五味子乙素下調(diào)IGFBP2表達(dá)抑制吉非替尼耐藥肺癌細(xì)胞增殖

孫蕾，藍(lán)秀，呂祝慶，李偉文

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，浙江 麗水 323000

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康，其中，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常見的惡性腫瘤，占肺癌的85%以上，大部分患者確診時已為晚期，治療效果不佳，5年生存率僅為17.1%[1]。吉非替尼（gefitinib，Gef）的應(yīng)用顯著延長了患者無進(jìn)展期和生存期，但極易耐藥[2]。五味子乙素（Schisandrin B，Sch B）是一種具有廣譜抗癌作用的中藥單體[3]，不僅能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖[4]，還能抵抗多種抗腫瘤藥物（如多西他賽、阿霉素）的耐藥性[5-7]。然而，Sch B能夠緩解吉非替尼耐藥的作用及其機(jī)制仍未明確。胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2（insulin-like growth factor binding protein 2，IGFBP2）在肺癌組織中呈高表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、轉(zhuǎn)化等惡性生物行為密切相關(guān)[8]。也有研究報道IGFBP2與埃羅替尼、達(dá)沙替尼等藥耐藥有關(guān)[9]，IGFBP2 可能是緩解吉非替尼耐藥的關(guān)鍵靶點。因此，本研究觀察Sch B對Gef耐藥的PC9（PC9/GR）細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并探討IGFBP2在Sch B抑制PC9/GR細(xì)胞增殖中的作用。

1 材料和方法

1.1 試劑 Sch B（＞98%，相對分子質(zhì)量：400.4648， 貨號：S117968）購自美國阿拉丁公司，杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM，貨號：11965118）、青霉素-鏈霉素雙抗（貨號：15140148）、胎牛血清（FBS，貨號：10091155）、胰蛋白酶（貨號：25300054）購自美國Gibco公司，3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT，貨號：M5655）、二甲亞砜（貨號：D2650）購自美國Sigma公司；IGFBP2（貨號：3922）、p-AKT（貨號：4060）、AKT（貨號：4685）、p-mTORC1（貨號：5536）、mTORC1（貨號：2587）和β-actin（貨號：4970）單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與馴化 將人肺癌PC9細(xì)胞（ATCC細(xì)胞庫）培養(yǎng)種植于含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。采用濃度遞增法構(gòu)建Gef耐藥的細(xì)胞，使PC9能在含有200 nmol/L的Gef培養(yǎng)基中穩(wěn)定存活，建立PC9獲得性耐藥細(xì)胞（PC9/GR）。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 按2×105個PC9/GR細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板。用無雙抗、無血清培養(yǎng)基，置于飽和濕度、37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至40%～50%時進(jìn)行病毒感染。按照說明書方法，取 10 μL的IGFBP2 過表達(dá)腺病毒載體和陰性腺病毒載體原液，逐步濃度稀釋為10-7PFU/mL，按每孔 1 000 μL稀釋液加入細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)8～12 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)。在轉(zhuǎn)染后12、24、48 h觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況，獲得IGFBP2 過表達(dá)組和陰性載體組的 PC9/GR細(xì)胞，并用Western blot進(jìn)行驗證。

1.4 細(xì)胞分組 將細(xì)胞分為PC9組、PC9/GR組，Sch B組、陰性載體組、IGFBP2過表達(dá)組、陰性載體+ Sch B組、IGFBP2過表達(dá)+Sch B組處理；Sch B組為用25、50、100 μmol/L Sch B處理的PC9/GR細(xì)胞，陰性載體組為陰性腺病毒載體轉(zhuǎn)染的PC9/GR細(xì)胞，IGFBP2過表達(dá)組為IGFBP2過表達(dá)腺病毒載體轉(zhuǎn)染的PC9/GR細(xì)胞，陰性載體組+Sch B組為陰性腺病毒載體轉(zhuǎn)染的PC9/GR細(xì)胞，并用50 μmol/L Sch B處理，IGFPB2過表達(dá)+Sch B組為IGFBP2過表達(dá)腺病毒載體轉(zhuǎn)染PC9/GR細(xì)胞，并用50 μmol/L Sch B處理，PC9/GR組為PC9/GR細(xì)胞，PC9組為未馴化耐藥的PC9細(xì)胞。

1.5 細(xì)胞存活實驗 將2×105個PC9/GR細(xì)胞接種于96孔板中，按PC9組、PC9/GR組，Sch B組、陰性載體+Sch B組、IGFBP2過表達(dá)+Sch B組處理，并繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTT，37 ℃下孵育4 h。棄去上清液，加入二甲亞砜120 μL終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀中檢測各孔的吸光度值，計算細(xì)胞存活率。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測 將2×106個PC9/GR細(xì)胞接種于6 孔板中，按Sch B組、陰性載體+Sch B組、IGFBP2過表達(dá)+Sch B組處理，并繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，加入1 mL PBS洗滌3次，再加入196 μL Binding buffer，并依次加入5 μL Annexin VFITC、10 μL PI，室溫下避光孵育15 min，用流式細(xì)胞儀檢測。

1.7 Western blot檢測 用預(yù)冷PBS漂洗3次后，加入150 μL RIPA細(xì)胞裂解液，冰上裂解15 min，收集細(xì)胞裂解液，置于4 ℃離心機(jī)，12 000 r/min離心15 min，取上清液。取20 μg總蛋白用聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜；經(jīng)3%脫脂奶粉封閉1 h，加入適量比例的抗IGFBP2、p-AKT、AKT、p-mTORC1、mTORC1一抗，置于4 ℃冰箱過夜。用PBST緩沖液洗膜后，按1:10 000～1:20 000加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫下孵育2 h。洗膜后，用增強化學(xué)發(fā)光法顯影，Image J統(tǒng)計條帶的灰度值。

1.8 RT-PCR檢測 總RNA用TRIzol試劑（美國 Invitrogen公司）抽提，即加入1 mL TRIzol試劑吹下細(xì)胞，加入200 μL氯仿，EP管內(nèi)靜置15 min后，置于4 ℃離心機(jī)，12 000 r/min離心15 min。取上清液，用1 mL 75%乙醇洗滌，再次離心，棄上清液、干燥后取RNA沉淀物。按照PrimeScript RT Master Mix（大連Takara公司）說明書合成cDNA。將反轉(zhuǎn)錄物用SYBR Premix Ex TaqTMII試劑盒（大連Takara公司）在ABI 7500 PCR儀上進(jìn)行real time-PCR擴(kuò)增、檢測。使用GAPDH作為內(nèi)參照，引物系列如下：IGFBP2上游5’-GCCCTCTGGAGCACCTCTACT-3’，下游5’-CATCTTGCACTGTTTGAGGTTGTAC-3’；GAPDH：上游5’-CT CCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3’，下游5’-CCCAATACGACCAA ATCCGTT-3’；采用ΔΔCt法分析IGFBP2 mRNA的表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以表示，2組間比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PC9與PC9/GR細(xì)胞存活和IGFBP2 表達(dá)差異 200 nmol/L的Gef處理條件下，PC9/GR組存活率無明顯下降，PC9組存活率顯著降低（見圖1A）；與PC9組比較，PC9/GR組IGFBP2的mRNA和蛋白表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見圖1B-D）。

2.2 Sch B對PC9/GR細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與PC9/GR組相比，25、50、100 μmol/L Sch B處理的PC9/GR細(xì)胞存活率明顯下降（見圖2A），細(xì)胞凋亡比例明顯增加（見圖2B），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；且吸光度值下降率約50%時，Sch B的濃度為50 μmol/L，該濃度用于后續(xù)實驗。

2.3 Sch B對PC9/GR細(xì)胞IGFBP2、AKT、mTORC1的影響 與PC9/GR組相比，25、50、100 μmol/L Sch B 處理的PC9/GR細(xì)胞IGFBP2、p-AKT、p-mTORC1明顯下降（見圖3），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 IGFBP2過表達(dá)減弱Sch B誘導(dǎo)的PC9/GR細(xì)胞增殖抑制作用 與陰性載體組相比，IGFBP2 過表達(dá)組IGFBP2、p-AKT、p-mTORC1明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與陰性載體+Sch B組相比，IGFBP2過表達(dá)+Sch B組細(xì)胞存活增加，細(xì)胞凋亡降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

3 討論

圖1 PC9與PC9/GR細(xì)胞存活和IGFBP2表達(dá)情況

圖2 Sch B抑制PC9/GR細(xì)胞增殖促進(jìn)凋亡

圖3 Sch B抑制PC9/GR細(xì)胞IGFBP2、AKT、mTORC1的表達(dá)

圖4 IGFBP2過表達(dá)對Sch B誘導(dǎo)PC9/GR細(xì)胞增殖抑制和凋亡作用的影響

Gef屬于第一代酪氨酸激酶抑制劑，靶向抑制EGFR分子生物學(xué)功能，顯著提高EGFR突變肺癌患者的臨床療效。然而，大部分患者接受Gef治療后極易發(fā)生耐藥，其機(jī)制包括：T790M突變、旁路信號通路、EGFR下游信號通路等[10]。胰島素樣生長受體1（IGF receptor 1，IGFR1）介導(dǎo)的信號通路被認(rèn)為是EGFR受體抑制劑耐藥的關(guān)鍵通路。IGFR1通過激活PI3K/AKT信號通路，促使細(xì)胞逃避Gef的殺傷作用，且IGFR1受體抑制劑能顯著提高Gef的療效[11]。IGFBP2是胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白家族主要成員之一，通過激活多條信號通路，如PI3K/AKT、ERKMAPK信號通路，參與肺癌細(xì)胞增殖、遷移、耐藥，介導(dǎo)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。研究表明IGFBP2通過增加腫瘤微血管新生來抵抗藥物的殺傷作用[12]。IGFBP2激活下游AKT信號通路，促使肺癌細(xì)胞對達(dá)沙替尼耐藥[8]。本研究結(jié)果也證實，與非耐藥細(xì)胞相比，Gef耐藥細(xì)胞內(nèi)IGFBP2蛋白和mRNA表達(dá)量均明顯增加，說明了IGFBP2高表達(dá)可能是PC9細(xì)胞對Gef耐藥的關(guān)鍵分子。

Sch B是五味子的主要活性成分之一，具有化療增敏、緩解腫瘤耐藥的作用。YAN等[5]證實Sch B顯著增加多西他賽的抗腫瘤敏感性。HUANG等[6]證實Sch B能夠逆轉(zhuǎn)P-糖蛋白介導(dǎo)阿霉素耐藥作用。WANG等[7]證實Sch B抑制P-糖蛋白和促進(jìn)蛋白酶體介導(dǎo)的survivin降解逆轉(zhuǎn)阿霉素耐藥性。本研究 中，Sch B處理后，PC9/GR細(xì)胞存活率明顯下降、細(xì)胞凋亡比例明顯升高，IGFBP2、AKT、mTORC1的磷酸化水平明顯下降，說明Sch B具有抑制Gef耐藥細(xì)胞增殖、下調(diào)IGFBP2、抑制AMT/mTORC1通路的作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)IGFBP2 腺病毒顯著抵抗SchB對PC9/GR細(xì)胞增殖抑制作用。

綜上所述，本研究體外證實了獲得性Gef耐藥的PC9/GR細(xì)胞中IGFBP2表達(dá)增高，Sch B通過下調(diào)IGFBP2、抑制AKT/mTORC1，抑制PC9/GR細(xì)胞增殖。然而仍需在體內(nèi)進(jìn)一步研究Sch B對PC9/GR細(xì)胞耐藥的影響，為研發(fā)抗吉非替尼耐藥的新型藥物提供科學(xué)根據(jù)。