神經(jīng)系統(tǒng)SARM1條件性敲除小鼠的構(gòu)建及其應(yīng)用

項魯?shù)ぃ瑢O煥坤，吳仟，汪偉，黃智慧，于欣

1.溫州醫(yī)科大學(xué) 精神醫(yī)學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.杭州師范大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 311121

SARM1（sterile alpha and TIR motif containing 1）蛋白是TLR（Toll-like receptor）5個接頭蛋白中的一個[1-2]，由MINK等[3]于2001年首次報道。SARM1蛋白高表達于神經(jīng)元[4]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，是軸突變性的關(guān)鍵因 子[5]，既參與腦內(nèi)的先天免疫[4]，又調(diào)控神經(jīng)元形態(tài)[6]和凋亡[7]。除此之外，SARM1亦影響神經(jīng)元的突觸反應(yīng)和突觸后蛋白表達水平[8]。因此，SARM1與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能密切相關(guān)。

然而既往對于SARM1基因功能的研究均是在RNA干擾（RNAi）或者全身性敲除SARM1基因的基礎(chǔ)上完成的。RNAi和全身性敲除不能特異性地在特定細胞中將基因敲除，大大限制了相關(guān)基因蛋白在某些特定細胞中作用的研究。為了更精確地研究SARM1在神經(jīng)細胞中的作用，本研究采用了ES細胞 （embryonic stem cell）打靶方式構(gòu)建了SARM1基因條件性敲除（conditional knockout，CKO）小鼠，并將其與神經(jīng)系統(tǒng)特異性的Nestin-Cre小鼠雜交，最終得到SARM1Nestin-CKO小鼠，并探討SARM1在神經(jīng)精神系統(tǒng)疾病中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SARM1flox/flox小鼠（20～25 g，6～ 8周齡，雌性）和Nestin-Cre工具鼠（20～25 g，6～8周齡，雄性）均由上海南方模式生物科技股份有限公司制備。動物飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物許可證號：SYXK（浙）2015-0009，本研究獲得溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 藥物與試劑：PCR引物購自上海生工生物工程有限公司。蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑混合物購自美國Sigma公司。脫脂奶粉購自美國BD公司。1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH=6.8）、1.5 mol/L Tris-HCl（pH=8.8）、30% Acrylamide均購自北京索萊寶有限公司。多聚甲醛購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。兔抗SARM1（ab226930）購自美國Abcam公司，鼠抗β-actin（HC201-01）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，鼠抗NeuN（MAB377）購自美國Millipore公司。辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）偶聯(lián)二抗、ECL檢測試劑盒購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR檢測小鼠基因型：剪取小鼠尾巴加入消化液后100 ℃加熱1 h，冷卻至室溫后加入pH=8.0的Tris-HCl 10 μL輕輕吹打。吹打后置于4 ℃離心機中12 000 r/min離心20 min。取上清液進行基因型鑒定。在離心管中加入DNA、引物、PCR mix構(gòu)建12 μL PCR反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s，退火57 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 1 min；共32 個循環(huán)，最后再延伸72 ℃ 5 min。PCR之后通過瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。根據(jù)電泳結(jié)果篩選含有目的條帶的小鼠，判斷對應(yīng)小鼠是雜合子還是純合子，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.2 Western blot檢測SARM1蛋白表達：在海馬、皮層、小腦組織中加入含有PMSF的蛋白裂解液RIPA，每0.1 g組織中加入2 mL裂解液。置于勻漿機中以60 Hz頻率45 s/次研磨4～5 次。在4 ℃迷你旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器中旋轉(zhuǎn)30 min，并將裂解液以12 000 r/min離心20 min。取上清液，加入5×蛋白緩沖液，并在100 ℃下煮沸10 min。通過SDS-PAGE（8%～12%）分離蛋白質(zhì)，然后將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。在室溫下，將膜在5%脫脂牛奶中封閉1 h，然后將 Western blot與一抗在4 ℃下孵育過夜。一抗包括兔抗SARM1（1:2 000）、β-actin（1:10 000）。隨后，將膜在TBST中洗滌3次，并與HRP偶聯(lián)的二抗孵育 1 h。在TBST中再洗滌3次后，使用ECL檢測試劑盒檢測蛋白質(zhì)信號。使用Quantity One軟件分析印 跡。

1.2.3 免疫熒光評估SARM1在腦組織中表達：心臟灌注后，取出小鼠的腦組織并用新鮮的4%多聚甲醛固定，用30%蔗糖脫水2～3 d，并在冷凍切片機上切成20 μm的切片。在5% BSA和0.3% Triton X-100中，在室溫下封閉1 h進行免疫熒光染色，在4 ℃下與一抗孵育過夜，在PBS中洗滌3次，然后在室溫下孵育二抗1 h。一抗包括兔抗SARM1（1:200），小鼠抗NeuN（1:200）。通過熒光顯微鏡（日本NIKON公司）對圖像進行可視化，并由Image J或Adobe Photoshop CC 14.0軟件進行處理，圖像的定量分析由Image J完成的。

1.2.4 小鼠體質(zhì)量和腦組織大小觀察：分別在出生后7、14、21、28、35、42 d記錄實驗組和對照組小鼠的體質(zhì)量，并進行階段性取材拍照。在出生后14、30、60 d進行腦組織大小測量。

1.2.5 小鼠行為學(xué)檢測：對小鼠進行曠場實驗和高架迷宮實驗，觀察小鼠在新異環(huán)境中的自主行為、探究行為與緊張度[9]。曠場實驗：實驗在安靜的環(huán)境下進行。將動物放入箱內(nèi)底面中心，記錄 5 min之內(nèi)小鼠的總路程和在中央所占的時間百分比。實驗結(jié)束后進行箱子內(nèi)壁及底面的清洗，以免上次動物余留的信息（如動物的大小便、氣味）影響下次測試結(jié)果。更換動物，繼續(xù)實驗。高架十字迷宮實驗：將動物放入迷宮中央?yún)^(qū)，并且每只動物都需要放在同一個方向同一個位置，記錄5 min內(nèi)實驗動物開臂和閉臂的進入次數(shù)及進入各臂的時間。 10 min后將動物放回籠內(nèi)。同時清理迷宮，繼續(xù)實驗。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)代表至少3個獨立實驗的結(jié)果。計量資料以表示，2組比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SARM1在腦組織中的表達情況 為明確SARM1在各個腦區(qū)的表達量，取小鼠大腦皮層、海馬、小腦、紋狀體、丘腦等腦區(qū)的組織進行Western blot檢測，發(fā)現(xiàn)SARM1在小鼠各個腦區(qū)均有表達（見圖1A）。其中，在皮層表達量較高，海馬、小腦、丘腦表達量稍低于皮層，在紋狀體中表達量較低（見圖1B）。進一步采用SARM1和神經(jīng)元特異性標(biāo)記物NeuN免疫雙標(biāo)熒光染色方法發(fā)現(xiàn)SARM1蛋白主要在神經(jīng)元中高表達（見圖1C）。這些結(jié)果表明SARM1在大腦各個腦區(qū)均有表達，主要高表達于神經(jīng)元。

圖1 SARM1蛋白在小鼠腦中的表達情況

2.2SARM1Nestin-CKO小鼠培育 為進一步研究SARM1在神經(jīng)元中功能，我們構(gòu)建了神經(jīng)系統(tǒng)條件性敲除SARM1的小鼠。該小鼠主要通過Infusion的方法構(gòu)建ES細胞打靶載體，該載體經(jīng)線性化后，電轉(zhuǎn)染C57BL/6J×129S3 ES細胞。陽性ES細胞克隆經(jīng)擴增后，注射入C57BL/6J小鼠的囊胚中，獲得嵌合鼠。高比例嵌合小鼠與Flp小鼠交配獲得6 只去Neo陽性F1代小鼠。將去Neo陽性F1代小鼠與野生型C57BL/6J小鼠進行繁育，得到F2代去Flp小鼠（見圖2A）。由于SARM1蛋白主要表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在神經(jīng)元中高表達。為了進一步研究SARM1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及神經(jīng)細胞中的作用，我們采用了在神經(jīng)細胞中特異性表達Cre的Nestin-Cre轉(zhuǎn)基因工具鼠。F2代鼠與組織特異性表達Cre重組酶的小鼠交配后，產(chǎn)生F3代鼠（見圖2B）。將F2、F3以及后代鼠剪尾提取DNA后，采用PCR擴增的方法檢測Flox片段以及Cre重組酶的表達情況（見圖3）。該Flox小鼠與組織特異性表達Cre重組酶的小鼠交配后，其后代Flox純合、Cre陽性小鼠的Flox區(qū)域被敲除，導(dǎo)致目的基因在特定組織和細胞類型中功能性缺失。

圖2 構(gòu)建SARM1Nestin-CKO小鼠示意圖

2.3SARM1Nestin-CKO小鼠鑒定 將后代鼠剪尾提取DNA后PCR擴增檢測Flox片段以及Cre重組酶的表達。不含F(xiàn)lox片段的小鼠可見1條466 bp條帶，F(xiàn)lox純合子只有1條500 bp條帶，雜合子有466 bp和500 bp 2個條帶（見圖3A）。表達Nestin-Cre重組酶的鼠在150 bp處可見條帶（見圖3B），成功構(gòu)建出SARM1基因在神經(jīng)和膠質(zhì)前體細胞中特異性敲除鼠與其對照鼠。Western blot檢測結(jié)果表明，與對照小鼠相比，SARM1Nestin-CKO小鼠3個腦區(qū)的SARM1蛋白表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3C-D。上述這些結(jié)果從DNA水平以及蛋白水平上驗證了SARM1Nestin-CKO小鼠構(gòu)建成功。

圖3 SARM1Nestin-CKO小鼠的鑒定

2.4SARM1基因條件性敲除對小鼠生長發(fā)育的影響 為明確SARM1基因條件性敲除是否會影響小鼠的生長發(fā)育，分別在出生后7、14、21、28、35、42 d記錄實驗組和對照組雄性小鼠的體質(zhì)量。在相同性別情況下，SARM1Nestin-CKO小鼠與對照小鼠在體質(zhì)量與形態(tài)上無差異（見圖4）。在神經(jīng)系統(tǒng)，SARM1敲除小鼠與對照小鼠的腦組織大小在出生后14、30、60 d差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），并且在神經(jīng)元數(shù)量上，皮層和海馬區(qū)差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖5。這些結(jié)果表明SARM1基因條件性敲除不影響小鼠的生長發(fā)育。

2.5SARM1Nestin-CKO小鼠不存在明顯的焦慮障礙 曠場實驗和高架十字迷宮實驗結(jié)果表明，2組小鼠自主活動的總路程和在中央所占的時間百分比，以及進入開臂的次數(shù)和時間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），不存在焦慮樣行為（見圖6）。

圖4 SARM1Nestin-CKO小鼠生長發(fā)育情況

圖5 野生型和SARM1Nestin-CKO小鼠神經(jīng)發(fā)育結(jié)果

圖6 野生型和SARM1Nestin-CKO小鼠曠場和高架十字迷宮實驗結(jié)果

3 討論

神經(jīng)精神疾病越來越受到人們關(guān)注，基礎(chǔ)及臨床研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)精神疾?。òò柎暮Ｄ?、抑郁癥、自閉癥等）的發(fā)生都與免疫系統(tǒng)的功能調(diào)節(jié)相關(guān)。免疫調(diào)節(jié)蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及功能調(diào)節(jié)中所起到的作用及其機制成為學(xué)界研究的熱點。而SARM1蛋白作為先天免疫中重要的負性調(diào)節(jié)蛋白[10]， 也受到研究者的關(guān)注。我們成功構(gòu)建了SARM1基因在神經(jīng)細胞中特異性敲除的CKO小鼠，對于未來的研究可能提供了非常有價值的研究工具。

本研究首先證實了SARM1蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有很高的表達量，尤其是在神經(jīng)細胞中的表達，這和之前的研究[4]發(fā)現(xiàn)是一致的。這一事實間接暗示了SARM1蛋白在神經(jīng)元中可能發(fā)揮著重要的生理作用。以往的研究顯示，生理狀態(tài)下SARM1通過至少兩種途徑調(diào)節(jié)神經(jīng)元的形態(tài)發(fā)生。SARM1一方面可通過參與細胞中的微管穩(wěn)定來調(diào)節(jié)樹突和軸突的生長；另一方面，通過MKK-JNK途徑調(diào)節(jié)神經(jīng)元樹突分支化，軸突生長和神經(jīng)元極性的建立[10]。另外，SARM1的敲低還會改變腦內(nèi)炎癥因子的表達水平，在SARM1基因敲除的胚胎腦中，IL-6和IFN-β均被上調(diào)[11]，表明SARM1可能對胚胎神經(jīng)元的先天免疫反應(yīng)產(chǎn)生負調(diào)節(jié)作用，然而SARM1對于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響尚未可知。而更為令人感興趣的是，人類SARM1基因位于染色體17q11（17：26 698 987-26 728 065），該染色體位于自閉癥易感性基因座6（Auts6，OMIM% 609378，17：24 000 000-31 800 000）中。其次，自閉癥患者的額皮質(zhì)中SARM1蛋白水平降低[8]。最后，SARM1基因敲除小鼠的行為分析還顯示出智力殘疾，社交行為受損和認(rèn)知僵化[11]，這些行為缺陷類似于自閉癥患者的特征。由此，盡管我們在初步的行為學(xué)測試如曠場實驗和高架迷宮中沒有看到顯著的表型，但在未來的研究計劃中我們將對SARM1條件敲除小鼠的學(xué)習(xí)記憶、社交行為、對抑郁模型的敏感性等行為表現(xiàn)進行深入地探索。另一方面，我們已經(jīng)知道，當(dāng)軸突發(fā)生損傷后，SARM1蛋白的多個TIR結(jié)構(gòu)域進行關(guān)聯(lián)，啟動下游信號[12-13]， TIR二聚體的形成觸發(fā)了NAD+的快速分解[5]，從而導(dǎo)致軸突中ATP的消耗和軸突中瓦勒變性的發(fā)生[14]。 由此我們猜測SARM1的缺失可能會帶來一定程度的神經(jīng)保護作用，因此SARM1基因的條件敲除對于神經(jīng)退行性疾病比如阿爾茨海默病、脊髓側(cè)索硬化癥、多發(fā)性硬化癥以及神經(jīng)損傷性疾病如腦缺血、脊髓損傷等都有可能產(chǎn)生保護作用，從而為此類疾病的治療提供潛在的藥物靶點。

總而言之，盡管我們在最初的探索中并沒有得到非常顯著的表型，但我們有理由相信敲除小鼠的培育可能為研究SARM1在多種精神神經(jīng)疾病中的作用提供一個有效的工具。