Hedgehog通路介導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化進(jìn)展

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 杭州 310006

肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化轉(zhuǎn)變的必經(jīng)階段[1]，其病理學(xué)基礎(chǔ)是活化的肌成纖維樣細(xì)胞（myofibroblastic-like cell，MFLC）增多，細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）大量沉積[2]。研究認(rèn)為，肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）的活化在肝纖維化過程中起著關(guān)鍵作用[2-3]。近年研究發(fā)現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）可能是肝纖維化的另外一條重要機(jī)制[4]。通過EMT，具有上皮表型的靜止期HSC、肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞以及竇狀內(nèi)皮細(xì)胞等可轉(zhuǎn)化成為具有間質(zhì)細(xì)胞表型的MFLC，并參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[5]。多種信號(hào)通路參與肝內(nèi)細(xì)胞EMT的分子調(diào)控，Hedgehog通路可以促進(jìn)肝臟祖細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞等從上皮表型向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)變，影響EMT的發(fā)生發(fā)展[6]，通過抑制Hedgehog信號(hào)通路阻斷或逆轉(zhuǎn)EMT可望成為肝纖維化治療的新靶點(diǎn)。本研究擬觀察四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）誘導(dǎo)肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中Hedgehog信號(hào)通路及EMT的變化，以進(jìn)一步加深對(duì)肝纖維化發(fā)病機(jī)制的理解，為肝纖維化的防治提供新的切入點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無特殊病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)雄性SD大鼠64只，7～8周齡，體質(zhì)量（140±10）g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016]，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心屏障環(huán)境[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)碼：SYXK（浙）2013-0184]，明暗各12h，溫度（25±1）℃，相對(duì)濕度60%～70%。所有大鼠均予普通顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始正式實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑 CCl4購于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司（批號(hào)：20140319）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）檢測(cè)試劑盒均購于上海申能-德賽診斷技術(shù)有限公司（批號(hào)：1412707020、14126070201、14104170202、14108170201）；羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）檢測(cè)試劑盒購于南京建成生物工程研究所（批號(hào)：A030-2）；TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、PrimeScriptTMRT Master Mix、SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ均購于寶生物工程（大連）有限公司（批號(hào)：AK1703、AI40832A、AK8902）；全蛋白提取試劑盒購于凱基生物技術(shù)有限公司（批號(hào) ：KGP2100）；BCA Protein Assay Kit、Potent ECL Kit、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、山羊抗小鼠二抗-辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、山羊抗兔二抗-HRP均購于聯(lián)科生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：70-PQ0011、70-P1421、70-Mab5465、70-GAM007、70-GAR007）；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）兔抗體、平滑受體（smoothened，Smo）兔抗體購于美國Abcam公司（批號(hào)：GR212262、GR237368-1）；上皮-鈣粘素（epithelial-cadherin，E-cadherin）（4A2） 小鼠抗體購于美國CST公司（批號(hào)：#14472）；神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白-1（glioma-associated oncogene homolog-1，Gli-1）（H-300）兔抗體購于美國Santa Cruz公司（批號(hào)：G2313）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 日立7020全自動(dòng)生化分析儀購于日立高新技術(shù)株式會(huì)社；ABI7900熒光定量PCR擴(kuò)增儀為美國ABI公司產(chǎn)品；Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀購于美國賽默飛公司；Alpha FCE化學(xué)成像系統(tǒng)購于美國Protein Simple公司。

1.4 分組及給藥 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常組和模型組，每組32只。模型組按3mL·kg-1的劑量皮下注射橄欖油稀釋的40% CCl4，2次/周，首次加倍；正常組以等容量的橄欖油皮下注射，2次/周。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 肝功能指標(biāo)檢測(cè) 造模第2、7、21、42天兩組各選擇8只大鼠，空腹麻醉后腹腔靜脈取血，分離血清，采用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清ALT、AST、ALP、TBIL水平。具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.2 肝組織炎癥和纖維化程度檢測(cè) 分離肝臟，部分固定于10%中性甲醛溶液，常規(guī)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色和Masson染色后，觀察肝組織病理形態(tài)學(xué)改變，參照王泰齡等[7]制訂的評(píng)分方案進(jìn)行肝組織炎癥和纖維化程度評(píng)分。

1.5.3 肝組織Hyp含量檢測(cè) 分離肝臟，部分放置于-80℃保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)當(dāng)天稱取濕重40～50mg的肝組織放入玻璃試管中，加入水解液0.5mL，混勻。以保鮮膜封口并扎緊，針頭刺一小孔后放入95℃水浴箱中20min，使肝組織充分水解。流水冷卻后調(diào)節(jié)pH值為6.0～6.8，加雙蒸水至5mL，混勻，取3mL稀釋的水解液加入約15mg活性炭，混勻后3 500r·min-1離心10min，以堿水法檢測(cè)肝組織Hyp含量，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.4 肝組織纖維化關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)檢測(cè) 以實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative Realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測(cè)肝臟α-SMA、E-cadherin、Smo、Gli-1的mRNA水平。所有引物均由寶生物工程（大連）有限公司設(shè)計(jì)并合成。見表1。采用10μL的PCR反應(yīng)體系：2×SYBR5μL、10ng·μL-1的 cDNA模板2μL、10μmol·L-1上下游引物各0.4μL、2.2μL的ddH2O，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行擴(kuò)增，以2-△△Ct法計(jì)算各目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5.5 肝組織纖維化關(guān)鍵蛋白表達(dá)檢測(cè) 提取肝組織總蛋白，蛋白定量后，每孔上樣量50μg，行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。電泳完畢進(jìn)行濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜，使用5%脫脂奶粉封閉，加入相應(yīng)一抗4℃孵育過夜[α-SMA（稀釋比例：1:1 000）、E-cadherin（稀釋比例：1:1 000）、Smo（稀釋比例：1:1 000）、Gli-1（稀釋比例：1:200）、GAPDH（稀釋比例：1:1 000）]。以含有Tween的Tris緩沖鹽溶液（Tris buffer solution and Tween，TBST）洗膜后加入相應(yīng)抗鼠或抗兔二抗（稀釋比例：1:5 000），室溫孵育1h。TBST洗膜后以化學(xué)發(fā)光法曝光，并分析灰度值，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值代表目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，行正態(tài)性檢驗(yàn)，使用對(duì)數(shù)變換等方法將非正態(tài)分布資料轉(zhuǎn)換成正態(tài)分布，組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL水平比較 正常組大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL水平各時(shí)點(diǎn)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；模型組大鼠血清上述指標(biāo)表達(dá)水平隨著造模時(shí)間的增加逐漸增高，21d時(shí)ALT水平較2d顯著增高（P＜0.05），AST和TBIL水平較2d、7d均顯著增高（P＜0.05，P＜0.01）； 在42d時(shí)上述各指標(biāo)較2、7、21d均顯著增高（P＜0.05，P＜0.01）。與正常組比較，2d時(shí)模型組上述各指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；7d時(shí)模型組AST、ALP、TBIL水平差異無統(tǒng)計(jì)意義（P＞0.05），ALT水平增高（P＜0.05）；21、42d各指標(biāo)均較正常組同期顯著增高（P＜0.05，P＜0.01）。見圖1。

圖1 兩組大鼠肝功能指標(biāo)比較Fig.1 Comparison of liver function index in each group

2.2 兩組大鼠肝臟組織病理學(xué)變化 正常組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)基本正常，肝細(xì)胞呈條索狀整齊排列，肝小葉形態(tài)完整，未見明顯肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞病變，中央靜脈和匯管區(qū)結(jié)構(gòu)正常，膠原著色僅見于血管壁。模型組大鼠2d時(shí)肝臟匯管區(qū)有炎細(xì)胞浸潤(rùn)及個(gè)別小葉內(nèi)壞死灶，少數(shù)肝細(xì)胞脂肪變；7d時(shí)匯管區(qū)炎癥及小葉內(nèi)壞死灶較2d時(shí)更明顯，脂肪變性肝細(xì)胞增多，個(gè)別大鼠中央靜脈周圍及竇周隙少量纖維沉積；至21d炎癥程度最明顯，多只大鼠出現(xiàn)中央靜脈周圍及竇周少量纖維沉積；42d時(shí)模型組大鼠炎癥活動(dòng)度較21d下降，但纖維化程度明顯加重，匯管區(qū)及壞死區(qū)纖維結(jié)締組織增生，形成細(xì)小的條索，呈星芒狀向肝小葉內(nèi)延伸，形成寬窄不一纖維間隔。見圖2。模型組各時(shí)點(diǎn)的炎癥活動(dòng)度評(píng)分均較正常組同期明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；模型組各時(shí)點(diǎn)之間比較，21d時(shí)較2、7d顯著增高（P＜0.01），42d與2d比較顯著增高（P＜0.05）。模型組纖維化程度評(píng)分除2d外，其他3個(gè)時(shí)點(diǎn)均較正常組同期明顯增高（P＜0.01）；模型組各時(shí)點(diǎn)之間比較，42d較2、7、21d顯著增高（P＜0.01）。見圖3。

圖2 大鼠肝纖維化形成過程中肝組織病理動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Pathological dynamics of liver tissue during the formation of fibrosis in rats

圖3 兩組大鼠肝組織炎癥活動(dòng)、纖維化程度評(píng)分及Hyp含量比較Fig.3 Comparison of liver tissue inflammation activity，fibrosis degree score and Hyp content in each group

2.3 兩組大鼠肝臟Hyp含量比較 正常組大鼠肝組織Hyp含量各時(shí)點(diǎn)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），模型組大鼠肝組織Hyp含量隨造模時(shí)間的增加而逐漸升高，其中42d時(shí)較2、7d顯著增高（P＜0.05）。與正常組比較，模型組21、42dHyp含量較正常組同期顯著增高（P＜0.01），2、7d與正常組同期比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

2.4 兩組大鼠Hedgehog通路及EMT關(guān)鍵基因表達(dá)比較 qRT-PCR檢測(cè)提示，正常組各時(shí)點(diǎn)肝臟E-cadherin、α-SMA、Smo、Gli-1的mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。模型組大鼠肝臟E-cadherin的mRNA表達(dá)水平隨造模時(shí)間的增加顯著降低，其中21、42d較2、7d顯著下降（P＜0.01）；而α-SMA、Smo、Gli-1的mRNA表達(dá)水平則隨造模時(shí)間的增加而逐漸增高，其中α-SMA的mRNA表達(dá)水平在21d時(shí)較2d顯著上調(diào)（P＜0.05），42d時(shí)較2、7、21d均顯著 上調(diào)（P＜0.01），Smo、Gli-1的mRNA表達(dá)水平在42d時(shí)較2、7、21d均顯著上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。模型組2d時(shí)上述各指標(biāo)與正常組同期比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），7、21、42d大鼠肝臟E-cadherin的mRNA表達(dá)水平均較正常組同期顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），模型組21、42d大鼠肝臟α-SMA和Gli-1的mRNA表達(dá)水平較正常組同期均顯著增高（P＜0.05，P＜0.01），42d大鼠肝臟Smo的mRNA表達(dá)水平較正常組同期均顯著增高（P＜0.01）。見圖4。

圖4 兩組大鼠肝臟E-cadherin、α-SMA、Smo、Gli-1的mRNA表達(dá)比較Fig.4 Comparison of mRNA expression of E-cadherin，α-SMA，Smo and Gli-1 in each group

2.5 兩組大鼠Hedgehog通路及EMT關(guān)鍵蛋白表達(dá)比較 Western blot檢測(cè)提示，各時(shí)點(diǎn)正常組肝臟E-cadherin、α-SMA、Smo、Gli-1的蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；模型組大鼠肝臟E-cadherin蛋白表達(dá)隨造模時(shí)間的增加而逐漸下降，42d顯著低于2、7、21d（P＜0.05，P＜0.01）；α-SMA、Smo、Gli-1蛋白表達(dá)隨造模時(shí)間的增加顯著增高，其中42d時(shí)α-SMA、Gli-1的蛋白表達(dá)水平顯著高于2、7、21d（P＜0.01），21d時(shí)顯著高于2、7d（P＜0.01），Smo的蛋白表達(dá)水平在21d和42d時(shí)均顯著高于2、7d（P＜0.05，P＜0.01）。與正常組同期比較，模型組21d和42d時(shí)肝臟E-cadherin均降低，而α-SMA、Smo、Gli-1水平均增高（P＜0.05，P＜0.01）。見圖5、6。

圖5 大鼠肝臟E-cadherin、α-SMA、Smo、Gli-1蛋白表達(dá)Fig.5 Protein expression of E-cadherin，α-SMA，Smo，Gli-1 in the liver of rats

圖6 兩組大鼠肝臟E-cadherin、α-SMA、Smo、Gli-1蛋白表達(dá)比較Fig.6 Comparison of protein expression of E-cadherin，α-SMA，Smo and Gli-1 in each group

3 討論

肝纖維化是各種慢性肝損傷持續(xù)性組織修復(fù)的結(jié)果，其特征是MFLC產(chǎn)生和ECM的過度沉積?；罨腍SC是MFLC的主要來源，而靜止期HSC、肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞等也可通過EMT途徑轉(zhuǎn)化為MFLC，參與膠原的形成和沉積，該過程在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[2-5，8]。

上皮細(xì)胞失去其上皮表型特征，而逐漸獲得間質(zhì)細(xì)胞表型特征的過程即為EMT[9]，發(fā)生EMT的上皮細(xì)胞主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞分子標(biāo)志如E-cadherin等的表達(dá)下降或喪失，以及一些間質(zhì)細(xì)胞分子標(biāo)志如α-SMA、波形蛋白等出現(xiàn)表達(dá)或表達(dá)增高[10-11]。研究報(bào)道，分離CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠原代肝細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其波形蛋白、Ⅰ型膠原表達(dá)上調(diào)[12]。Sicklick等[13]研究發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)小鼠的HSC可表達(dá)白蛋白、甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、肝細(xì)胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor 4α，HNF4α）等肝細(xì)胞功能基因，隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如α-SMA和Ⅰ型膠原表達(dá)逐漸上調(diào)，而肝細(xì)胞功能基因等表達(dá)明顯下調(diào)。研究還發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性膽汁性肝硬化和原發(fā)性硬化性膽管炎患者的膽管上皮細(xì)胞也同時(shí)表達(dá)上皮及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志如E-cadherin、波形蛋白等[14]。這些研究結(jié)果提示，在慢性肝損傷因素的刺激下，肝細(xì)胞、靜止期HSC、膽管細(xì)胞可能發(fā)生EMT，轉(zhuǎn)化為MFLC，該過程是肝纖維化發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)[15]。本研究采用CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型，結(jié)果提示隨著造模時(shí)間的增加，血清ALT、AST、ALP、TBIL水平以及肝組織勻漿Hyp含量逐漸增高，模型組2d時(shí)上述各項(xiàng)指標(biāo)與正常組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，7d時(shí)ALT水平較正常組同期明顯增高，21、42d時(shí)上述各項(xiàng)指標(biāo)均較正常組同期顯著增高。組織病理觀察發(fā)現(xiàn)，模型組肝組織炎癥活動(dòng)度評(píng)分逐漸增高，21d達(dá)到最高值，42d有下降趨勢(shì)，但仍維持在較高水平，各時(shí)點(diǎn)均較正常組同期明顯增高；模型組肝組織纖維化程度評(píng)分也隨造模時(shí)間的增加而增高，至42d達(dá)到最高值，除2d外其他3個(gè)時(shí)點(diǎn)均較正常組顯著增高。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)隨造模時(shí)間的增加而逐漸下降，而α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)則隨造模時(shí)間的增加而逐漸上升，21、42d時(shí)均高于正常組同期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果提示，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中，肝組織上皮細(xì)胞分子標(biāo)志物表達(dá)逐漸下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞分子標(biāo)志物表達(dá)逐漸增加，存在著EMT的持續(xù)過程。

EMT受轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、Hedgehog等多條信號(hào)通路調(diào)控[16-17]。Hedgehog信號(hào)通路由Hh配體和受體Patched（Ptc）、Smo組成的受體復(fù)合物及下游轉(zhuǎn)錄因子Gli家族（Gli1/2/3）等構(gòu)成[18]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)膽管結(jié)扎、CCl4等造成肝組織損傷后，靜止期HSC、肝祖細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞的Hedgehog信號(hào)通路被激活，Hh產(chǎn)生增多，細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)明顯下調(diào)，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)逐漸增加，最終轉(zhuǎn)化成為成熟的肌成纖維細(xì)胞[19-20]。研究證實(shí)，飲食誘導(dǎo)非酒精性脂肪性肝纖維化/肝硬化大鼠肝組織有Hedgehog信號(hào)通路的激活、Hh受體細(xì)胞的EMT等表現(xiàn)[21]。在HSC轉(zhuǎn)化為MFLC后，使用Smo抑制劑Cyclopamine抑制Hedgehog信號(hào)，從而能夠抑制間質(zhì)細(xì)胞分子標(biāo)記的基因表達(dá)，同時(shí)恢復(fù)上皮細(xì)胞分子標(biāo)記的基因表達(dá)[20]。對(duì)纖維化大鼠模型和細(xì)胞模型的研究都發(fā)現(xiàn)阻斷Hedgehog信號(hào)通路可以降低促纖維化細(xì)胞因子TGF-β1的表達(dá)，并能抑制ECM的沉積，抑制EMT進(jìn)程；而激活Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)途徑則會(huì)促進(jìn)EMT和腎小管間質(zhì)纖維化[22]。這些研究結(jié)果表明，Hedgehog信號(hào)通路通過參與EMT影響纖維化進(jìn)展，而各種肝損因素能夠促使肝內(nèi)HSC等上皮細(xì)胞活化，并激活Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)途徑，促使EMT沉積，最終導(dǎo)致肝纖維化。

綜上所述，本研究結(jié)果提示，CCl4誘導(dǎo)能夠成功建立肝纖維化大鼠模型，而且隨造模時(shí)間的增加，肝組織損傷加重、肝纖維化進(jìn)展，同時(shí)Hedgehog信號(hào)通路異常激活，Hedgehog信號(hào)通路可能通過介導(dǎo)EMT，從而促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展。通過抑制Hedgehog信號(hào)通路阻斷或逆轉(zhuǎn)EMT，可為肝纖維化的治療提供新的方向。