新疆野生北山羊小反芻獸疫病毒分子特征

汪 萍，夏 俊，王 文，馬曉艷，吳曉東，苗書(shū)魁，馬文戈，黃忠武，魏玉榮，陸桂麗，沙依蘭·卡依扎，米曉云，黃 炯

（1.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所，動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心，新疆烏魯木齊 830013；2.新疆維吾爾自治區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆烏魯木齊 830013；3.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；4.阿克蘇地區(qū)庫(kù)車縣獸醫(yī)站，新疆庫(kù)車 843000）

小 反 芻 獸 疫（peste des petits ruminants，PPR）是由小反芻獸疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV）引起的一種急性傳染病，主要感染小反芻動(dòng)物，以發(fā)熱、口炎、腹瀉、肺炎為特征[1]。綿羊、山羊、小反芻類野生動(dòng)物均對(duì)PPRV 易感。牛、水牛、駱駝、豬也可感染PPRV，但除駱駝外很少表現(xiàn)臨床癥狀[2]。部分易感野生動(dòng)物以及牛、豬等家養(yǎng)動(dòng)物感染PPRV 后不發(fā)病，但體內(nèi)可持續(xù)隱性帶毒，這為PPR 防控帶來(lái)潛在威脅。自2013 年新疆霍城縣發(fā)生PPR 以來(lái)，2014—2016 年新疆鄯善、博樂(lè)、庫(kù)車、烏魯木齊等地的野生北山羊、盤羊、瞪羚也出現(xiàn)PPRV感染引起的死亡[3]。2017 年，新疆阿克蘇地區(qū)發(fā)現(xiàn)2 只野生北山羊死于PPRV 感染。由野生動(dòng)物感染PPRV 的報(bào)道可見(jiàn)，PPRV 不但對(duì)野生動(dòng)物瀕危物種的生存構(gòu)成嚴(yán)重威脅，還因野生動(dòng)物中PPRV的持續(xù)存在，影響PPR 全球根除計(jì)劃的完成。因此，除對(duì)家養(yǎng)動(dòng)物進(jìn)行疫苗免疫外，還需要持續(xù)加強(qiáng)對(duì)野生動(dòng)物感染PPRV 的關(guān)注。研究我國(guó)野生動(dòng)物的PPRV 分子生物學(xué)特征，可為制定系統(tǒng)、全面、有效的PPR 防疫策略提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

2017 年1 月，新疆阿克蘇地區(qū)2 只野生北山羊異常死亡，臨床癥狀疑似PPRV 感染。采集肺和淋巴結(jié)，將組織研磨，凍融3 次后12 000 r/min 離心20 min，取上清提取RNA。RNA 提取試劑盒，QIAGEN 公司產(chǎn)品；One step RT-PCR kit，Takara 公司產(chǎn)品；DNA凝膠回收試劑盒，AXYGEN公司產(chǎn)品。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank 公布的PPRV 基因組序列，設(shè)計(jì)14 對(duì)寡核苷酸引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 病毒RNA 提取和RT-PCR

按QIAGEN RNeasy MINI Kit 說(shuō)明書(shū)提取病毒RNA，取5 μL 提取的RNA 于50 μL 反應(yīng)體系進(jìn)行RT-PCR 反應(yīng)（Takara One step RT-PCR kit）。反應(yīng)條件如下：50 ℃，30 min 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；94 ℃，2 min 進(jìn)行Taq酶激活；30 個(gè)循環(huán)的PCR（94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min）；72 ℃，10 min 延伸。

1.4 序列測(cè)定

將RT-PCR 鑒定為陽(yáng)性的產(chǎn)物，命名為China/XJAKS/2017。按AXYGEN DNA 凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行膠回收。將PCR 產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.5 基因組和系統(tǒng)發(fā)育分析

用DNAstar 4.0 軟 件 和Clustal W 方 法，對(duì)China/XJAKS/2017 的全基因組序列和推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行比較，并與其他具有代表性的PPRV 株進(jìn)行比較?；谌L(zhǎng)基因組，N基因核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用MEGA 5.0 軟件，確定PPRV 的進(jìn)化趨勢(shì)。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR

用14 對(duì)PPRV 特異性引物進(jìn)行RT-PCR，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得14個(gè)基因片段（圖1）。

2.2 China/XJAKS/2017 基因組長(zhǎng)度及特點(diǎn)

圖1 China/XJAKS/2017 株RT-PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果

利用DNAstar 4.0 軟件，將分段獲取的China/XJAKS/2017 基因序列拼接，得到的基因組全長(zhǎng) 為15 954 nt，與GenBank 上 公 布 的China/XJYL/2013、China/XJBZ/2015、CH/HNZM/2014、CH/HNNY/2014、China/BJ/2014、CH/GDDG/2014這6 個(gè)毒株的全基因組序列長(zhǎng)度完全一致。而與全基因組長(zhǎng)度為15 948 nt 的 Nigeria 75/1、ICV89、Oman 1983 等國(guó)外分離毒株基因組長(zhǎng)度不同，多出了6 nt。與其他參考毒株相比，China/XJAKS/2017第4 828 位點(diǎn)有1 個(gè)堿基（C）缺失，第5 214 位點(diǎn)有1 個(gè)堿基（C）插入。突變和缺失主要集中在基因組的第4 500～5 224 位（圖2～3）。

2.3 China/XJAKS/2017 與其他PPRV 毒株的基因同源性比較

通過(guò)全基因組比對(duì)發(fā)現(xiàn)，China/XJAKS/2017與同為基因IV 型的中國(guó)分離株同源率高，尤其和2 個(gè)新疆分離株（China/XJYL/2013、China/XJBZ/2015）同源率最高，分別達(dá)99.6%、99.0%。與基因I 型和III 型毒株的同源率低，為87.0%～90.2%，其中與KN5/2011 同源率最低，為87.0%（圖4）。

China/XJAKS/2017 與2 個(gè)新疆分離株（China/XJBZ/2015、China/XJYL/2013）、1 個(gè)西藏分離株（China/Tibet/2007）、2 個(gè)疫苗株（Sungri/96、Nigeria/75/1）進(jìn)行同源性比較發(fā)現(xiàn)：3'UTR、N、P、V、C、M、F、H、L、5'UTR 的全長(zhǎng)基因組同源性分別為92.5%～99.1%、93.4%～99.8%、92.7%～99.5%、93.3%～99.2%、92.3%～99.1%、93.8%～99.80%、92.9%～100%、91.1%～99.3%、93.6%～99.5%、91.7%～100% 和92.1%～99.6%。氨基酸水平上，L 蛋白和N 蛋白保守性最高，分別為97.0%～99.4%和94.5%～99.6%；非結(jié)構(gòu)蛋白V 蛋白和C 蛋白的保守性最低，分別為87.9%～98.7%和88.8%～98.3%。作為病毒感染細(xì)胞和誘導(dǎo)中和抗體最重要的F 蛋白和H 蛋白，China/XJAKS/2017與基因II 型疫苗株Nigeria/75/1 的同源率分別為96.5%和92.5%（表1）。

圖2 China/XJAKS/2017 與各參考毒株全基因比較結(jié)果

圖3 China/XJAKS/2017 與各參考毒株基因序列比對(duì)結(jié)果

表1 China/XJAKS/2017 與新疆分離株、西藏株、疫苗株等的同源性 %

圖4 China/XJAKS/2017 與參考毒株全基因同源性分析結(jié)果

2.4 China/XJAKS/2017 的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為確定China/XJAKS/2017 的分類地位，分別以不同地區(qū)、不同年代及不同基因型的PPRV 毒株N基因和全基因序列為基礎(chǔ)繪制了進(jìn)化樹(shù)。N基因進(jìn)化分析結(jié)果（圖5）顯示：China/XJAKS/2017 屬于基因IV 系；在N基因核酸序列水平上，China/XJAKS/2017 與除西藏地區(qū)分離毒株外的其余中國(guó)分離株親緣關(guān)系最近，同在一個(gè)小的分支；與國(guó)外毒株相比，則與鄰國(guó)巴基斯坦和塔吉克斯坦分離毒株親緣關(guān)系最近。全長(zhǎng)基因組系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果（圖6）顯示，在全基因核酸序列水平上，China/XJAKS/2017 同樣與除西藏以外的國(guó)內(nèi)其他分離株遺傳距離最近，共同形成一個(gè)小分支，而西藏分離株則與印度分離株親緣關(guān)系最近。

圖5 基于N 基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果

圖6 基于全長(zhǎng)基因組的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果

3 討論

PPRV 分子生物特征顯示，China/XJAKS/2017比Nigeria 75/1、ICV89、Oman 1983 等 國(guó) 外分離毒株的全基因組長(zhǎng)度多了6 nt，與China/XJYL/2013、China/XJBZ/2015、CH/HNZM/2014、CH/HNNY/2014、China/BJ/2014、CH/GDDG/2014這6 個(gè)毒株不僅基因組長(zhǎng)度相同，而且在M 和F蛋白之間的第5 222～5 227 位比其他毒株多出6 nt，但這并沒(méi)有影響結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的大小。核苷酸同源性分析表明，China/XJAKS/2017與China/XJYL/2013 全基因核苷酸同源性為99.6%。由此可見(jiàn)，自2013 年新疆發(fā)生PPR 以來(lái)，隨著時(shí)間的推移，PPRV 有從新疆西北部向南傳播的態(tài)勢(shì)。China/XJAKS/2017 雖然出現(xiàn)了個(gè)別位點(diǎn)的缺失或插入，但與China/XJYL/2013 相比，變異程度較低。

通過(guò)遺傳進(jìn)化分析可以看出，China/XJAKS/2017 與國(guó)內(nèi)毒株特別是新疆本地分離的PPRV 毒株最相似。與國(guó)外毒株相比，與巴基斯坦和塔吉克斯坦分離的PPRV 毒株最相似[4-5]。因此，分析PPRV 的分子生物學(xué)特點(diǎn)對(duì)于病毒溯源有一定參考意義。

China/XJAKS/2017 與疫苗株Nigeria/75/1 的H蛋白同源性為92.5%。而H蛋白是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的蛋白[6-7]。目前商品化PPR 活疫苗（Nigeria75株或sungri96 株）被認(rèn)為能保護(hù)所有基因譜系[8]。我國(guó)PPRV 基本屬于基因IV 型。2007 年以來(lái)，基因II 型的Nigeria75 株作為疫苗株在我國(guó)應(yīng)用，免疫效果良好[9]。但疫苗接種后的保護(hù)水平還受疫苗株和田間毒株抗原差異的影響，因此各地發(fā)病率也不同，我國(guó)有的地區(qū)已經(jīng)達(dá)到免疫無(wú)疫，但有的地區(qū)還呈現(xiàn)點(diǎn)狀散發(fā)。另外，自然環(huán)境中存在不同宿主來(lái)源的病毒，如野生動(dòng)物以及帶毒的非易感家養(yǎng)動(dòng)物、康復(fù)動(dòng)物或疫苗接種動(dòng)物。它們?cè)诓《具M(jìn)化過(guò)程中的作用機(jī)制尚不清楚，因此要達(dá)到消除PPRV 的目標(biāo)，除對(duì)家養(yǎng)動(dòng)物免疫外，還需對(duì)不同宿主來(lái)源的病毒進(jìn)行分子流行病學(xué)研究。

新疆地理位置特殊，與俄羅斯、哈薩克斯坦、吉爾吉斯斯坦、塔吉克斯坦、巴基斯坦、蒙古國(guó)、印度、阿富汗接壤。而阿富汗、印度、塔吉克斯坦和巴基斯坦等國(guó)家的PPR 疫情常年呈地方性暴發(fā)流行。近年來(lái)，新疆與哈薩克斯坦、蒙古國(guó)接壤的地區(qū)發(fā)生了北山羊、盤羊、瞪羚感染PPRV 引起死亡的事件。PPR 作為一種自然流行疾病，將長(zhǎng)期存在于野生動(dòng)物中，并相互傳播[10-11]。這不但對(duì)瀕危野生小反芻動(dòng)物造成威脅，可能在野生動(dòng)物之間、野生動(dòng)物與牲畜之間傳播，這為我國(guó)消除PPR 帶來(lái)困難。綜上所述，新疆PPR 防控形勢(shì)依然嚴(yán)峻，需加強(qiáng)我國(guó)邊疆地區(qū)PPR 免疫隔離帶建設(shè)，并對(duì)野生動(dòng)物感染的PPRV分子流行病學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行追蹤監(jiān)測(cè)。