莪術(shù)醇下調(diào)FoxD2-AS1逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤細胞替莫唑胺化療耐藥的作用研究

浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 杭州 310053

膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）原發(fā)性惡性腫瘤之一，約占所有顱內(nèi)腫瘤的40%[1]。目前臨床上普遍采用腫瘤切除和輔助放化療的治療方案。替莫唑胺（Temozolomide，TMZ）是公認的治療膠質(zhì)瘤的一線化療藥物，但有相當一部分患者會對TMZ表現(xiàn)出不同程度的原發(fā)性和獲得性耐藥，最終導(dǎo)致化療失敗[2]。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是長度大于200nt的非編碼RNA，又稱長非編碼RNA。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在癌癥的多種生物學(xué)行為中扮演重要角色，能夠影響癌癥的發(fā)展和走向[3-4]。近年來研究證實，部分lncRNA與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，可發(fā)揮抑癌基因的作用[5]；還有一些lncRNA的表達與膠質(zhì)瘤的化療耐藥及預(yù)后密切相關(guān)[6-7]。相關(guān)研究已證實，lncRNA FoxD2-AS1基因參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展，以O(shè)6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（methylation ofO6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）依賴的方式促進膠質(zhì)瘤TMZ耐藥，可作為膠質(zhì)瘤的預(yù)后因子[8]。

近年來，中藥因其不良反應(yīng)小、療效明確的優(yōu)點備受關(guān)注。莪術(shù)醇（curcumol）是中藥莪術(shù)揮發(fā)油中提取的有效單體成分，具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗病毒等功效[9-10]。研究證實，莪術(shù)醇能夠顯著抑制膠質(zhì)瘤細胞生長并促進凋亡[11]。

基于此，本研究在體外培養(yǎng)膠質(zhì)瘤耐藥細胞A172/TMZ和U251/TMZ，探究lncRNA FoxD2-AS1在膠質(zhì)瘤細胞TMZ耐藥過程中的作用，并檢測不同濃度莪術(shù)醇對耐藥細胞內(nèi)FoxD2-AS1含量的影響，探究莪術(shù)醇與膠質(zhì)瘤TMZ耐藥以及FoxD2-AS1表達的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株和短片斷干擾RNA（small interfering RNA，siRNA） 人腦膠質(zhì)瘤細胞系U251、A172均購于美國模式培養(yǎng)物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）。si-FOXD2-AS1由百奧生物技術(shù)有限公司合成，siRNA序列：上游5′-GCGAAGAGUACGUUGCUAUTT-3′，下 游5′-AUAGCAACG UACUCUUCGCTT-3′。

1.1.2 主要試劑 替莫唑胺、莪術(shù)醇均購于安諾倫生物科技有限公司（貨號：HY-17364/CS-0943、HYN0104）；Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen公司（批號：2067406）；噻唑藍（3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT） 粉購于Sigma公司（批號：11465007001）；達爾伯克改良伊格爾高糖培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle medium-high glucose，DMEM-HG）購于天津市灝洋生物制品科技有限公司（批號：TBD10569）；新生小牛血清購于浙江天杭生物科技股份有限公司（批號：20170106）；青-鏈霉素溶液購于吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司（批號：1812110207）；4%多聚甲醛購于廣州賽國生物科技有限公司（批號：1807213）；TRIzol試劑購于美國Thermo Fisher公司（批號：135404）；異丙醇購于上海麥克林生化科技有限公司（批號：M54318067）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于TaKaRa公司（批號：A4301-1）；RNaseA、UltraSYBR Mixture均購于北京康為世紀生物科技有限公司（批號：50423、30237）；細胞凋亡與壞死檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司（批號：C1056）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購于湖北盛齊安生物科技股份有限公司（批號：1129E036）。

1.1.3 主要儀器 TE2000熒光倒置顯微鏡為Nikon公司產(chǎn)品；5541R高速冷凍離心機購于德國Eppendorf公司；SW-CJ-2FD雙人單面垂直凈化工作臺購于蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱、流式細胞儀、熒光定量PCR儀、金屬浴均購于美國Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)庫和生物信息學(xué)分析 對來自癌癥和腫瘤基因組圖譜（cancer genome atlas，TCGA）和中國腦膠質(zhì)瘤基因組圖譜（Chinese glioma genome atlas，CGGA）的膠質(zhì)瘤基因表達數(shù)據(jù)進行生物信息學(xué)分析，比較FoxD2-AS1在正常膠質(zhì)細胞與膠質(zhì)瘤組織中的表達量。采用Kaplan-Meier法計算生存率，以logrank檢驗生存率差異。

1.2.2 耐藥細胞系的建立 經(jīng)脈沖加藥建立A171/TMZ、U251/TMZ耐藥細胞系，構(gòu)建方式采用經(jīng)典的間歇誘導(dǎo)法[12]，以MTT法分別檢測U251/TMZ、A172/TMZ及其母本細胞對TMZ的耐藥程度，計算TMZ對各細胞系的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）。

1.2.3 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 分別用無血清無雙抗培養(yǎng)基稀釋脂質(zhì)體和siRNA，輕輕混勻并室溫孵育20min后，將混合物加入耐藥細胞的培養(yǎng)孔中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6h后，將培養(yǎng)基換為正常DMEM培養(yǎng)基，將該組別設(shè)置為siRNA干擾組。另設(shè)置轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA的陰性對照組作為對照。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（Real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測轉(zhuǎn)染效率 實驗分為陰性對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA）、siRNA干擾組（轉(zhuǎn)染FoxD2-AS1基因siRNA）。使用TRIzol提取RNA，檢測RNA純度后，進行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA產(chǎn)物。根據(jù)試劑盒說明書進行RT-qPCR反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)參，測定lncRNA FoxD2-AS1在膠質(zhì)瘤耐藥細胞中的表達水平。反應(yīng)體系如下：cDNA 1μL，2×UltraSYBR Mixture 12.5μL，正反向引物各1μL，ddH2O 9.5μL，總計50μL。反應(yīng)條件如下：95°C預(yù)變 性 10min；95°C 15s，60°C 1min，35個循環(huán)；95°C 15s，60°C 1min，95°C 15s，60°C 15s。采用2-△△Ct法計算FoxD2-AS1表達水平。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集siRNA干擾組和陰性對照組細胞，以5×104個細胞/孔的數(shù)量接種于24孔板，分別以0、20、40mg·mL-1的TMZ處理48h。胰酶消化后收集細胞，分別加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）/Annexin Ⅴ，室溫避光染色15min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞周期 收集處于對數(shù)生長期的耐藥細胞，加入預(yù)冷的70%乙醇，4°C固定過夜，棄去上清液，以磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌2次，離心5min，棄去上清液。每管細胞樣品分別加入染色緩沖液500μL、1mg·mL-1的RNaseA溶液7.5μL和PI染液3μL后，避光37°C金屬浴30min，上機檢測A172/TMZ和U251/TMZ耐藥細胞的細胞周期分布。

1.2.7 藥物相互作用分析 取對數(shù)生長期的兩種耐藥細胞，調(diào)整細胞密度為5×104個/mL，吸取100μL細胞至96孔板中，培養(yǎng)6h后，計算TMZ和莪術(shù)醇的IC50值，得出TMZ的IC50是69μg·mL-1，莪術(shù)醇的IC50是89μg·mL-1，TMZ和莪術(shù)醇的濃度設(shè)置均為其IC50的0、1/8、1/4、1/2、1。固定TMZ的濃度為0、8.625、17.25、34.5、69μg·mL-1，分別與不同濃度的莪術(shù)醇組合處理耐藥細胞，每組分別進行3次實驗并取平均值，確定量效曲線。采用相互作用指數(shù)（combination index，CI）來判斷兩藥聯(lián)用效果，CI=莪術(shù)醇在混合藥物中的IC50/莪術(shù)醇單獨IC50+TMZ在混合藥物中的IC50/TMZ單獨IC50。若CI＞1則說明兩藥拮抗，若CI=1說明兩藥相加，若CI＜1則說明兩藥有協(xié)同作用。

1.2.8 Hoechst染色觀察不同濃度莪術(shù)醇和TMZ對兩種耐藥細胞形態(tài)的影響 研究共分6組：A組（空白對照組）為不加藥的耐藥細胞；B組為10μg·mL-1莪術(shù)醇組；C組為40μg·mL-1莪術(shù)醇組；D組為40μg·mL-1TMZ組；E組為10μg·mL-1莪術(shù)醇和40μg·mL-1TMZ組；F組為40μg·mL-1莪術(shù)醇和40μg·mL-1TMZ組。吸盡培養(yǎng)基，加0.5mL固定液固定20min。PBS洗滌2～3次，加入染色液300μL/孔，染色15min，PBS洗滌2～3次，最后在紫外線（ultraviolet，UV）下鏡檢觀察。

1.2.9 RT-qPCR測定莪術(shù)醇對耐藥細胞的FoxD2-AS1含量的影響 研究分為6組：不加莪術(shù)醇的兩種膠質(zhì)瘤耐藥細胞作為對照組；不同濃度莪術(shù)醇（20、40μg·mL-1）分別處理的U251/TMZ和A172/TMZ耐藥細胞，處理24、48、72h后，收集細胞，進行總RNA提取和cDNA合成，根據(jù)RT-qPCR試劑盒說明書進行PCR反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)參，以PCR儀進行定量分析，方法同1.2.4。采用2-△△Ct法計算FoxD2-AS1表達水平。將PCR結(jié)果中2-ΔΔCt值＞2的組別設(shè)為FoxD2-AS1高表達組，而2-ΔΔCt值≤2為非FoxD2-AS1高表達組。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件和Graph-Pad Prism 8.0繪圖軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FoxD2-AS1基因表達與患者預(yù)后的關(guān)系 通過GraphPad Prism軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，與正常膠質(zhì)細胞比較，F(xiàn)oxD2-AS1在低級別膠質(zhì)瘤組織中高表達（P＜0.01），在多形惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中極高表達（P＜0.001）；與低級別膠質(zhì)瘤比較，F(xiàn)oxD2-AS1在多形惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中高表達（P＜0.01）。CGGA庫數(shù)據(jù)分析顯示，多形惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤FoxD2-AS1表達量顯著高于低級別膠質(zhì)瘤（P＜0.001）和血管中心型膠質(zhì)瘤（P＜0.01）。見圖1A和B。

CGGA數(shù)據(jù)進一步分析顯示，F(xiàn)oxD2-AS1表達量高的患者總生存率低，F(xiàn)oxD2-AS1表達量低的患者生存率較高。見圖1C。RT-qPCR結(jié)果表明，膠質(zhì)瘤細胞中FoxD2-AS1的表達量均高于正常膠質(zhì)細胞（P＜0.05，P＜0.01），且耐藥細胞中FoxD2-AS1的表達量顯著高于母本細胞（P＜0.05，P＜0.01）。見圖1D。以上結(jié)果提示，F(xiàn)oxD2-AS1的表達與膠質(zhì)瘤發(fā)病及患者預(yù)后密切相關(guān)。

圖1 FoxD2-AS1與膠質(zhì)瘤的關(guān)系Fig.1 Relationship between FoxD2-AS1 and glioma

2.2 FoxD2-AS1的表達對膠質(zhì)瘤細胞TMZ耐藥的影響 與同種細胞的陰性對照組比較，20、40μg·mL-1的TMZ誘導(dǎo)后，siRNA干擾組細胞的凋亡率顯著提高（P＜0.05，P＜0.01）。見表1。暗示FoxD2-AS1的表達與膠質(zhì)瘤細胞TMZ耐藥相關(guān)。

表1 FoxD2-AS1表達對A172/TMZ和U251/TMZ耐藥細胞凋亡的影響（±s，%）Tab.1 Expression of FoxD2-AS1 on apoptosis of A172/TMZ and U251/TMZ cells（±s，%）

表1 FoxD2-AS1表達對A172/TMZ和U251/TMZ耐藥細胞凋亡的影響（±s，%）Tab.1 Expression of FoxD2-AS1 on apoptosis of A172/TMZ and U251/TMZ cells（±s，%）

注：與A172/TMZ細胞陰性對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與U251/TMZ細胞陰性對照組比較，△P＜0.05Note:Compared with negative control group of A172/TMZ cells，*P＜0.05，**P＜0.01;compared with negative control group of U251/TMZ cells，△P＜0.05

A172/TMZ細胞TMZ 濃度（μg·mL-1）U251/TMZ細胞陰性對照組 siRNA干擾組 陰性對照組 siRNA干擾組0 5.71±0.98 5.58±0.92 5.03±0.97 4.01±1.09△20 7.30±0.48 18.00±2.36* 9.75±1.40 12.71±1.07△40 12.77±1.54 25.20±1.47** 17.54±1.54 20.42±1.01△

A172/TMZ和U251/TMZ細胞siRNA干擾組處于G0/G1期的細胞比例均低于相應(yīng)的陰性對照組，而處于S期和G2/M期的細胞比例明顯高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。見圖2。

圖2 A172/TMZ、U251/TMZ陰性對照組和siRNA干擾組細胞周期比較Fig.2 Comparison of cell cycle of A172/TMZ and U251/TMZ cell in negative control group and siRNA interference group

2.3 莪術(shù)醇逆轉(zhuǎn)膠質(zhì)瘤TMZ化療耐藥 聯(lián)合實驗結(jié)果表明，莪術(shù)醇在0～90μg·mL-1、TMZ在0～69μg·mL-1的劑量范圍內(nèi)，TMZ與莪術(shù)醇合用能顯著抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系，兩種細胞均有類似現(xiàn)象可初步確定莪術(shù)醇和TMZ具有協(xié)同作用，提示莪術(shù)醇對TMZ耐藥的逆轉(zhuǎn)作用。見圖3。

圖3 莪術(shù)醇和TMZ聯(lián)用的效價圖Fig.3 The titer chart of curcumol in conjunction with TMZ

空白對照組細胞經(jīng)Hoechst染色發(fā)出均勻的淡藍色熒光，細胞核無明顯的凋亡形態(tài)學(xué)變化；用莪術(shù)醇處理細胞，可見細胞密度減少，核染色質(zhì)濃縮聚集、核破碎、核邊集，隨著莪術(shù)醇濃度增加而更加明顯。同時發(fā)現(xiàn)40μg·mL-1莪術(shù)醇+40μg·mL-1TMZ組效果最明顯，可見細胞核發(fā)出較強的藍色熒光，內(nèi)部呈亮白色，表現(xiàn)出細胞凋亡核固縮的典型變化。見圖4。

圖4 不同濃度藥物及聯(lián)合作用下對A172/TMZ細胞凋亡的影響（Hoechst染色，200×）Fig.4 Effects of different concentrations of drugs and combined uses on A172/TMZ cell apoptosis（Hoechst staining，200×）

2.4 莪術(shù)醇對FoxD2-AS1表達的影響 RT-qPCR結(jié)果顯示，在同一時間段里隨著莪術(shù)醇濃度的升高，F(xiàn)oxD2-AS1的相對表達量下降，下降程度呈明顯劑量依賴性（P＜0.05，P＜0.01）；在同一濃度莪術(shù)醇作用下，與培養(yǎng)24h比較，培養(yǎng)48h和72h的細胞FoxD2-AS1的相對表達量下降程度更明顯（P＜0.05，P＜0.01）。見圖5。結(jié)果表明莪術(shù)醇能夠抑制膠質(zhì)瘤A172/TMZ和U251/TMZ耐藥細胞中FoxD2-AS1的表達，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性，并與作用時間呈正相關(guān)性。

圖5 莪術(shù)醇處理后耐藥細胞內(nèi)FoxD2-AS1含量的變化Fig.5 Changes of FoxD2-AS1 content in resistant cells treated with curcumol

3 討論

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的原發(fā)性惡性腫瘤，其發(fā)病率、致死率均位于顱內(nèi)腫瘤榜首，患者預(yù)后極差[13]。在膠質(zhì)瘤的臨床治療過程中，TMZ是公認的一線藥物，然而TMZ耐藥極大限制了其治療膠質(zhì)瘤的療效。如何降低耐藥成為臨床治療亟待解決的問題。本研究通過生物信息學(xué)技術(shù)手段，發(fā)現(xiàn)FoxD2-AS1在多形惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達量較高，且高表達FoxD2-AS1的患者總生存率較低，暗示FoxD2-AS1參與不良預(yù)后。通過建立TMZ耐藥細胞系，本研究發(fā)現(xiàn)FoxD2-AS1在TMZ耐藥細胞中高表達，提示FoxD2-AS1的表達可能與膠質(zhì)瘤TMZ耐藥相關(guān)。

中藥是我國傳統(tǒng)文化的瑰寶，尋找新型、高效、低毒的中藥將成為提高腫瘤治療療效的突破口。中醫(yī)理論認為莪術(shù)味辛、苦，性溫，具有行氣破血、消積止痛的功效，而莪術(shù)醇作為莪術(shù)揮發(fā)油中提取的成分，具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗腫瘤等生物活性，且能夠?qū)δz質(zhì)瘤細胞增殖起到抑制作用[14-15]。

而隨著高通量技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的研究證實lncRNA可以在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、表觀遺傳等方面發(fā)揮重要的生物學(xué)功能，如Gu等[16]報道沉默lncRNA FoxD2-AS1可以通過microRNA-98-5p/胞質(zhì)聚腺苷化元件結(jié)合蛋白4（cytoplasmic polyadenylation element bindingprotein 4，CPEB4）軸促進膠質(zhì)瘤耐藥細胞的凋亡。然而FoxD2-AS1與膠質(zhì)瘤耐藥及莪術(shù)醇之間的關(guān)系目前尚不明確。本實驗結(jié)果表明，干擾FoxD2-AS1后，耐藥細胞凋亡率增高，細胞周期主要停滯在S期和G2/M期，暗示FoxD2-AS1基因可能通過調(diào)控膠質(zhì)瘤細胞的周期和凋亡過程而參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展以及TMZ耐藥。大量研究表明，膠質(zhì)瘤TMZ耐藥是多分子參與的復(fù)雜過程[17]，目前研究較多的是DNA損傷修復(fù)、多藥耐藥、凋亡通路異常、膠質(zhì)瘤干細胞學(xué)說等[18]。而本研究的結(jié)果提示lncRNA也可能參與了TMZ的耐藥過程。

莪術(shù)醇是莪術(shù)油的抗腫瘤活性成分，在不同腫瘤中均已證實，莪術(shù)醇能夠抑制腫瘤細胞的增殖，還能夠通過激活抑癌基因或抑制原癌基因，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如通過第10號染色體缺失磷酸酶及張力蛋白同源基因/磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（gene of phosphatase and tension homology deleted on chromsometen/phosphatidylinositol3 kinase/protein kinase B，PTEN/PI3K/Akt）途徑降低腫瘤細胞中miR-21的含量，從而起到抑癌作用[19]。莪術(shù)醇還能夠阻滯細胞周期，抑制腫瘤細胞增殖，如研究證實莪術(shù)醇可以通過活性氧和蛋白激酶B/糖原合成酶激酶3β/細胞周期蛋白D1（protein kinase B/glycogen synthase kinase 3β/cyclin D1，Akt/GSK3β/cyclin D1）途徑誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞的細胞周期停滯[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)醇處理耐藥細胞后，耐藥細胞內(nèi)FoxD2-AS1的含量明顯下降，且具有濃度和時間依賴性，提示莪術(shù)醇可能通過抑制FoxD2-AS1的表達，從而提高膠質(zhì)瘤耐藥細胞對TMZ的敏感度。實驗證明，莪術(shù)醇能夠抑制不同腫瘤細胞中磷酸化Akt和磷酸化PI3K蛋白的表達[21]，由此筆者推測莪術(shù)醇也可能通過Akt/PI3K通路誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細胞凋亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)FoxD2-AS1與膠質(zhì)瘤細胞TMZ化療耐藥有關(guān)，干擾FoxD2-AS1后可以誘導(dǎo)耐藥細胞周期阻滯，促進細胞凋亡；莪術(shù)醇可通過下調(diào)耐藥細胞中FoxD2-AS1的含量來提高耐藥細胞對TMZ的敏感度。這一發(fā)現(xiàn)為膠質(zhì)瘤TMZ耐藥的臨床治療提供了新思路。