制作用，可與MMPs 形成復(fù)合物以抑制其活性[26]。其中TIMP-1 能特異性抑制MMP-9，TIMP-2 能特異性抑制MMP-2，越來(lái)越多證據(jù)表明TIMP-2 具有雙重調(diào)節(jié)功能，在MMP-2 的激活和抑制中均起作用[35]。MMP-9 與TIMP-1 在纖維化中關(guān)系密切。

李圣青等[36]研究發(fā)現(xiàn)，MMPs/TIMPs 比例失衡可能會(huì)加速肺纖維化進(jìn)程，在肺纖維化后期，MMP-9 表達(dá)下降，而TIMP-1 表達(dá)上升，肺部成纖維細(xì)胞增生增多，局部發(fā)生肺實(shí)變。盡管TIMPs可以抑制MMPs 降解ECM，但在博來(lái)霉素模型中敲除TIMP-1 并不影響肺纖維化發(fā)生進(jìn)程，敲除TIMP-2 基因小鼠肺纖維化程度與野生型小鼠相似[37]；也有研究[38]發(fā)現(xiàn)，在博來(lái)霉素大鼠模型中，肺纖維化發(fā)生時(shí)，TIMP-1 表達(dá)呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，MMP-9 則呈下降趨勢(shì)，MMP-9/TIMP-1 表達(dá)失衡，肺纖維化加重；在MCD 飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝纖維化模型中，TIMP-1 和MMP-9 表達(dá)呈相反趨勢(shì)，說(shuō)明TIMP-1 可以抑制MMP-9 表達(dá)[39]；在TGF-β1 轉(zhuǎn)基因小鼠中，TIMPs 表達(dá)上調(diào)，MMP-9 降低，MMPs/TIMPs 比例失衡導(dǎo)致肺纖維化[40]。

本研究中，TIMP-1 蛋白水平與對(duì)照組相比主要呈先下降后上升趨勢(shì)，MMP-9 蛋白水平主要呈先升高后下降趨勢(shì)，MMP-2 蛋白呈先升高后降低再升高趨勢(shì)，而TIMP-2 則呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)；MMPs 和TIMPs 呈相反趨勢(shì)，在前期一直維持動(dòng)態(tài)平衡，隨著作用時(shí)間增長(zhǎng)TIMP-1、TIMP-2表現(xiàn)出一定上升趨勢(shì)，對(duì)MMPs 表現(xiàn)出抑制作用，MMP/TIMP 失衡，提示此時(shí)纖維化加重，與相關(guān)報(bào)道結(jié)果類(lèi)似。也有研究[41]發(fā)現(xiàn)，早期肺纖維化模型中MMP-9 表達(dá)增加，而TIMP-2 水平較低，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，MMP-9 表達(dá)下降，TIMP-2 表達(dá)上升，導(dǎo)致肺纖維化。本研究早期MMP-9 上升，TIMP-2 表達(dá)不明顯，而后期TIMP-2 表達(dá)逐漸上升后，MMP-9 下降，與該研究結(jié)果一致。

有研究[42]表明，炎癥初期MMP-19 表達(dá)增強(qiáng)而MMP-28 表達(dá)減弱，TIMP-1 和TIMP-2 轉(zhuǎn)錄水平升高，但TIMP-3 和TIMP-4 轉(zhuǎn)錄水平降低，說(shuō)明炎癥反應(yīng)初期纖維化相關(guān)因子存在雙向改變，MMPs 表達(dá)又受炎癥細(xì)胞因子、細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子、生長(zhǎng)因子和激素等調(diào)節(jié)。這可能是引起本試驗(yàn)MMPs 活性上升但蛋白表達(dá)量下降的原因，提示S.agalactiae可能通過(guò)激活MMPs/TIMPs 共同調(diào)控ECM 的降解與維持動(dòng)態(tài)平衡；并可能存在某一種或多種MMPs/TIMPs 在S.agalactiae誘導(dǎo)乳腺纖維化過(guò)程中起促進(jìn)纖維化或抑制纖維化作用。

本課題組前期研究表明，外源性細(xì)胞因子也可以促進(jìn)ECM 蛋白表達(dá)[43]；在肝纖維化模型中對(duì)PAI-1、TIMP-1 適當(dāng)抑制可以使uPA 及MMPs活性有所提高，逆轉(zhuǎn)肝纖維化和肝硬化發(fā)展進(jìn)程[44]；有研究發(fā)現(xiàn)，PAI-1基因缺失可以延緩纖維化進(jìn)程[45]；肺成纖維細(xì)胞中uPA 表達(dá)上調(diào)，而PAI-1 呈下降趨勢(shì)[46]；然而，氯化汞引起的腎小管間質(zhì)纖維化中，PAI-1 表達(dá)不斷增加，而uPA 的表達(dá)并沒(méi)有增加[47]，說(shuō)明不同器官纖維化時(shí)uPA 系統(tǒng)的表達(dá)存在差異，這可能與不同的誘導(dǎo)機(jī)制有關(guān)。此外，在博來(lái)霉素肺纖維化模型中，經(jīng)外源性u(píng)PA 刺激，TIMP-1 表達(dá)會(huì)減少，說(shuō)明uPA 可以通過(guò)抑制TIMP-1，從而減輕肺纖維化程度[38]；CCL4 誘導(dǎo)小鼠肝臟纖維化模型中證明，Smad7 和uPA 的過(guò)表達(dá)顯著抑制了α-SMA 和TGF-β1 的表達(dá)[34]。本研究發(fā)現(xiàn)，在S.agalactiae作用48 h 后，TIMP-1 表達(dá)升高，而uPA 下降，與相關(guān)報(bào)道[38]研究結(jié)果類(lèi)似，由此推測(cè)，在乳腺纖維化過(guò)程中uPA 系統(tǒng)不僅僅發(fā)揮調(diào)控MMPs 的作用，還可以抑制TIMPs，并與細(xì)胞因子相互聯(lián)系共同調(diào)控乳腺纖維化發(fā)展。

有研究[6]證明，在肝纖維化中纖溶系統(tǒng)通過(guò)uPA-纖溶酶-MMPs-ECM 級(jí)聯(lián)機(jī)制促進(jìn)ECM 降解，但關(guān)于uPA 系統(tǒng)參與奶牛乳腺纖維化調(diào)控的研究報(bào)道很少，MMPs/TIMPs 及uPA 系統(tǒng)作為調(diào)控ECM 分解代謝的主要酶系，其在乳腺纖維化中的作用也尚未做過(guò)系統(tǒng)研究。本試驗(yàn)為明確MMPs/TIMPs 及uPA 系統(tǒng)對(duì)奶牛乳腺纖維化的影響奠定了基礎(chǔ)，為進(jìn)一步的研究提供了相關(guān)依據(jù)。