基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析附子理中湯治療晚期胃癌的作用機制

丁以絢 趙桂梅 李麗華 劉洋

1.云南省中醫(yī)醫(yī)院 昆明 650021 2.云南省第一人民醫(yī)院 3.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗中心

胃癌是一種起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，是死亡率最高的癌癥之一。目前，手術(shù)是胃癌最有效的治療手段，晚期胃癌則需在手術(shù)基礎(chǔ)上聯(lián)合化療、放療及靶向藥物治療等常見的輔助治療方案，但胃癌術(shù)后仍有較高的復(fù)發(fā)率與轉(zhuǎn)移率，因此尋找抗癌效果較好的輔助治療藥物對晚期胃癌的治療具有重要意義。隨著中醫(yī)藥的發(fā)展與完善，中藥復(fù)方治療腫瘤得到了越來越多的肯定。近年研究認為，將中藥復(fù)方應(yīng)用于腫瘤的手術(shù)及化放療過程中，對提高療效具有一定的現(xiàn)實意義，尤其是對中晚期惡性腫瘤患者而言，有可能提高5%～15%的療效[1-3]。

附子理中湯是由多味中藥組成的中藥復(fù)方，主要包含甘草、附子、人參、干姜和白術(shù)五種中藥成分，其中甘草能補脾益氣，附子可溫脾陽、補腎陽心陽，人參能補元氣，干姜可溫中散寒，白術(shù)可燥濕利水、健脾益氣[4]。研究表明，附子理中湯具有提高晚期胃癌患者免疫力、減輕放化療所致的不良反應(yīng)、降低患者體內(nèi)幽門螺桿菌數(shù)量、緩解胃部疼痛、促進胃潰瘍愈合以及提升患者生存質(zhì)量等多種功效[5-8]。

目前有關(guān)中藥復(fù)方治療癌癥的研究，多數(shù)為細胞或動物實驗，往往因為中藥成分的復(fù)雜性而影響研究結(jié)果的客觀性與準確性[9]。因此，亟需探究新的理論與方法對中藥復(fù)方預(yù)防或治療癌癥的效果進行研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)主要利用生物大數(shù)據(jù)庫分析藥物與疾病之間的聯(lián)系，是分析中藥復(fù)方與疾病之間關(guān)系的有力工具[10]。因此，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對附子理中湯治療晚期胃癌的靶點及作用機制進行探討。

1 材料和方法

1.1 附子理中湯生物活性成分作用靶點篩選 通過藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫、中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database，TCMSP）（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）對“附子、人參、干姜、甘草、白術(shù)”等中藥所含活性成分進行檢索，篩選條件設(shè)置為：類藥性（drug likeness，DL）≥0.18，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%[11]。篩選其中活性較高的化合物，以獲取附子理中湯的潛在作用靶點。

1.2 晚期胃癌的相關(guān)靶點篩選 通過人類基因綜合數(shù)據(jù)庫（Human Gene Comprehensive Database，GeneCards）、人類孟德爾遺傳在線（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）數(shù)據(jù)庫、遺傳關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫（Genetic Association Database，GAD）對晚期胃癌的英文名稱“advanced gastric cancer”進行檢索，設(shè)定篩選標準為relevance score＞10，即可得到以上3個數(shù)據(jù)庫中晚期胃癌的疾病靶點[12]。

1.3 韋恩分析尋找共同靶點 利用韋恩在線分析平臺Draw Venn Diagram對GeneCards、OMIM和GAD數(shù)據(jù)庫中晚期胃癌的疾病靶點進行進一步分析。將附子理中湯活性成分的靶點與晚期胃癌的疾病靶點進行映射，獲取藥物-疾病的共同靶點，這些靶點可能是附子理中湯治療晚期胃癌的關(guān)鍵靶點。

1.4 蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將上一步獲得的藥物-疾病共同靶點導(dǎo)入STRING10.5數(shù)據(jù)庫，進行PPI分析。設(shè)定interaction score閾值為“0.900”，限定物種為Homo sapiens，運用Cytoscape 3.5.1軟件，構(gòu)建附子理中湯-靶點-疾病的PPI網(wǎng)絡(luò)圖[13-14]。

1.5 基因本體（gene ontology，GO）生物學(xué)功能分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析 利用生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫DAVID在線分析網(wǎng)站（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp），以P＜0.05作為篩選條件，得到藥物-疾病相關(guān)交集靶點蛋白的GO生物學(xué)功能分析結(jié)果和KEGG通路富集分析結(jié)果。

1.6 分子對接 使用AutoDock 4.2軟件對附子理中湯和藥物-疾病共同靶點網(wǎng)絡(luò)結(jié)果前10位的活性成分以及PPI網(wǎng)絡(luò)排名前10位的核心靶點進行分子對接，使用分子可視化工具PyMol對其對接結(jié)果進行處理，利用打分函數(shù)Total-Score評價對接結(jié)果，設(shè)定Total-Score閾值為“6”[15]，篩選出結(jié)合活性較好的蛋白受體以及活性成分。

2 結(jié)果

2.1 附子理中湯活性成分與藥物靶點篩選 從附子理中湯甘草、附子、干姜、人參、白術(shù)中分別篩選出不同種類的化學(xué)成分，去除重復(fù)后最終獲得132種活性成分，列表上傳到Pharm Mapper平臺[16]，在返回的藥物靶點中將非人源靶點及重復(fù)靶點剔除，最終得出潛在靶點蛋白共306個。見表1。

表1 附子理中湯活性成分數(shù)目與對應(yīng)藥物靶點數(shù)目Tab.1 The number of active ingredients of Fuzi Lizhong Decoction and the number of corresponding drug targets

2.2 不同數(shù)據(jù)庫中胃癌的共同作用靶點篩選 通過GeneCards、OMIM、GAD三個數(shù)據(jù)庫進行篩選，分別獲取24 861、28 703、19 765個靶點，利用韋恩圖取交集得到18 784個靶點。見圖1。進一步分析胃癌相關(guān)靶點（18 784個）與附子理中湯化學(xué)成分相關(guān)靶點（306個）的相互交集，最終得出藥物與疾病共同靶點287個。見圖2。

圖1 晚期胃癌交集靶點韋恩圖Fig.1 Venn diagrams of the intersection targets of advanced gastric cancer

圖2 附子理中湯藥物與晚期胃癌交集靶點韋恩圖Fig.2 Venn diagrams of the target of Fuzi Lizhong Decoction and advanced gastric cancer

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 PPI網(wǎng)絡(luò)由36個節(jié)點和212條邊構(gòu)成，其中有18個靶點與其他靶點無交集。在該網(wǎng)絡(luò)中，每條邊代表靶點之間的靶向相互作用關(guān)系[17-18]。該網(wǎng)絡(luò)中起主導(dǎo)作用的前10個靶點，包括表皮細胞生長因子（epidermal growth factor，EGF）、巨噬細胞移動抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）、微管相關(guān)蛋白輕鏈3A/B（microtubule-associated protein light chain 3A/B，LC3A/B）、重組人自體吞噬相關(guān)蛋白5（recombinant autophagy related protein 5，ATG5）、腫瘤相關(guān)蛋白53（tumor protein p53，p53）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）、信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、細胞周期素依賴性激酶抑制因子1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）、B細胞淋巴瘤-2樣蛋白1（B-cell lymphoma-2 like 1，Bcl-2L1）。見圖3。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network diagram

2.4 附子理中湯治療晚期胃癌靶點的富集分析 進一步分析附子理中湯用于胃癌治療的287個候選靶點的潛在機制，對候選靶點以DAVID在線軟件進行GO生物學(xué)功能分析和KEGG通路富集分析。根據(jù)P＜0.05的條件，共獲取980個GO條目，其中生物過程（biological process，BP）862個，細胞組分（cellular component，CC）29個，分子功能（molecular function，MF）89個。GO富集分析結(jié)果根據(jù)-logP值大小選取排名前10位的條目繪制。見圖4。BP中主要包括細胞基質(zhì)黏附、細胞代謝調(diào)節(jié)、基因正向表達，MF中主要包括DNA結(jié)合活性、核激素受體結(jié)合及L-乳酸脫氫酶活性等，CC中則主要包括細胞外空間、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、細胞器膜等。

圖4 附子理中湯治療晚期胃癌靶點的富集分析Fig.4 Enrichment analysis of Fuzi Lizhong Decoction in the treatment of advanced gastric cancer targets

對287個候選靶點參與的生物代謝途徑KEGG通路進行分析，根據(jù)P＜0.05篩選出了65條附子理中湯治療晚期胃癌的潛在信號通路。與GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索到的胃癌晚期相關(guān)信號通路比對，得到56條附子理中湯-胃癌潛在通路。選擇附子理中湯主要影響的20條生物途徑進行圖像繪制，KEGG結(jié)果提示附子理中湯治療晚期胃癌的機制主要與p53信號通路（p53 signaling pathway）、2-氧羧酸代謝信號通路（2-Oxocarboxylic acid metabolism signaling pathway）和Wnt信號通路（Wnt signaling pathway）有關(guān)。見圖5。

圖5 附子理中湯治療晚期胃癌靶點的KEGG富集通路Fig.5 KEGG enrichment pathway of Fuzi Lizhong Decoction in the treatment of advanced gastric cancer targets

2.5 分子對接 選取Cytoscape中相互作用的10個關(guān)鍵節(jié)點EGF、MIF、LC3A、LC3B、CDKN1A、ATG5、p53、AKT1、STAT3、BCL2L1，將蛋白分子及配體分子信息文件導(dǎo)入AutoDock Tools，通過運行AutoDock Vina進行對接，最后基于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank，PDB）與SystemsDock網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫（SystemsDock Web Site Database，SWSD）進行受體與配體復(fù)合物的預(yù)測，獲得分子對接相關(guān)信息。見表2。

表2 附子理中湯對晚期胃癌作用靶點分子對接結(jié)果Tab.2 Docking results of Fuzi Lizhong Decoction on target of advanced gastric cancer

在研究中，通常將Total-Score值=6作為閾值篩選結(jié)合活性較好的蛋白受體與活性成分，當(dāng)對接分數(shù)越高時，表示結(jié)合活性越強。對接結(jié)果顯示，p53、MIF、STAT3、CDKN1A、LC3B與化合物Sunitinib_CID_5329102對接分數(shù)均大于7.0，其中p53、MIF、STAT3與化合物對接分數(shù)均大于8.0，具有強烈的結(jié)合活性?；衔颯unitinib_CID_5329102的中文名稱為舒尼替尼，分子式為C26H31FN4O6，是一種多靶點的生物靶向抗腫瘤藥物，能同時抑制多條信號傳導(dǎo)通路，具有抗腫瘤和抗血管生成作用，因此推測p53、MIF、STAT3在附子理中湯治療晚期胃癌中起到關(guān)鍵性作用。

3 討論

中醫(yī)認為，胃癌是由于正氣內(nèi)虛、飲食不潔等諸多因素共同引起的疾病，而晚期胃癌多為胃部疾病緩慢發(fā)展而致[19-20]。附子理中湯歷來是治療胃疾的良方，相關(guān)研究指出，附子理中湯具有補脾益氣、溫中散寒、燥濕利水的效果，可改善消化吸收功能，促進糖和脂類代謝[21]。對于脾胃虛寒的胃癌患者，在化療基礎(chǔ)上聯(lián)合附子理中湯輔助治療，能夠起到增強免疫力以及增效減毒的作用[22]。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)與生物大數(shù)據(jù)庫，共獲取附子理中湯所含有的132種潛在化學(xué)活性成分及與活性成分密切相關(guān)的287個胃癌靶點，證實中藥治療疾病具有多成分、多靶點的特點。本研究中附子理中湯與胃癌相互作用的關(guān)鍵節(jié)點主要有EGF、MIF、LC3A、LC3B、CDKN1A、ATG5、p53、AKT1、STAT3、BCL-2L1等，主要信號通路分別是p53信號通路、2-氧羧酸代謝信號通路和Wnt信號通路。其中，p53信號通路在氧化應(yīng)激、DNA損傷等多個應(yīng)激信號的共同誘導(dǎo)下被激活，p53作為信號通路中的關(guān)鍵蛋白，可導(dǎo)致細胞周期停滯或細胞凋亡[23-25]。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌晚期的重要特征之一就是細胞增殖失控，這表明調(diào)節(jié)細胞周期的分子機制與腫瘤發(fā)展具有密切聯(lián)系[26-27]。另有研究表明，胃癌晚期患者預(yù)后與體內(nèi)代謝途徑失調(diào)相關(guān)[28]，附子理中湯可能通過2-氧羧酸代謝信號通路或p53信號通路調(diào)節(jié)晚期胃癌患者的細胞代謝情況。

除以上兩條關(guān)系密切的信號通路外，KEGG通路富集分析中排名靠前的還有Wnt信號通路。Wnt蛋白家族是一個富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白家族，Wnt信號通路的幾個組成部分均與人類癌癥的發(fā)生有關(guān)。在經(jīng)典的Wnt信號通路中，Wnt配體主要通過抑制β-連環(huán)蛋白（β-catenin）降解復(fù)合體來穩(wěn)定細胞質(zhì)中的β-catenin水平[29-31]。本研究顯示，附子理中湯中有效成分的靶點蛋白富集在Wnt信號通路，結(jié)果提示附子理中湯可能通過Wnt信號通路參與晚期胃癌的調(diào)控，Wnt信號通路可以作為晚期胃癌的治療靶點。

MIF是在炎癥反應(yīng)和免疫介導(dǎo)疾病過程中具有關(guān)鍵作用的趨化因子。研究發(fā)現(xiàn)，MIF具有羥苯丙酮酸互變異構(gòu)酶活性，還具有多巴色素互變異構(gòu)酶活性，高表達的MIF能夠抵消糖皮質(zhì)激素的抗炎活性，能對細菌病原體的先天免疫應(yīng)答起一定作用[32-33]。在癌癥組織部位常常發(fā)生炎癥浸潤現(xiàn)象，而長期炎癥積累是促進局部癌變的誘導(dǎo)因子。研究提示MIF在炎癥部位高表達，可促進巨噬細胞在炎癥局部的浸潤、增殖及激活[33]。MIF一方面直接參與腫瘤細胞的調(diào)節(jié)，另一方面通過炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)及腫瘤微環(huán)境等間接參與腫瘤相關(guān)疾病的發(fā)展進程[34]。本研究提示MIF是附子理中湯與胃癌相互作用的關(guān)鍵節(jié)點之一，也可以作為晚期胃癌的治療靶點。

STAT3表達水平與胃癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性一直是臨床研究的熱點。相關(guān)研究表明，STAT家族中的STAT3在多種惡性腫瘤中發(fā)揮了致癌作用[35]，因此提高STAT3的表達可能是一種可行的干預(yù)治療途徑，但STAT3的過度表達則會加快胃癌細胞的增殖及轉(zhuǎn)移[35-36]。本研究發(fā)現(xiàn)附子理中湯可能通過調(diào)節(jié)STAT3表達，對胃癌起到一定的治療作用，但是針對STAT3表達豐度的影響還需進一步研究。

附子理中湯治療晚期胃癌中具有多組分、多靶點、多途徑調(diào)控等特點，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，指明了附子理中湯治療晚期胃癌的作用靶點，并通過模擬分子對接得出p53、MIF、STAT3是附子理中湯作用的關(guān)鍵節(jié)點，該結(jié)果為后續(xù)進一步的動物或細胞實驗指明了方向。