柴胡中柴胡皂苷c、a、d 含量測(cè)定方法的建立

盧麗香，周世友，曾海生，趙鳳仙，楊桂林，譚雨坪

（1.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧 530200）

柴胡始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，別名茈胡、地薰。中國(guó)藥典規(guī)定柴胡（Bupleurum ChinenseDC.）或狹葉柴胡（B.scorzonerifoliumWilld.）為正品，供藥用，二者一般習(xí)稱(chēng)為“北柴胡”及“南柴胡”［1］。藥用部分為柴胡的根或全草，具有解表和里、疏肝解郁、升提中氣之功效。主治感冒發(fā)熱、寒熱往來(lái)、黃疸肝炎及月經(jīng)不調(diào)等［2］。

柴胡主要有效成分為柴胡皂苷、揮發(fā)油、黃酮、脂肪酸等成分［3］。目前已經(jīng)從柴胡不同部位分離到柴胡皂苷（saikosaponins）a～d 等［4］。研究表明，柴胡皂苷具有解熱、鎮(zhèn)靜、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗肝纖維化、抗腫瘤等藥理活性［5］，柴胡皂苷a、d為其主要活性成分，并且柴胡皂苷 d 的藥理活性最強(qiáng)［6，7］。本研究采用高效液相色譜法，以蒸發(fā)光散射檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)柴胡藥材中柴胡皂苷c、a、d 進(jìn)行了含量測(cè)定，以建立測(cè)定柴胡根3 種皂苷含量的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 2695 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司，包含2489UV、四元泵、真空脫氣泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和Empower3 液相工作站）；Alltech ELSD 2000ES 型蒸發(fā)光檢測(cè)器、純水儀（法國(guó)Millipore 公司）；電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；TGL-16G 型高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)）；KQ5200V 型超聲清潔器（昆山市超聲儀器有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海申勝生物技術(shù)有限公司）。

1.1.2 藥物與試劑 柴胡皂苷c（批號(hào)：20191015）、柴胡皂苷a（批號(hào)：20190812）、柴胡皂苷d 對(duì)照品（批號(hào)：20190914），純度＞98%，均購(gòu)自寶雞市辰光生物科技有限公司，氨水（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），甲醇、乙腈（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），水為去離子水。

柴胡為傘形科植物柴胡（Bupleurum chinenseDC）或“狹葉”柴胡（B.scorzonerifoliumWi11d）的干燥根莖（購(gòu)自廣東康美藥業(yè)有限公司，批號(hào)20190418）。

1.2 方法

1.2.1 高效液相色譜條件 色譜柱：Agilent SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫（表1），流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD），進(jìn)樣量為10 μL。

表1 HPLC 梯度洗脫條件

1.2.2 樣品溶液的制備 精密稱(chēng)取柴胡藥材粉末（過(guò)2 目篩）1.0 g，置于150 mL 具塞錐形瓶中，加入體積比為10%的氨水-甲醇溶液25 mL，超聲提取45 min，過(guò)濾，用甲醇洗滌錐形瓶，在通風(fēng)櫥中62 ℃水浴揮干，殘?jiān)蛹状既芙?，定容? mL 容量瓶中。

1.2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取柴胡皂苷c、a、d 對(duì)照品9.52、10.14、15.28 mg，加甲醇適量使溶解，并定容至10 mL容量瓶中，得到含柴胡皂苷c、a、d分別為0.952、1.014、1.528 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

2.1.1 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取柴胡皂苷混合對(duì)照品溶液 2、5、8、10、12、15、20 μL 分別注入高效液相色譜儀，測(cè)定相應(yīng)條件下的峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并計(jì)算相對(duì)應(yīng)的回歸方程。精密吸取上述柴胡皂苷混合對(duì)照品稀釋液進(jìn)樣，測(cè)定其信號(hào)（以峰高計(jì)算）與噪聲比值，將S/N=3 時(shí)的濃度定為檢測(cè)限（LOD），將S/N=10 時(shí)的濃度定為定量限（LOQ）。各組分在各自的含量范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，結(jié)果如表2 所示。

表2 線(xiàn)性方程及線(xiàn)性范圍

2.1.2 精密度試驗(yàn) 精密稱(chēng)取中藥柴胡粉末1.0 g，按“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件以及流動(dòng)相條件進(jìn)樣，連續(xù)進(jìn)行6 次，并計(jì)算柴胡皂苷a 面積的RSD（%）、柴胡皂苷c面積的RSD（%）、柴胡皂苷d面積的RSD（%）。結(jié)果表明，柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d 的RSD分別為 1.27%、1.05% 和 0.58%，RSD均小于3.0%，表明所用液相色譜儀的精密度較好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別于在 0、2、4、8、12、24 h 按“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件以及流動(dòng)相條件進(jìn)樣，測(cè)定各供試品的峰面積。結(jié)果表明，柴胡中的柴胡皂苷a 峰面積的RSD為1.23%、柴胡皂苷c 峰面積的RSD為0.85%、柴胡皂苷d 峰面積的RSD為1.62%，均小于3.0%，說(shuō)明供試品在24 h 內(nèi)保持良好的穩(wěn)定性。

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取6 份柴胡藥材粉末（過(guò)2 目篩）1.0 g，測(cè)定柴胡中柴胡皂苷a、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d 的平均含量。結(jié)果表明，柴胡中柴胡皂苷c、柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 的平均含量分別為0.954、0.982、1.826 mg/g；柴胡中柴胡皂苷 a、柴胡皂苷c 和柴胡皂苷d 含量的RSD分別為2.08%、2.42%、1.54%，均小于3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取9 份柴胡藥材粉末0.5 g，分成低、中、高加樣組（0.5 g 藥材含量的80%、100%、120%加樣），每組分別加入混合對(duì)照品溶液（柴胡皂苷a、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d），計(jì)算柴胡低、中、高加樣組中的柴胡皂苷a、柴胡皂苷c 和柴胡皂苷d 的平均回收率及其RSD。從表3 可以看出，該方法準(zhǔn)確性良好。

表3 柴胡加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.1.6 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 精密吸取甲醇溶劑10 μL，注入液相色譜儀，按上述方法進(jìn)行測(cè)定，在測(cè)定時(shí)間內(nèi)沒(méi)有色譜峰出現(xiàn)，說(shuō)明甲醇溶劑不影響柴胡皂苷的測(cè)定，方法的專(zhuān)屬性良好，甲醇溶劑的色譜見(jiàn)圖1。

圖1 甲醇HPLC 色譜

精密吸取混合對(duì)照溶液1 mL，置于5 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度線(xiàn)，搖勻，分別精密吸取5和10 μL。結(jié)果表明，柴胡皂苷c、a、d 的保留時(shí)間分別為7.4、17.8、29.1 min（圖 2）。

圖2 柴胡皂苷混合對(duì)照品HPLC 色譜

2.2 柴胡樣品含量測(cè)定

精密稱(chēng)定3 份柴胡藥材粉末1.0 g 過(guò)2 目篩，按“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件以及流動(dòng)相條件進(jìn)樣，通過(guò)外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算柴胡皂苷c、柴胡皂苷a 和柴胡皂苷d 的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 柴胡樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 小結(jié)

本研究建立的高效液相色譜法測(cè)定柴胡中柴胡皂苷c、a、d 的含量操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、精密度好，3種柴胡皂苷的色譜峰和試樣中其他組分的色譜峰可達(dá)基線(xiàn)分離，且分離度、峰型較好，可以作為柴胡皂苷c、a、d 的含量測(cè)定方法。