槲皮素對人鼻咽癌細胞生長和AKT/mTOR通路表達的影響

張佳鳳，趙輝，何平，郝亞琳，董瓊娜，金曉杰

上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院 耳鼻咽喉科，上海 201112

鼻咽癌是頭頸部的上皮性惡性腫瘤，在東南亞尤其是華南地區(qū)發(fā)病率較高[1]。鼻咽癌的標準治療方法是放療，同時進行輔助化療[2-3]。然而，標準治療只有在早期治療鼻咽癌時才有效。當疾病發(fā)展到晚期時，局部復發(fā)和化療耐藥是導致死亡的主要原因[4]。雖然鼻咽癌與人類EBV感染密切相關，但研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境致癌物、誘導性遺傳因素以及AKT/mTOR通路等的異常激活，都會影響鼻咽癌的轉(zhuǎn)化和發(fā)展[5]。因此，針對這些重要通路的治療策略將有利于更好地開展鼻咽癌的臨床治療。

槲皮素是一種植物性黃酮苷類化合物，被用作營養(yǎng)補充劑，并可預防癌癥等各種疾病的發(fā)生[6]。越來越多的研究揭示了槲皮素的生物和藥理活性，且發(fā)現(xiàn)其可選擇性抑制癌細胞增殖，發(fā)揮促進細胞凋亡作用[7]。槲皮素可抑制膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多種癌細胞增殖和遷移，發(fā)揮抑癌作用[8]。多項研究也在細胞水平發(fā)現(xiàn)，槲皮素可抑制鼻咽癌細胞增殖，誘導凋亡[9-10]。盡管已通過體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)槲皮素可抑制鼻咽癌細胞增殖，但其具體的分子作用機制尚不清楚。本研究擬通過細胞實驗和動物實驗，探索槲皮素對鼻咽癌5-8F細胞增殖的影響，并進一步用熒光定量PCR和Western blot檢測槲皮素對鼻咽癌細胞中AKT/mTOR通路的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑：DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Gibco公司；槲皮素、胰蛋白酶、青鏈霉素購自美國Sigma公司；BCA法蛋白濃度檢測試劑盒購自廣州鼎國生物公司，TRIzol購自美國Life公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光定量PCR檢測試劑盒購自大連寶生物公司。AKT和mTOR基因引物均由生工生物工程（上海)股份有限公司設計合成。MTT和實驗中所使用抗體（AKT多克隆抗體、mTOR多克隆抗體、β-actin單克隆抗體和辣根過氧化物標記的二抗）以及RIPA蛋白裂解液均購自上海碧云天生物技術公司。

1.1.2 細胞與動物：人鼻咽癌5-8F細胞由中科院上海細胞庫提供，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含5%的CO2并且濕度完全飽和的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期對細胞進行傳代。6周齡左右且體質(zhì)量（25±2）g的雌性BALB/c小鼠10只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。動物許可證號為SCXK（京)2016-0011。

1.2 方法

1.2.1 制備小鼠移植瘤模型：將對數(shù)期5-8F細胞濃度調(diào)整至5×107/mL，取0.3 mL細胞懸液在每只小鼠右后側(cè)肢體腋下行皮下注射，連續(xù)觀察1周后以腋下腫瘤結(jié)節(jié)形成且質(zhì)地較硬為成瘤標準。

1.2.2 MTT實驗：將100 μL對數(shù)生長期的5-8F細胞（1×105/孔）接種于96 孔板中，每組設置4 個復孔，共3組，加入不同濃度的槲皮素（20、40和 60 μmol/L）處理24 h、48 h和72 h后，MTT處理 4 h，使用分光光度計檢測吸光度，記下數(shù)值，細胞生長抑制率=（1-加藥組A570/空白組A570）×100%。

1.2.3 藥物處理和腫瘤大小觀察：成瘤小鼠隨機分為對照組和槲皮素組，每組5只。槲皮素組裸鼠腹腔注射25 mg/kg槲皮素，3次/周，每次0.2 mL，共4周，對照組腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液，3次/周，共4周。每周用游標卡尺測量腫瘤的長徑和短徑，腫瘤體積=（長徑×短徑2）/2。給藥4周后，頸椎脫臼法處死裸鼠，取腫瘤組織保存在液氮中。

1.2.4 熒光定量PCR：使用TRIzol試劑分離細胞RNA，測定濃度后采用反轉(zhuǎn)錄PCR實驗獲得cDNA。然后通過實時定量PCR實驗，以GAPDH作為對照，采用2-ΔΔCt法計算AKT和mTOR基因mRNA含量。

1.2.5 Western blot：用預冷的細胞裂解液裂解細胞15 min，4 ℃下12 000 r/min離心5 min，收取蛋白。腫瘤組織先在研缽中加入液氮進行研磨，在研磨充分后加入細胞裂解液，離心后獲得腫瘤組織蛋白，所獲得蛋白經(jīng)BCA比色法計算蛋白濃度。通過SDS-PAGE電泳將蛋白進行分離后先后使用一抗和二抗進行孵育，然后進行條帶的掃描。

1.2.6 免疫組織化學法：脫蠟及水化后的石蠟切片經(jīng)1%的Triton X-100處理15 min，再用3%的H2O2處理10 min，隨后加入AKT和mTOR抗體孵育，置于濕盒4 ℃過夜。第2天清洗后孵育對應的二抗，室溫下30 min。最后進行染色封片。染色結(jié)果采用DAB顯色法進行觀察，使用蘇木精進行對比染色。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用表示，2組間比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，重復測量資料采用重復測量資料的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度槲皮素對鼻咽癌5-8F細胞增殖的影響 20、40、60 μmol/L槲皮素處理24、48和72 h均可顯著抑制5-8F細胞增殖，且槲皮素濃度越高，對細胞的抑制率越高（P＜0.05）。槲皮素抑制5-8F細胞增殖的作用呈濃度依賴性和時間依賴性。見 表1。

表1 槲皮素處理后鼻咽癌5-8F細胞的生長抑制率（%）

2.2 槲皮素對5-8F細胞中AKT/mTOR通路表達的影響 5-8F細胞經(jīng)不同濃度槲皮素（20、40、 60 μmol/L）處理48 h后，隨著槲皮素濃度增加，AKT和mTOR的mRNA水平顯著降低（P＜0.05），見圖1。Western blot檢測細胞中AKT和mTOR的蛋白表達水平發(fā)現(xiàn)，在相同的處理時間內(nèi)（48 h），槲皮素濃度升高，AKT和mTOR的蛋白表達水平降低（P＜0.05），見圖2。

圖1 5-8F細胞經(jīng)槲皮素處理后AKT和mTOR的mRNA水平

2.3 槲皮素對體內(nèi)腫瘤生長的影響 所有裸鼠注射5-8F細胞1周后，進食及活動情況未見明顯變化，腫瘤表面皮膚無破潰發(fā)生。每周對裸鼠的體質(zhì)量和腫瘤體積進行監(jiān)測，結(jié)果顯示裸鼠的體質(zhì)量之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與對照組相比，槲皮素處理組的腫瘤體積在第21天和第28天明顯受抑制 （P＜0.05），見圖3。

2.4 槲皮素抑制AKT和mTOR在體內(nèi)表達 Western blot結(jié)果顯示，槲皮素處理組中，AKT和mTOR蛋白水平顯著降低，與對照組比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖4。免疫組織化學法結(jié)果顯示，槲皮素處理組AKT和mTOR蛋白水平顯著低于對照組，見圖5。

3 討論

鼻咽癌是一種發(fā)生于鼻咽黏膜上皮細胞的惡性腫瘤，具有易復發(fā)、易早期轉(zhuǎn)移及惡性程度高等特點，是我國南方地區(qū)常見頭頸部的惡性腫瘤[1-2]。目前，放療聯(lián)合化療仍是治療鼻咽癌的主要手段，其控制率可達80%以上[11]。然而，放療后的復發(fā)與遠處轉(zhuǎn)移是臨床治療中面臨的兩大難題[12]。因此，尋求藥效強和不良反應小的抗腫瘤藥物是目前鼻咽癌臨床治療中急需解決的問題。

圖2 槲皮素對5-8F細胞中AKT和mTOR蛋白表達水平的影響

圖3 不同處理方式對裸鼠腫瘤生長的影響

圖4 Western blot檢測不同處理組裸鼠腫瘤組織AKT和mTOR蛋白水平

近年來，隨著中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，篩選與挖掘活性天然產(chǎn)物已成為抗腫瘤藥物開發(fā)的重要來 源[13]。來源于中藥地榆的地榆皂苷對肝癌、乳腺 癌、人甲狀腺乳頭狀癌等多種腫瘤均表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤藥效[14]。ZHU等[15]研究發(fā)現(xiàn)，地榆皂苷可激活乳腺癌細胞內(nèi)的ROS/JNK信號通路，進而加速乳腺癌細胞的凋亡。

槲皮素是一種天然的黃酮醇類化合物，廣泛存在于水果、蔬菜及中草藥中，具有顯著的抗炎、抗腫瘤及清除自由基等功效[6]。大量研究表明，槲皮素可調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外AMPK途徑、PI3K-AKT途徑和mTOR等多個信號通路，進而影響腫瘤細胞的生長[16-17]。SU等[18]研究表明，槲皮素可通過AMPK信號通路激活誘導膀胱癌細胞凋亡。WARD等[19]研究結(jié)果也表明槲皮素可通過衰減細胞存活和抑制抗凋亡途徑抑制前列腺癌的發(fā)展。已有多項研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素也可通過抑制鼻咽癌CNE2細胞或HEN1細胞增殖從而誘導細胞凋亡，其誘導細胞凋亡的作用機制可能是通過下調(diào)Bcl-2 蛋白的表達，或?qū)⒓毎芷谧铚贕2/M期和誘發(fā)胱天蛋白酶依賴的細胞凋亡[9-10]。本研究通過細胞實驗也發(fā)現(xiàn)槲皮素可顯著抑制鼻咽癌5-8F細胞增殖，其抑制率與槲皮素濃度呈現(xiàn)正相關性，且通過裸鼠移植瘤模型實驗進一步證實，槲皮素對裸鼠鼻咽癌腫瘤體積有明顯的抑制作用。上述體內(nèi)外實驗表明，槲皮素可能是治療鼻咽癌重要的潛在藥物。

圖5 免疫組織化學法檢測不同處理組裸鼠腫瘤組織AKT和mTOR蛋白水平

AKT/mTOR信號通路是細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導的重要途徑之一，其與細胞的代謝、增殖、分化和凋亡等生理過程緊密相關[20]。AKT是AKT/mTOR信號通路中的一個重要激酶，可磷酸化p70S6K和4EBP1，而p70S6K和4EBP1是AKT/mTOR信號通路下游的主要靶點，可調(diào)控蛋白合成和細胞周期進程。近年來，大量研究已證實，AKT/mTOR信號通路在各類腫瘤的發(fā)病與治療中發(fā)揮了重要的作用。特別是與黃酮類物質(zhì)的抗腫瘤藥效作用發(fā)揮密切相關。JIA等[21]研究發(fā)現(xiàn)槲皮素通過Akt/mTOR途徑抑制乳腺癌糖酵解與遷移，從而抑制乳腺癌的發(fā)展。此外，GRANATO 等[22]研究也表明槲皮素可通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導原發(fā)性積液性淋巴瘤細胞凋亡和自噬。WANG等[23]報道了AKT/mTOR信號通路的激活與鼻咽癌患者不良預后有關，而AKT/mTOR信號通路參與鼻咽癌細胞增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、自噬、凋亡等過程[24-25]。本研究體內(nèi)外實驗均證實，槲皮素能顯著抑制AKT/mTOR信號通路中AKT和mTOR的mRNA和蛋白表達水平。進一步分析發(fā)現(xiàn)，上述蛋白轉(zhuǎn)錄與翻譯水平與鼻咽癌的增殖水平密切相關。這表明，槲皮素可能通過調(diào)節(jié)AKT/mTOR信號通路進而抑制鼻咽癌的發(fā)展，但具體的調(diào)控機制有待進一步研究。

綜上，本研究初步探索了槲皮素抑制鼻咽癌細胞增殖的分子機制，相關結(jié)果為活性天然產(chǎn)物開發(fā)提供了基礎。